Herstellung von kardialer extrazellulärer Matrix aus adulten humanen Fibroblasten für die Beschichtung von Kulturschalen

Zusammenfassung

Fibroblasten, die aus dem erwachsenen menschlichen Herzen isoliert wurden, wurden auf gelatinebeschichteten Schalen kultiviert, um die Myokard-spezifische extrazelluläre Matrix zu produzieren. Nach der Dezellularisierung kann dieses Substrat für die Kultivierung und Untersuchung anderer Herzzellen und Zell-Matrix-Wechselwirkungen verwendet werden.

Zusammenfassung

Das Myokard setzt sich aus Kardiomyozyten und einer noch größeren Anzahl von Fibroblasten zusammen, wobei letztere für die Produktion der extrazellulären Matrix verantwortlich sind. Von den frühen Stadien der Herzentwicklung im Laufe des Lebens ändert sich die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen und beeinflusst die Struktur und Funktion des Myokards. Der Zweck des hier beschriebenen Verfahrens besteht darin, das Substrat für die Kultur von Herzzellen in vitro (kardiale EZM genannt) zu erhalten, wobei die myokardiale extrazelluläre Matrix in vivo nachgeahmt wird. Zu diesem Zweck wurden Fibroblasten, die aus dem erwachsenen menschlichen Herzen isoliert wurden, auf gelatinebeschichteten Schalen so kultiviert, dass sie zusammenfließen, um die Myokard-spezifische extrazelluläre Matrix zu produzieren. Die anschließende Entfernung von kardialen Fibroblasten unter Beibehaltung der abgelagerten kardialen EZM erzeugte das Substrat für die Untersuchung des Einflusses der myokardspezifischen extrazellulären Matrix auf andere Zellen. Wichtig ist, dass sich die Zusammensetzung der von Fibroblasten abgeleiteten Beschichtung der Kulturschale entsprechend der in vivo-Aktivität der aus dem Herzen isolierten Fibroblasten ändert, was nachfolgende Untersuchungen von Zell-Matrix-Wechselwirkungen unter verschiedenen normalen und pathologischen Bedingungen ermöglicht.

Einleitung

Alle Zellen befinden sich in vivo in einer spezialisierten Mikroumgebung, in der sie überleben und ihre spezifischen Funktionen erfüllen können. Innerhalb eines Gewebes sind die Zellen von einer extrazellulären Matrix umgeben, die aus fibrillären und nicht-fibrillären Proteinen und grundlegenden Substanzen besteht, die reich an Glykosaminoglykanen sind¹. Die qualitativen und quantitativen Veränderungen des Matrixgehalts beeinflussen die Zellbiologie und steuern Prozesse wie Zellproliferation, Apoptose, Migration oder Differenzierung. Daher werden Anstrengungen unternommen, um diese Mikroumgebung für In-vitro-Studien an Zellen aus verschiedenen Geweben nachzubilden ^2,3.

Das Myokard besteht aus Kardiomyozyten und einer noch größeren Menge an Fibroblasten, die eine entscheidende Rolle bei der Produktion und Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix im Myokard spielen⁴. Im Laufe des Lebens kann sich die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix als Reaktion auf verschiedene normale und pathologische Faktoren ändern. Diese Modifikationen in der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix haben einen signifikanten Einfluss auf die Struktur und die biomechanischen Eigenschaften des Myokards⁵. Dementsprechend sollte es für das Verständnis von Zell-Matrix-Wechselwirkungen innerhalb des menschlichen Myokards von Vorteil sein, wenn die Mikroumgebung, die für verschiedene Altersgruppen oder pathologische Zustände spezifisch ist, in vitro nachgebildet wird ^6,7.

Das hier beschriebene Verfahren zielt darauf ab, das Substrat für die Kultur von Herzzellen in vitro (kardiale EZM genannt) zu erhalten, wobei die myokardiale extrazelluläre Matrix in vivo nachgeahmt wird.

Die kardiovaskuläre Forschung stellt besondere Herausforderungen dar, darunter die Schwierigkeit, Proben von Lebendspendern oder Patienten zu gewinnen und menschliche Herzzellen zu kultivieren⁸. Die hier vorgestellte Methode adressiert diese Herausforderungen, indem sie die Gewinnung von kardialen Fibroblasten auch aus kleinen bioptischen Fragmenten des menschlichen Myokards ermöglicht und die Kultivierung isolierter Herzzellen in vitro auf ihrer nativen extrazellulären Matrix, die für das humane Myokard typisch ist, ermöglicht.

Während sich die derzeitigen Bemühungen auf die Entwicklung von 3D-Gerüsten aus biokünstlichen synthetischen oder natürlichen Polymeren konzentrieren, die die biomechanischen Eigenschaften des normalen Myokards⁹ nachahmen, übersehen sie die Zell-Matrix-Wechselwirkungen und Signalwege, die sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen auftreten. Da die kardiale EZM von kardialen Fibroblasten synthetisiert wird, die aus dem menschlichen Herzen stammen, wird ihre Zusammensetzung durch die Aktivität dieser Zellen bestimmt, die sich als Reaktion auf verschiedene physiologische und pathologische Bedingungen ändert, was die Untersuchung ihres spezifischen Einflusses auf die kardiale Zellbiologie ermöglicht¹⁰.

Das derzeitige Protokoll wurde speziell für menschliches Herzgewebe entwickelt, aber seine wissenschaftliche Grundlage sollte auch für andere Organe gelten, insbesondere für solche mit geringem Regenerationspotenzial, intensiver Fibrose und Narbenbildung, die die Gesamtstruktur und -funktion beeinflussen, sowie begrenzten Probenzahlen und -größen.

Protokoll

Herzgewebe wurde von Patienten mit Herzinsuffizienz im Endstadium aufgrund einer ischämischen Kardiopathie gewonnen, die sich einer Herztransplantation unterzogen. Alle Proben, die für die Experimente verwendet wurden, wurden mit Zustimmung des Patienten und ohne Patientenidentifikatoren gemäß den von der Ethikkommission der Universität Neapel Federico II genehmigten Protokollen und in Übereinstimmung mit den in der Erklärung von Helsinki dargelegten Grundsätzen entnommen. Die Einzelheiten zu allen für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung des Experiments

1. Bereiten Sie sterile Werkzeuge/Geräte vor: Eine große chirurgische Schere, zwei Sätze feine Pinzetten, zwei Paar Mikrodisparierscheren, eine sterile 1-Liter-Flasche, eine sterile 500-ml-Flasche und eine sterile 250-ml-Flasche.
2. Desinfizieren Sie die 22 mm x 22 mm großen Deckgläser einige Sekunden lang mit 70 % Ethanol. Aspirieren Sie das Ethanol mit einer serologischen 10-ml-Pipette, lassen Sie die Deckgläser im Ofen bei 37 °C trocknen und sterilisieren Sie sie im Autoklaven.
3. Lösen Sie handelsübliche Salzpulver in sterilem doppelt destilliertem Wasser auf. In einer sterilen 1-Liter-Flasche 0,35 g Natriumbicarbonatpulver hinzufügen, um 1 l Hank's ausgewogene Salzlösung (HBSS) bei einem pH-Wert von 7,4 herzustellen. Die Lösung mit 0,22 μm Filtermembranen unter einer sterilen Haube sterilisieren und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
4. Wiegen Sie 0,1 g monobasisches Kaliumphosphat, 4,0 g Natriumchlorid, 0,1 g Kaliumchlorid und 0,575 g zweibasisches Natriumphosphat, um 500 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) herzustellen. Die Bestandteile in sterilem doppelt destilliertem Wasser auflösen und anschließend den pH-Wert (7,4) prüfen. Unter einer sterilen Haube durch Filtration sterilisieren und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
5. Fügen Sie 5 ml fötales Rinderserum (FBS) zu 45 ml HBSS hinzu, um ein Endvolumen von 50 ml Trypsin-Stopp-Lösung (TSS) herzustellen. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
6. Messen Sie 223,75 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 25 ml FBS (Endkonzentration, 10 %) und fügen Sie 1,25 ml Penicillin und Streptomycin-Lösung (Pen/Streptokokken, Endkonzentration, 0,5 %) hinzu, um DMEM für die Isolierung und Kultur von Fibroblasten vorzubereiten. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
7. Bereiten Sie 0,2 % (w/v) Gelatinelösung vor, indem Sie 0,2 g Gelatine aus Schweinehautpulver zu 100 ml PBS hinzufügen.
   HINWEIS: Die Bestandteile und die jeweiligen Konzentrationen für jede in der Studie verwendete Lösung sind in Tabelle 1 aufgeführt.

2. Primitive Kultivierung humaner kardialer Fibroblasten durch Auswuchs aus atrialen Myokardfragmenten

HINWEISE: Die Schritte 2.2-2.3 sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Das Protokoll ist für Vorhofproben mit einem Durchmesser von ca. 0,3 cm validiert, was eine typische Größe für Biopsieproben darstellt und die Isolierung von ca. 2 x 10⁶ Fibroblasten ermöglicht.

1. Waschen Sie die frisch gewonnene Probe des Vorhofs in einer 100 mm Glasplatte mit sterilem HBSS und schütteln Sie sie leicht, um das Blut zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal und wechseln Sie den HBSS und die Platte bei jedem Waschgang.
2. Die Probe wird in eine 100-mm-Platte gegeben, die zuvor mit einem kleinen Volumen HBSS benetzt wurde, und mit gekreuzten Skalpellen in etwa 2 mm große Würfel zerkleinert.
3. Legen Sie vier kleine Myokardfragmente in eine 35-mm-Platte, die nahe genug ist, um ungefähr im Winkel eines 22 mm x 22 mm großen Deckglases zu liegen, legen Sie das sterile Deckglas über die Fragmente, üben Sie leichten Druck aus und fügen Sie 1,5 ml DMEM hinzu.
4. Die Kulturplatten werden bei 37 °C in 5 % CO₂ für etwa 15 Tage oder bis zum Erreichen von 85 % Konfluenz inkubiert, wobei das Wachstum der Zellen täglich an einem inversen Phasenkontrastmikroskop überprüft und das Kulturmedium alle 3 Tage gewechselt wird.

3. Subkultur humaner kardialer Fibroblasten durch warme Trypsinisierung

HINWEISE: Die unten aufgeführten Schritte müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Da die Fibroblasten aus dem explantierten Gewebe entlang der Oberfläche des Deckglases und der Kulturplatte wandern können, wird empfohlen, beide für die erste Subkultur zu verarbeiten.

1. Heben Sie das Deckglas mit einer feinen, sterilen Pinzette an, legen Sie es kopfüber in eine neue 35-mm-Platte und spülen Sie es mit sterilem PBS ab.
2. Entfernen Sie Myokardfragmente, entsorgen Sie sie und spülen Sie die 35-mm-Platte mit herausgewachsenen Zellen mit sterilem PBS.
3. Entsorgen Sie die Spülung und geben Sie 1 ml 0,25 % Trypsin-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) in jede Platte. 5 min bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren. Bestätigen Sie die Zellablösung am Mikroskop. Die Zellen sollten vollständig abgerundet und abgelöst sein, so dass sich kleine Klumpen bilden.
4. Blockieren Sie die Trypsinisierung, indem Sie 2 mL TSS zu jeder 35-mm-Platte hinzufügen und die Suspension in ein steriles 15-ml-Röhrchen auffüllen, zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
5. Aspirieren Sie den Überstand mit einer serologischen 5-ml-Pipette, resuspendieren Sie das Pellet in 3 mL DMEM und geben Sie die Zellsuspension in eine 60-mm-Platte.
6. Die gewonnenen Zellen werden in Subkultur 1 (oder Passage 1) in 3 ml DMEM bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert, wobei das Medium alle drei Tage gewechselt wird, bis die Zellen eine Konfluenz von 75 % erreichen.
7. Subkultur der Fibroblasten, die eine Konfluenz von 75 % erreichten, wiederholte die warme Trypsinisierung und spaltete die Zellen 1:3 in neue 60-mm-Platten bis zu zweimal (Passagen 2 und 3).

4. Ablagerung der extrazellulären Matrix

1. Mit Gelatine überzogene Gerichte zubereiten, indem 3 ml sterile 0,2%ige Gelatinelösung auf jede 60-mm-Platte gegeben und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert werden. Aspirieren Sie dann die Lösung und fügen Sie bis zur Verwendung 3 ml steriles PBS hinzu.
2. Die kardialen Fibroblasten werden durch Warmtrypsinisierung abgelöst und bei hoher Dichte (15 x 10³ Zellen pro^cm2) auf 60 mm gelatinebeschichteten Platten subkultiviert.
3. Kultivieren Sie die Fibroblasten bis zu 21 Tage lang in einem konfluenten Zustand, was die Synthese und Ablagerung der extrazellulären Matrix ermöglicht. Ersetzen Sie alle 3 Tage 50 % des Mediums durch frisches Medium.

5. Dezellularisierung der extrazellulären Matrix

HINWEIS: Die Schritte 5.3-5.4 sollten unter leichtem Schütteln durchgeführt werden, um nur Zellen zu entfernen, ohne die extrazelluläre Matrix abzulösen.

1. Bereiten Sie eine Dezellularisierungslösung vor, die 0,25 % Triton X-100 und 10 mM NH₄OH in PBS enthält (berechnen Sie das endgültige Volumen unter Berücksichtigung von 1 ml pro 60-mm-Platte).
2. Entfernen Sie das Nährmedium und spülen Sie die Platten mit PBS aus. Entsorgen Sie die Spülung.
3. Fügen Sie 1 ml Dezellularisierungslösung hinzu und beobachten Sie die Platten an einem inversen Phasenkontrastmikroskop. nach 1-2 Minuten, wenn die Zellen nicht mehr erkennbar sind, fügen Sie vorsichtig 4 ml PBS hinzu, um die Dezellularisierungslösung zu verdünnen.
4. Entfernen Sie die verdünnte Lösung und spülen Sie die Platten vorsichtig mit PBS aus. Entsorgen Sie die Spülung.
5. Fügen Sie 1 mL PBS hinzu und lagern Sie die ECM-beschichteten Platten bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.

Ergebnisse

Das Auswachsen von Fibroblasten aus den kleinen Fragmenten des nativen Myokards, die in Kultur gebracht wurden, wurde innerhalb von 3-5 Tagen beobachtet (Abbildung 1).

In den folgenden Tagen stieg die Anzahl der Fibroblasten weiter an, möglicherweise aufgrund des anhaltenden Auswachsens aus der Herzgewebeprobe und der Vermehrung migrierter Fibroblasten auf der Oberfläche der Schale. Es sollte nicht erwartet werden, dass alle Myo...

Diskussion

Die aus menschlichen Herzproben isolierten Fibroblasten wurden 21 Tage lang bis zur Konfluenz kultiviert, um die extrazelluläre Matrix zu synthetisieren und abzulagern, wodurch eine kohäsive Schicht gebildet wird, die fest an der Oberfläche der Kulturplatte haftet. Die anschließende Entfernung von kardialen Fibroblasten unter Beibehaltung der abgelagerten kardialen EZM erzeugte das Substrat für die Untersuchung des Einflusses der myokardspezifischen extrazellulären Matrix auf ander...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes