Kültür Çanağı Kaplaması için Yetişkin İnsan Fibroblastlarından Kardiyak Hücre Dışı Matriks Üretimi

Özet

Yetişkin insan kalbinden izole edilen fibroblastlar, miyokarda özgü hücre dışı matrisi üretmek için jelatin kaplı tabaklar üzerinde birleşecek şekilde kültürlendi. Hücreden arındırmadan sonra, bu substrat diğer kardiyak hücrelerin ve hücre-matris etkileşimlerinin kültürü ve incelenmesi için kullanılabilir.

Özet

Miyokard, kardiyomiyositlerden ve daha fazla sayıda fibroblasttan oluşur, ikincisi hücre dışı matris üretiminden sorumludur. Yaşam boyu kalp gelişiminin erken aşamalarından itibaren, hem normal hem de patolojik koşullarda, hücre dışı matrisin bileşimi miyokard yapısını ve işlevini değiştirir ve etkiler. Burada tarif edilen yöntemin amacı, in vivo miyokardiyal hücre dışı matrisi taklit ederek in vitro (kardiyak ECM olarak adlandırılır) kardiyak hücrelerin kültürü için substratı elde etmektir. Bu amaçla, yetişkin insan kalbinden izole edilen fibroblastlar, miyokarda özgü hücre dışı matrisi üretmek için jelatin kaplı tabaklar üzerinde birleşecek şekilde kültürlendi. Kardiyak fibroblastların daha sonra çıkarılması, biriken kardiyak ECM'yi korurken, miyokard'a özgü hücre dışı matrisin diğer hücreler üzerindeki etkisini incelemek için substratı üretti. Daha da önemlisi, kültür kabının fibroblasttan türetilmiş kaplamasının bileşimi, kalpten izole edilen fibroblastların in vivo aktivitesine göre değişir ve farklı normal ve patolojik koşullarda hücre-matris etkileşimlerinin müteakip çalışmalarına izin verir.

Giriş

Tüm hücreler in vivo olarak hayatta kalabilecekleri ve belirli işlevlerini yerine getirebilecekleri özel bir mikro ortamda bulunur. Herhangi bir doku içinde hücreler, fibriller ve fibriller olmayan proteinlerden ve glikozaminoglikanlar açısından zengin temel maddelerden oluşan hücre dışı bir matris ile çevrilidir¹. Matris içeriğindeki kalitatif ve kantitatif değişiklikler, hücre çoğalması, apoptoz, göç veya farklılaşma gibi süreçleri kontrol ederek hücre biyolojisini etkiler. Bu nedenle, farklı dokulardan^hücrelerin in vitro çalışmaları için bu mikro ortamın yeniden yaratılmasına yönelik çabalar harcanmaktadır ^2,3.

Miyokard, kardiyomiyositlerden ve miyokard⁴ içindeki hücre dışı matrisin üretilmesinde ve korunmasında kritik bir rol oynayan daha da büyük miktarda fibroblasttan oluşur. Yaşam boyunca, hücre dışı matrisin bileşimi çeşitli normal ve patolojik faktörlere yanıt olarak değişebilir. Hücre dışı matriks bileşimindeki bu modifikasyonlar, miyokard^5'in yapısı ve biyomekanik özellikleri üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Buna göre, farklı yaşlara veya patolojik durumlara özgü mikroçevrenin in vitro^olarak yeniden üretilmesi, insan miyokardındaki hücre-matris etkileşimlerini anlamak için avantajlı olmalıdır ^6,7.

Burada tarif edilen yöntem, in vivo miyokardiyal hücre dışı matrisi taklit ederek in vitro (kardiyak ECM olarak adlandırılır) kardiyak hücrelerin kültürü için substratı elde etmeyi amaçlar.

Kardiyovasküler araştırmalar, canlı donörlerden veya hastalardan numune almanın ve insan kalp hücrelerinin kültürlenmesinin zorluğu da dahil olmak üzere belirli zorluklar ortaya koymaktadır⁸. Burada sunulan yöntem, insan miyokardının küçük bioptik parçalarından bile kardiyak fibroblastların elde edilmesini sağlayarak ve izole edilmiş kardiyak hücrelerin insan miyokardına özgü doğal hücre dışı matrisleri üzerinde in vitro olarak kültürlenmesini sağlayarak bu zorlukları ele almaktadır.

Mevcut çabalar, normal miyokard^9'un biyomekanik özelliklerini taklit eden biyofyapay sentetik veya doğal polimerlerin 3D iskelelerini geliştirmeye odaklanırken, hem normal hem de patolojik koşullarda meydana gelen hücre-matris etkileşimlerini ve sinyalleşmeyi gözden kaçırmaktadır. Kardiyak ECM, insan kalbinden türetilen kardiyak fibroblastlar tarafından sentezlendiğinden, bileşimi, çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullara yanıt olarak değişen bu hücrelerin aktivitesi tarafından belirlenir ve böylece kardiyak hücre biyolojisi üzerindeki spesifik etkisinin incelenmesine izin verir¹⁰.

Mevcut protokol insan kalp dokusu için özel olarak tasarlanmıştır, ancak bilimsel temeli diğer organlara, özellikle düşük rejenerasyon potansiyeli, yoğun fibroz ve genel yapı ve işlevi etkileyen yara izlerinin yanı sıra sınırlı numune sayıları ve boyutlarına sahip olanlar için de geçerli olmalıdır.

Protokol

İskemik kardiyopatiye bağlı son dönem kalp yetmezliği olan ve kalp nakli yapılan hastalardan kalp dokusu elde edildi. Deneyler için kullanılan tüm örnekler, Napoli Federico II Üniversitesi etik komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak ve Helsinki Bildirgesi'nde belirtilen ilkelere uygun olarak, hasta rızası ile ve hasta tanımlayıcıları olmadan toplandı. Çalışma için kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Deney hazırlığı

1. Steril aletler/aparatlar hazırlayın: Bir büyük çift cerrahi makas, iki set ince forseps, iki çift mikrodiseksiyon makası, 1 L steril şişe, 500 mL steril şişe ve 250 mL steril şişe.
2. 22 mm x 22 mm kapak camlarını %70 etanol ile birkaç saniye dezenfekte edin. Etanolü 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak aspire edin, kapak camlarını 37 °C'de fırında kurumaya bırakın ve bir otoklavda sterilize edin.
3. Piyasada bulunan toz tuzları steril çift damıtılmış suda çözün. 1 L'lik steril bir şişede, pH 7.4'te 1 L Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlamak için 0.35 g sodyum bikarbonat tozu ekleyin. Solüsyonu steril bir başlık altında 0,22 μm filtre membranları kullanarak sterilize edin ve kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.
4. 500 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlamak için 0.1 g potasyum fosfat monobazik, 4.0 g sodyum klorür, 0.1 g potasyum klorür ve 0.575 g sodyum fosfat dibazik tartın. Bileşenleri steril çift damıtılmış suda çözün ve ardından pH değerini (7.4) kontrol edin. Steril bir başlık altında süzülerek sterilize edin ve kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.
5. 50 mL tripsin durdurma çözeltisinin (TSS) nihai hacmini hazırlamak için 45 mL HBSS'ye 5 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
6. 25 mL FBS (nihai konsantrasyon,% 10) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamının (DMEM) 223.75 mL'sini ölçün ve DMEM'i fibroblast izolasyonu ve kültürü için hazırlamak için 1.25 mL penisilin ve streptomisin çözeltisi (kalem / strep, son konsantrasyon,% 0.5) ekleyin. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
7. Domuz derisi tozundan 100 mL PBS'ye 0,2 g jelatin ekleyerek% 0,2 (a/h) jelatin çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Çalışmada kullanılan her bir çözelti için bileşenler ve ilgili konsantrasyonlar Tablo 1'de verilmiştir.

2. Atriyal miyokard parçalarından büyüme yoluyla insan kardiyak fibroblastlarının ilkel kültürü

NOTLAR: Adım 2.2-2.3 steril koşullarda yapılmalıdır. Protokol, biyopsi örnekleri için tipik bir boyut olan ve yaklaşık 2 x 10⁶ fibroblastın izolasyonuna izin veren yaklaşık 0.3 cm çapındaki atriyal örnekler için valide edilmiştir.

1. Atriyumdan yeni elde edilen numuneyi steril HBSS ile 100 mm'lik bir cam plakada yıkayın ve kanı çıkarmak için hafifçe sallayın. Her yıkamada HBSS'yi ve plakayı değiştirerek bu adımı üç kez tekrarlayın.
2. Numuneyi daha önce küçük bir hacimde HBSS ile ıslatılmış 100 mm'lik bir plakaya yerleştirin ve çapraz neşterlerle yaklaşık 2 mm küpler halinde ince ince doğrayın.
3. Dört küçük miyokard parçasını 35 mm'lik bir plakaya, yaklaşık olarak 22 mm x 22 mm'lik bir kapak camının açılarında uzanacak kadar yakın yerleştirin, steril kapak camını parçaların üzerine yerleştirin, hafif basınç uygulayın ve 1.5 mL DMEM ekleyin.
4. Kültür plakalarını yaklaşık 15 gün boyunca veya% 85 birleşmeye ulaşana kadar% 5 CO₂ içinde 37 ° C'de inkübe edin, hücrelerin büyümesini günlük olarak ters çevrilmiş bir faz kontrast mikroskobunda kontrol edin ve kültür ortamını her 3 günde bir değiştirin.

3. Sıcak tripsinizasyon ile insan kardiyak fibroblastlarının alt kültürü

NOTLAR: Aşağıda bildirilen adımlar steril koşullarda gerçekleştirilmelidir. Fibroblastlar, ekilen dokudan kapak camı ve kültür plakasının yüzeyi boyunca göç edebildiğinden, her ikisinin de ilk alt kültür için işlenmesi önerilir.

1. Kapak camını ince, steril forsepslerle kaldırın, 35 mm'lik yeni bir plakaya baş aşağı yerleştirin ve steril PBS ile durulayın.
2. Miyokard parçalarını çıkarın, atın ve 35 mm'lik plakayı steril PBS ile büyümüş hücrelerle durulayın.
3. Durulamayı atın ve her plakaya 1 mL %0.25 tripsin-EDTA (Etilendiamintetraasetik asit) ekleyin. % 5 CO 2 ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe_edin. Mikroskopta hücre ayrılmasını onaylayın. Hücreler tamamen yuvarlanmalı ve ayrılmalı, küçük kümeler oluşturmalıdır.
4. Her 35 mm'lik plakaya 2 mL TSS ekleyerek tripsintasyonu bloke edin ve süspansiyonu steril 15 mL'lik bir tüpe toplayın, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
5. Süpernatanı 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak aspire edin, peleti 3 mL DMEM'de yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 60 mm'lik bir plakaya yerleştirin.
6. Elde edilen bu tür hücreleri, 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 3 mL DMEM'de alt kültür 1'de (veya pasaj 1'de) inkübe edin, hücreler% 75 birleşmeye ulaşana kadar ortamı her üç günde bir değiştirin.
7. % 75 birleşmeye ulaşan fibroblastları alt kültüre alın, sıcak tripsinizasyonu tekrarlayın ve hücreleri 1: 3 oranında iki defaya kadar yeni 60 mm'lik plakalara bölün (pasaj 2 ve 3).

4. Hücre dışı matris birikimi

1. Her 60 mm'lik plakaya 3 mL steril% 0.2 jelatin çözeltisi ekleyerek ve 37 ° C'de 2 saat inkübe ederek jelatin kaplı tabaklar hazırlayın; daha sonra çözeltiyi aspire edin ve kullanana kadar 3 mL steril PBS ekleyin.
2. Kardiyak fibroblastları ılık tripsinizasyon ile ayırın ve 60 mm jelatin kaplı plakalar üzerinde yüksek yoğunlukta (^cm2 başına 15 x^{10 3} hücre) alt kültüre alın.
3. Fibroblastları 21 güne kadar birleşik bir durumda kültürleyin, bu da hücre dışı matris sentezi ve birikimine izin verir. Ortamın %50'sini her 3 günde bir taze ortamla değiştirin.

5. Hücre dışı matris hücreden arındırma

NOT: Adım 5.3-5.4, hücre dışı matrisi ayırmadan sadece hücreleri yerinden çıkarmak için hafifçe çalkalayarak gerçekleştirilmelidir.

1. PBS'de %0.25 Triton X-100 ve 10 mM NH₄OH içeren bir hücre giderme solüsyonu hazırlayın (her 60 mm plaka için 1 mL dikkate alınarak nihai hacmi hesaplayın).
2. Kültür ortamını çıkarın ve plakaları PBS ile durulayın. Durulamayı atın.
3. 1 mL hücre giderme solüsyonu ekleyin ve plakaları ters çevrilmiş bir faz kontrast mikroskobunda gözlemleyin; 1-2 dakika sonra, hücreler artık fark edilemediğinde, hücre giderme solüsyonunu seyreltmek için nazikçe 4 mL PBS ekleyin.
4. Seyreltilmiş çözeltiyi çıkarın ve plakaları PBS ile nazikçe durulayın; Durulamayı atın.
5. 1 mL PBS ekleyin ve ECM kaplı plakaları daha fazla kullanana kadar 4 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Kültüre yerleştirilen küçük doğal miyokard parçalarından fibroblastların büyümesi 3-5 gün içinde gözlenmiştir (Şekil 1).

Sonraki günlerde, fibroblastların sayısı, muhtemelen kalp dokusu örneğinden sürekli büyüme ve çanak yüzeyinde göç etmiş fibroblastların çoğalması nedeniyle artmaya devam etti. Bir neşter ile mekanik ayrışma ile elde edilen tüm miyokard fragmanlarının aynı süre içinde a...

Tartışmalar

İnsan kalbi örneklerinden izole edilen fibroblastlar, hücre dışı matrisi sentezlemek ve biriktirmek için 21 gün boyunca birleşecek şekilde kültürlendi ve kültür plakasının yüzeyine sıkıca yapışan yapışkan bir tabaka oluşturdu. Kardiyak fibroblastların daha sonra çıkarılması, biriken kardiyak ECM'yi korurken, miyokarda özgü hücre dışı matrisin kardiyak doku içindeki diğer hücreler üzerindeki etkisini incelemek için substratı üretti.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes