ייצור מטריצה חוץ-תאית לבבית מפיברובלסטים אנושיים בוגרים לציפוי צלחת תרבית

Summary

פיברובלסטים שבודדו מהלב האנושי הבוגר תורבתו למפגש על צלחות מצופות ג'לטין כדי לייצר את המטריצה החוץ תאית הספציפית לשריר הלב. לאחר דה-צלולריזציה, מצע זה יכול לשמש לתרבית ומחקר של תאי לב אחרים ואינטראקציות בין תאים למטריצה.

Abstract

שריר הלב מורכב קרדיומיוציטים ומספר גדול עוד יותר של פיברובלסטים, האחרון אחראי על ייצור מטריצה חוץ-תאית. מהשלבים המוקדמים של התפתחות הלב לאורך החיים, הן בתנאים נורמליים והן בתנאים פתולוגיים, הרכב המטריצה החוץ תאית משתנה ומשפיע על מבנה שריר הלב ותפקודו. מטרת השיטה המתוארת כאן היא להשיג את המצע לתרבית תאי הלב במבחנה (המכונה ECM לבבי), המחקה את המטריצה החוץ תאית של שריר הלב in vivo. לשם כך, פיברובלסטים שבודדו מהלב האנושי הבוגר תורבתו למפגש על כלים מצופים ג'לטין כדי לייצר את המטריצה החוץ תאית הספציפית לשריר הלב. ההסרה שלאחר מכן של פיברובלסטים לבביים, תוך שמירה על ECM הלב שהושקע, יצרה את המצע לחקר ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית ספציפית לשריר הלב על תאים אחרים. חשוב לציין כי הרכב הציפוי הנגזר מפיברובלסטים של צלחת התרבית משתנה בהתאם לפעילות in vivo של הפיברובלסטים המבודדים מהלב, מה שמאפשר מחקרים עוקבים של אינטראקציות תא-מטריקס בתנאים נורמליים ופתולוגיים שונים.

Introduction

כל התאים ממוקמים in vivo במיקרו-סביבה מיוחדת שבה הם יכולים לשרוד ולבצע את תפקידיהם הספציפיים. בתוך כל רקמה נתונה, התאים מוקפים במטריצה חוץ-תאית המורכבת מחלבונים פיברילריים ולא פיברילריים, ומחומרים בסיסיים עשירים בגליקוזאמינוגליקנים¹. השינויים האיכותיים והכמותיים בתכולת המטריצה משפיעים על הביולוגיה של התא, ושולטים בתהליכים כגון התפשטות תאים, אפופטוזיס, הגירה או התמיינות. לפיכך, מושקעים מאמצים ביצירה מחדש של מיקרו-סביבה זו עבור מחקרי מבחנה של תאים מרקמות שונות ^2,3.

שריר הלב מורכב מקרדיומיוציטים ומכמות גדולה עו....

Protocol

רקמות לב התקבלו מחולים עם אי ספיקת לב סופנית עקב קרדיופתיה איסכמית שעברו השתלת לב. כל הדגימות ששימשו לניסויים נאספו בהסכמת המטופל וללא מזהי מטופלים, בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת נאפולי פדריקו השני ובהתאם לעקרונות המפורטים בהצהרת הלסינקי. הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת הניסוי

1. הכינו כלים/מכשירים סטריליים: זוג מספריים כירורגיים אחד גדול, שני סטים של מלקחיים עדינים, שני זוגות מספריים מיקרודיסקטינג, בקבוק סטרילי בנפח 1 ליטר, בקבוק סטרילי בנפח 500 מ"ל ובקבוק סטרילי בנפח 250 מ"ל.
2. יש לחטא א....

תוצאות

הצמיחה של פיברובלסטים מקטעים קטנים של שריר הלב המקומי שהונחו בתרבית נצפתה תוך 3-5 ימים (איור 1).

בימים שלאחר מכן, מספר הפיברובלסטים המשיך לגדול, אולי בשל צמיחה מתמשכת מדגימת רקמת הלב והתפשטות הפיברובלסטים הנודדים על פני המנה. אין לצפות כי כל ?.......

Discussion

הפיברובלסטים שבודדו מדגימות לב אנושיות גודלו בתרבית למפגש במשך 21 יום כדי לסנתז ולהפקיד את המטריצה החוץ תאית, ויצרו שכבה מלוכדת הנצמדת היטב לפני השטח של צלחת התרבית. הסרה לאחר מכן של פיברובלסטים לבביים, תוך שמירה על ECM הלב שהושקע, יצרה את המצע לחקר ההשפעה של מטריצה חוץ-תאי?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes