Herstellung von kardialer extrazellulärer Matrix aus adulten humanen Fibroblasten für die Beschichtung von Kulturschalen

Zusammenfassung

Fibroblasten, die aus dem erwachsenen menschlichen Herzen isoliert wurden, wurden auf gelatinebeschichteten Schalen kultiviert, um die Myokard-spezifische extrazelluläre Matrix zu produzieren. Nach der Dezellularisierung kann dieses Substrat für die Kultivierung und Untersuchung anderer Herzzellen und Zell-Matrix-Wechselwirkungen verwendet werden.

Zusammenfassung

Das Myokard setzt sich aus Kardiomyozyten und einer noch größeren Anzahl von Fibroblasten zusammen, wobei letztere für die Produktion der extrazellulären Matrix verantwortlich sind. Von den frühen Stadien der Herzentwicklung im Laufe des Lebens ändert sich die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen und beeinflusst die Struktur und Funktion des Myokards. Der Zweck des hier beschriebenen Verfahrens besteht darin, das Substrat für die Kultur von Herzzellen in vitro (kardiale EZM genannt) zu erhalten, wobei die myokardiale extrazelluläre Matrix in vivo nachgeahmt wird. Zu diesem Zweck wurden Fibroblasten, die aus dem erwachsenen menschlichen Herzen isoliert wurden, auf gelatinebeschichteten Schalen so kultiviert, dass sie zusammenfließen, um die Myokard-spezifische extrazelluläre Matrix zu produzieren. Die anschließende Entfernung von kardialen Fibroblasten unter Beibehaltung der abgelagerten kardialen EZM erzeugte das Substrat für die Untersuchung des Einflusses der myokardspezifischen extrazellulären Matrix auf andere Zellen. Wichtig ist, dass sich die Zusammensetzung der von Fibroblasten abgeleiteten Beschichtung der Kulturschale entsprechend der in vivo-Aktivität der aus dem Herzen isolierten Fibroblasten ändert, was nachfolgende Untersuchungen von Zell-Matrix-Wechselwirkungen unter verschiedenen normalen und pathologischen Bedingungen ermöglicht.

Einleitung

Alle Zellen befinden sich in vivo in einer spezialisierten Mikroumgebung, in der sie überleben und ihre spezifischen Funktionen erfüllen können. Innerhalb eines Gewebes sind die Zellen von einer extrazellulären Matrix umgeben, die aus fibrillären und nicht-fibrillären Proteinen und grundlegenden Substanzen besteht, die reich an Glykosaminoglykanen sind¹. Die qualitativen und quantitativen Veränderungen des Matrixgehalts beeinflussen die Zellbiologie und steuern Prozesse wie Zellproliferation, Apoptose, Migration oder Differenzierung. Daher werden Anstrengungen unternommen, um diese Mikroumgebung für

Protokoll

Herzgewebe wurde von Patienten mit Herzinsuffizienz im Endstadium aufgrund einer ischämischen Kardiopathie gewonnen, die sich einer Herztransplantation unterzogen. Alle Proben, die für die Experimente verwendet wurden, wurden mit Zustimmung des Patienten und ohne Patientenidentifikatoren gemäß den von der Ethikkommission der Universität Neapel Federico II genehmigten Protokollen und in Übereinstimmung mit den in der Erklärung von Helsinki dargelegten Grundsätzen entnommen. Die Einzelheiten zu allen für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Diskussion

Die aus menschlichen Herzproben isolierten Fibroblasten wurden 21 Tage lang bis zur Konfluenz kultiviert, um die extrazelluläre Matrix zu synthetisieren und abzulagern, wodurch eine kohäsive Schicht gebildet wird, die fest an der Oberfläche der Kulturplatte haftet. Die anschließende Entfernung von kardialen Fibroblasten unter Beibehaltung der abgelagerten kardialen EZM erzeugte das Substrat für die Untersuchung des Einflusses der myokardspezifischen extrazellulären Matrix auf ander.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes