ייצור מטריצה חוץ-תאית לבבית מפיברובלסטים אנושיים בוגרים לציפוי צלחת תרבית

Summary

פיברובלסטים שבודדו מהלב האנושי הבוגר תורבתו למפגש על צלחות מצופות ג'לטין כדי לייצר את המטריצה החוץ תאית הספציפית לשריר הלב. לאחר דה-צלולריזציה, מצע זה יכול לשמש לתרבית ומחקר של תאי לב אחרים ואינטראקציות בין תאים למטריצה.

Abstract

שריר הלב מורכב קרדיומיוציטים ומספר גדול עוד יותר של פיברובלסטים, האחרון אחראי על ייצור מטריצה חוץ-תאית. מהשלבים המוקדמים של התפתחות הלב לאורך החיים, הן בתנאים נורמליים והן בתנאים פתולוגיים, הרכב המטריצה החוץ תאית משתנה ומשפיע על מבנה שריר הלב ותפקודו. מטרת השיטה המתוארת כאן היא להשיג את המצע לתרבית תאי הלב במבחנה (המכונה ECM לבבי), המחקה את המטריצה החוץ תאית של שריר הלב in vivo. לשם כך, פיברובלסטים שבודדו מהלב האנושי הבוגר תורבתו למפגש על כלים מצופים ג'לטין כדי לייצר את המטריצה החוץ תאית הספציפית לשריר הלב. ההסרה שלאחר מכן של פיברובלסטים לבביים, תוך שמירה על ECM הלב שהושקע, יצרה את המצע לחקר ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית ספציפית לשריר הלב על תאים אחרים. חשוב לציין כי הרכב הציפוי הנגזר מפיברובלסטים של צלחת התרבית משתנה בהתאם לפעילות in vivo של הפיברובלסטים המבודדים מהלב, מה שמאפשר מחקרים עוקבים של אינטראקציות תא-מטריקס בתנאים נורמליים ופתולוגיים שונים.

Introduction

כל התאים ממוקמים in vivo במיקרו-סביבה מיוחדת שבה הם יכולים לשרוד ולבצע את תפקידיהם הספציפיים. בתוך כל רקמה נתונה, התאים מוקפים במטריצה חוץ-תאית המורכבת מחלבונים פיברילריים ולא פיברילריים, ומחומרים בסיסיים עשירים בגליקוזאמינוגליקנים¹. השינויים האיכותיים והכמותיים בתכולת המטריצה משפיעים על הביולוגיה של התא, ושולטים בתהליכים כגון התפשטות תאים, אפופטוזיס, הגירה או התמיינות. לפיכך, מושקעים מאמצים ביצירה מחדש של מיקרו-סביבה זו עבור מחקרי מבחנה של תאים מרקמות שונות ^2,3.

שריר הלב מורכב מקרדיומיוציטים ומכמות גדולה עוד יותר של פיברובלסטים הממלאים תפקיד קריטי בייצור ותחזוקה של המטריצה החוץ תאית בתוך שריר הלב⁴. במהלך החיים, הרכב המטריצה החוץ תאית יכול להשתנות בתגובה לגורמים נורמליים ופתולוגיים שונים. לשינויים אלה בהרכב המטריצה החוץ תאית יש השפעה משמעותית על המבנה והמאפיינים הביומכניים של שריר הלב⁵. בהתאם לכך, זה אמור להיות יתרון להבנת אינטראקציות תא-מטריצה בתוך שריר הלב האנושי אם המיקרו-סביבה הספציפית לגילאים שונים או לתנאים פתולוגיים שונים שוחזרה במבחנה ^6,7.

השיטה המתוארת כאן שואפת להשיג את המצע לתרבית תאי הלב במבחנה (המכונה ECM לבבי), המחקה את המטריצה החוץ תאית של שריר הלב in vivo.

מחקר לב וכלי דם מציב אתגרים ספציפיים, כולל הקושי להשיג דגימות מתורמים חיים או חולים וגידול תאי לב אנושיים⁸. השיטה המוצגת כאן מתמודדת עם אתגרים אלה בכך שהיא מאפשרת רכישה של פיברובלסטים לבביים אפילו מקטעים ביופטיים קטנים של שריר הלב האנושי וגידול תאי לב מבודדים במבחנה על המטריצה החוץ תאית הטבעית שלהם האופיינית לשריר הלב האנושי.

בעוד שהמאמצים הנוכחיים מתמקדים בפיתוח פיגומים תלת-ממדיים של פולימרים סינתטיים או טבעיים המחקים את התכונות הביומכניות של שריר הלב⁹ הרגיל, הם מתעלמים מהאינטראקציות והאיתות בין התא למטריצה המתרחשים בתנאים נורמליים ופתולוגיים כאחד. מכיוון ש- ECM הלב מסונתז על ידי פיברובלסטים לבביים הנגזרים מלב האדם, הרכבו נקבע על ידי פעילותם של תאים אלה, המשתנה בתגובה לתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים, ובכך מאפשר לחקור את השפעתו הספציפית על הביולוגיה של תאי הלב¹⁰.

הפרוטוקול הנוכחי תוכנן במיוחד עבור רקמת לב אנושית, אך הבסיס המדעי שלו צריך לחול גם על איברים אחרים, במיוחד אלה עם פוטנציאל התחדשות נמוך, פיברוזיס אינטנסיבי וצלקות המשפיעות על המבנה והתפקוד הכללי, כמו גם מספר דגימות וגדלים מוגבלים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

רקמות לב התקבלו מחולים עם אי ספיקת לב סופנית עקב קרדיופתיה איסכמית שעברו השתלת לב. כל הדגימות ששימשו לניסויים נאספו בהסכמת המטופל וללא מזהי מטופלים, בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת נאפולי פדריקו השני ובהתאם לעקרונות המפורטים בהצהרת הלסינקי. הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת הניסוי

1. הכינו כלים/מכשירים סטריליים: זוג מספריים כירורגיים אחד גדול, שני סטים של מלקחיים עדינים, שני זוגות מספריים מיקרודיסקטינג, בקבוק סטרילי בנפח 1 ליטר, בקבוק סטרילי בנפח 500 מ"ל ובקבוק סטרילי בנפח 250 מ"ל.
2. יש לחטא את משקפי הכיסוי בגודל 22 מ"מ על 22 מ"מ באתנול 70% למשך מספר שניות. שואפים את האתנול באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל, נותנים לכוסות הכיסוי להתייבש בתנור ב 37 מעלות צלזיוס, ולעקר אותם באוטוקלאב.
3. יש להמיס מלחי אבקה הזמינים מסחרית במים סטריליים בזיקוק כפול. בבקבוק סטרילי של 1 ליטר, הוסיפו 0.35 גרם אבקת סודיום ביקרבונט כדי להכין 1 ליטר של תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) ב-pH 7.4. יש לעקר את התמיסה באמצעות ממברנות מסנן 0.22 מיקרומטר מתחת למכסה מנוע סטרילי ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
4. שוקלים 0.1 גרם של אשלגן פוספט monobasic, 4.0 גרם של נתרן כלורי, 0.1 גרם של אשלגן כלורי, ו 0.575 גרם של נתרן פוספט dibasic כדי להכין 500 מ"ל של 1x פוספט buffered מלוחים (PBS). ממיסים את הרכיבים במים סטריליים בזיקוק כפול ולאחר מכן בודקים את ערך ה- pH (7.4). יש לעקר מתחת למכסה מנוע סטרילי על ידי סינון ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
5. הוסף 5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) ל 45 מ"ל של HBSS כדי להכין נפח סופי של 50 מ"ל של תמיסת עצירת טריפסין (TSS). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
6. למדוד 223.75 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 25 מ"ל של FBS (ריכוז סופי, 10%) ולהוסיף 1.25 מ"ל פניצילין ותמיסת סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקו, ריכוז סופי, 0.5%) כדי להכין DMEM לבידוד פיברובלסטים ולתרבית. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
7. הכינו תמיסת ג'לטין 0.2% (w/v) על ידי הוספת 0.2 גרם ג'לטין מאבקת עור חזיר ל-100 מ"ל PBS.
   הערה: הרכיבים והריכוזים המתאימים עבור כל תמיסה ששימשה במחקר מוצגים בטבלה 1.

2. תרבית פרימיטיבית של פיברובלסטים לבביים אנושיים על ידי צמיחה משברי שריר הלב פרוזדורים

הערות: שלבים 2.2-2.3 צריכים להתבצע בתנאים סטריליים. הפרוטוקול מאומת עבור דגימות פרוזדורים בקוטר של כ-0.3 ס"מ, המהווה ממד אופייני לדגימות ביופסיה ומאפשר בידוד של כ-2X10⁶ פיברובלסטים.

1. לשטוף את המדגם המתקבל טרי של אטריום בצלחת זכוכית 100 מ"מ עם HBSS סטרילי, בעדינות לנער אותו כדי להסיר את הדם. חזרו על שלב זה שלוש פעמים, החליפו HBSS ואת הצלחת בכל כביסה.
2. מניחים את הדגימה בצלחת 100 מ"מ שהורטבה בעבר בנפח קטן של HBSS וקוצצים דק עם אזמלים מוצלבים לכ-2 מ"מ קוביות.
3. מניחים ארבעה שברים קטנים של שריר הלב בצלחת של 35 מ"מ, קרובים מספיק כדי לשכב בערך בזוויות של זכוכית כיסוי בגודל 22 מ"מ x 22 מ"מ, מניחים את זכוכית הכיסוי הסטרילית מעל השברים, מפעילים לחץ עדין ומוסיפים 1.5 מ"ל DMEM.
4. לדגור על לוחות התרבית ב 37 ° C ב 5% CO₂ במשך כ -15 ימים או עד שהתאים מגיעים 85% מפגש, לבדוק מדי יום את הצמיחה של תאים במיקרוסקופ פאזה הפוכה ניגודיות ולשנות את מדיום התרבית כל 3 ימים.

3. תת-תרבות של פיברובלסטים לבביים אנושיים על ידי טריפסיניזציה חמה

הערות: השלבים המדווחים להלן חייבים להתבצע בתנאים סטריליים. מכיוון שהפיברובלסטים יכולים לנדוד מהרקמה הנטועה לאורך פני השטח של זכוכית הכיסוי וצלחת התרבית, מומלץ לעבד את שניהם עבור תת-התרבות הראשונה.

1. הרימו את זכוכית הכיסוי במלקחיים עדינות וסטריליות, הניחו אותה הפוכה בצלחת חדשה בקוטר 35 מ"מ ושטפו עם PBS סטרילי.
2. הסר שברי שריר הלב, השליך אותם ושטוף את צלחת 35 מ"מ עם תאים שגדלו עם PBS סטרילי.
3. יש להשליך את השטיפה ולהוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA (חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית) לכל צלחת. יש לדגור במשך 5 דקות ב-37°C עם 5% CO₂. אשר את ניתוק התא במיקרוסקופ. התאים צריכים להיות מעוגלים לחלוטין מנותקים, יצירת גושים קטנים.
4. חסום את הטריפסיניזציה על ידי הוספת 2 מ"ל TSS לכל צלחת 35 מ"מ ואסוף את המתלה לתוך צינור סטרילי של 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 400 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
5. שאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, השהו מחדש את הגלולה ב-3 מ"ל DMEM והכניסו את תרחיף התאים לצלחת בקוטר 60 מ"מ.
6. לדגור תאים כאלה המתקבלים בתת-תרבית 1 (או מעבר 1) ב 3 מ"ל של DMEM ב 37 ° C עם 5% CO₂, שינוי המדיום כל שלושה ימים עד התאים להגיע 75% מפגש.
7. תת-תרבית הפיברובלסטים שהגיעו למפגש של 75%, חזרה על טריפסיניזציה חמה ופיצול התאים ביחס 1:3 ללוחות חדשים בקוטר 60 מ"מ עד פעמיים (מעברים 2 ו-3).

4. תצהיר מטריצה חוץ-תאית

1. הכינו מנות מצופות ג'לטין על ידי הוספת 3 מ"ל של תמיסת ג'לטין סטרילית 0.2% לכל צלחת 60 מ"מ ודגרה ב 37 ° C במשך 2 שעות; לאחר מכן לשאוף את הפתרון ולהוסיף 3 מ"ל של PBS סטרילי עד לשימוש.
2. נתקו את הפיברובלסטים של הלב על ידי טריפסיניזציה חמה ותתרו אותם בצפיפות גבוהה (15 x 10,³ תאים לסמ"ר,²) על לוחות מצופים ג'לטין בקוטר 60 מ"מ.
3. תרבית את הפיברובלסטים במצב מפגש למשך עד 21 יום, מה שמאפשר סינתזת מטריצה חוץ-תאית ושקיעתה. החליפו 50% מהמדיום במדיום טרי כל 3 ימים.

5. דה-צלולריזציה של מטריצה חוץ-תאית

הערה: שלבים 5.3-5.4 צריכים להתבצע עם טלטול עדין כדי לעקור רק תאים מבלי לנתק את המטריצה החוץ תאית.

1. הכינו תמיסת דה-צלולריזציה המכילה 0.25% Triton X-100 ו-10 mM NH₄OH ב-PBS (חשב את הנפח הסופי, בהתחשב ב-1 מ"ל לכל צלחת של 60 מ"מ).
2. מוציאים את מדיום התרבית ושוטפים את הצלחות עם PBS. יש להשליך את השטיפה.
3. הוסף 1 מ"ל של תמיסת דה-צלולריזציה והתבונן בלוחות במיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך; לאחר 1-2 דקות, כאשר התאים כבר לא ניתן להבחין, להוסיף בעדינות 4 מ"ל של PBS כדי לדלל את תמיסת decellularization.
4. הסר את הפתרון המדולל ולשטוף בעדינות את הצלחות עם PBS; יש להשליך את השטיפה.
5. הוסף 1 מ"ל PBS ואחסן את הלוחות המצופים ECM ב 4 ° C עד לשימוש חדש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הצמיחה של פיברובלסטים מקטעים קטנים של שריר הלב המקומי שהונחו בתרבית נצפתה תוך 3-5 ימים (איור 1).

בימים שלאחר מכן, מספר הפיברובלסטים המשיך לגדול, אולי בשל צמיחה מתמשכת מדגימת רקמת הלב והתפשטות הפיברובלסטים הנודדים על פני המנה. אין לצפות כי כל ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפיברובלסטים שבודדו מדגימות לב אנושיות גודלו בתרבית למפגש במשך 21 יום כדי לסנתז ולהפקיד את המטריצה החוץ תאית, ויצרו שכבה מלוכדת הנצמדת היטב לפני השטח של צלחת התרבית. הסרה לאחר מכן של פיברובלסטים לבביים, תוך שמירה על ECM הלב שהושקע, יצרה את המצע לחקר ההשפעה של מטריצה חוץ-תאי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes