Kültür Çanağı Kaplaması için Yetişkin İnsan Fibroblastlarından Kardiyak Hücre Dışı Matriks Üretimi

Özet

Yetişkin insan kalbinden izole edilen fibroblastlar, miyokarda özgü hücre dışı matrisi üretmek için jelatin kaplı tabaklar üzerinde birleşecek şekilde kültürlendi. Hücreden arındırmadan sonra, bu substrat diğer kardiyak hücrelerin ve hücre-matris etkileşimlerinin kültürü ve incelenmesi için kullanılabilir.

Özet

Miyokard, kardiyomiyositlerden ve daha fazla sayıda fibroblasttan oluşur, ikincisi hücre dışı matris üretiminden sorumludur. Yaşam boyu kalp gelişiminin erken aşamalarından itibaren, hem normal hem de patolojik koşullarda, hücre dışı matrisin bileşimi miyokard yapısını ve işlevini değiştirir ve etkiler. Burada tarif edilen yöntemin amacı, in vivo miyokardiyal hücre dışı matrisi taklit ederek in vitro (kardiyak ECM olarak adlandırılır) kardiyak hücrelerin kültürü için substratı elde etmektir. Bu amaçla, yetişkin insan kalbinden izole edilen fibroblastlar, miyokarda özgü hücre dışı matrisi üretmek için jelatin kaplı tabaklar üzerinde birleşecek şekilde kültürlendi. Kardiyak fibroblastların daha sonra çıkarılması, biriken kardiyak ECM'yi korurken, miyokard'a özgü hücre dışı matrisin diğer hücreler üzerindeki etkisini incelemek için substratı üretti. Daha da önemlisi, kültür kabının fibroblasttan türetilmiş kaplamasının bileşimi, kalpten izole edilen fibroblastların in vivo aktivitesine göre değişir ve farklı normal ve patolojik koşullarda hücre-matris etkileşimlerinin müteakip çalışmalarına izin verir.

Giriş

Tüm hücreler in vivo olarak hayatta kalabilecekleri ve belirli işlevlerini yerine getirebilecekleri özel bir mikro ortamda bulunur. Herhangi bir doku içinde hücreler, fibriller ve fibriller olmayan proteinlerden ve glikozaminoglikanlar açısından zengin temel maddelerden oluşan hücre dışı bir matris ile çevrilidir¹. Matris içeriğindeki kalitatif ve kantitatif değişiklikler, hücre çoğalması, apoptoz, göç veya farklılaşma gibi süreçleri kontrol ederek hücre biyolojisini etkiler. Bu nedenle, farklı dokulardan^hücrelerin in vitro çalışmaları için bu mikro ortamın yeniden yara....

Protokol

İskemik kardiyopatiye bağlı son dönem kalp yetmezliği olan ve kalp nakli yapılan hastalardan kalp dokusu elde edildi. Deneyler için kullanılan tüm örnekler, Napoli Federico II Üniversitesi etik komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak ve Helsinki Bildirgesi'nde belirtilen ilkelere uygun olarak, hasta rızası ile ve hasta tanımlayıcıları olmadan toplandı. Çalışma için kullanılan tüm reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Deney hazırlığı

1. Steril aletler/aparatlar hazırlayın: Bir büyük çift cerrahi makas, iki set inc....

Tartışmalar

İnsan kalbi örneklerinden izole edilen fibroblastlar, hücre dışı matrisi sentezlemek ve biriktirmek için 21 gün boyunca birleşecek şekilde kültürlendi ve kültür plakasının yüzeyine sıkıca yapışan yapışkan bir tabaka oluşturdu. Kardiyak fibroblastların daha sonra çıkarılması, biriken kardiyak ECM'yi korurken, miyokarda özgü hücre dışı matrisin kardiyak doku içindeki diğer hücreler üzerindeki etkisini incelemek için substratı üretti.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes