Получение сердечного внеклеточного матрикса из фибробластов взрослого человека для покрытия культуральных чашек

Резюме

Фибробласты, выделенные из сердца взрослого человека, культивировали для слияния на посудах, покрытых желатином, для получения специфичного для миокарда внеклеточного матрикса. После децеллюляризации этот субстрат может быть использован для культивирования и изучения других сердечных клеток и клеточно-матриксных взаимодействий.

Аннотация

Миокард состоит из кардиомиоцитов и еще большего количества фибробластов, последние отвечают за продукцию внеклеточного матрикса. С ранних стадий развития сердца на протяжении всей жизни, как в норме, так и при патологии, состав внеклеточного матрикса изменяется и влияет на структуру и функцию миокарда. Целью описанного здесь метода является получение субстрата для культивирования сердечных клеток in vitro (называемого сердечной ВКМ), имитирующего внеклеточный матрикс миокарда in vivo. С этой целью фибробласты, выделенные из сердца взрослого человека, культивировали до слияния на посудах, покрытых желатином, для получения специфичного для миокарда внеклеточного матрикса. Последующее удаление сердечных фибробластов с сохранением отложенной сердечной ВКМ позволило получить субстрат для изучения влияния миокард-специфичного внеклеточного матрикса на другие клетки. Важно отметить, что состав фибробластного покрытия чашки для культуры изменяется в зависимости от активности in vivo фибробластов, выделенных из сердца, что позволяет впоследствии изучать клеточно-матриксные взаимодействия в различных нормальных и патологических условиях.

Введение

Все клетки расположены in vivo в специализированной микросреде, в которой они могут выживать и выполнять свои специфические функции. В любой ткани клетки окружены внеклеточным матриксом, состоящим из фибриллярных и нефибриллярных белков, а также основных веществ, богатых гликозаминогликанами^. Качественные и количественные изменения в составе матрицы влияют на клеточную биологию, контролируя такие процессы, как пролиферация клеток, апоптоз, миграция или дифференцировка. Следовательно, усилия направлены на воссоздание этого микроокружения для исследований in vitro клеток из различных тканей ^2,3.

Миокард состоит из кардиомиоцитов и еще большего количества фибробластов, которые играют решающую роль в производстве и поддержании внеклеточного матрикса в миокарде⁴. На протяжении всей жизни состав внеклеточного матрикса может изменяться в ответ на различные нормальные и патологические факторы. Эти изменения в составе внеклеточного матрикса оказывают существенное влияние на структуру и биомеханические характеристики миокарда⁵. Соответственно, для понимания клеточно-матриксных взаимодействий в миокарде человека должно быть полезно, если микроокружение, специфичное для разных возрастов или патологических состояний, воспроизводилось in vitro ^6,7.

Описанный здесь метод направлен на получение субстрата для культивирования сердечных клеток in vitro (так называемая сердечная ВКМ), имитирующей внеклеточный матрикс миокарда in vivo.

Исследования в области сердечно-сосудистых заболеваний сопряжены с определенными проблемами, в том числе с трудностями в получении образцов от живых доноров или пациентов и культивировании сердечных клеток человека⁸. Представленный здесь метод решает эти проблемы, позволяя получать сердечные фибробласты даже из небольших биоптических фрагментов миокарда человека и культивировать изолированные сердечные клетки in vitro на их нативном внеклеточном матриксе, типичном для миокарда человека.

В то время как текущие усилия сосредоточены на разработке 3D-каркасов биоискусственных синтетических или природных полимеров, которые имитируют биомеханические свойства нормального миокарда⁹, они упускают из виду клеточные матриксные взаимодействия и передачу сигналов, которые происходят как в нормальных, так и в патологических условиях. Поскольку сердечная ВКМ синтезируется сердечными фибробластами, полученными из сердца человека, ее состав определяется активностью этих клеток, которая изменяется в ответ на различные физиологические и патологические состояния, что позволяет изучить ее специфическое влияние на биологию сердечных^{клеток10}.

Текущий протокол был специально разработан для сердечной ткани человека, но его научная основа также должна применяться к другим органам, особенно к тем, которые имеют низкий потенциал регенерации, интенсивный фиброз и рубцевание, влияющие на общую структуру и функцию, а также ограниченное количество и размеры образцов.

протокол

Сердечные ткани были получены от пациентов с терминальной стадией сердечной недостаточности из-за ишемической кардиопатии, которым проводилась трансплантация сердца. Все образцы, использованные для экспериментов, были собраны с согласия пациента и без его идентификаторов, в соответствии с протоколами, утвержденными этическим комитетом Неаполитанского университета имени Федерико II, и в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации. Подробная информация обо всех реактивах и оборудовании, использованных для исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка к эксперименту

1. Подготовьте стерильные инструменты/аппараты: одну большую пару хирургических ножниц, два набора тонких щипцов, две пары ножниц для микропрепарирования, стерильную бутылку объемом 1 л, стерильную бутылку объемом 500 мл и стерильную бутылку объемом 250 мл.
2. Продезинфицируйте защитные стекла размером 22 мм x 22 мм с помощью этанола 70% в течение нескольких секунд. Отсадите этанол с помощью серологической пипетки объемом 10 мл, дайте защитным стеклам высохнуть в духовке при температуре 37 °C и простерилизуйте их в автоклаве.
3. Растворите имеющиеся в продаже порошкообразные соли в стерильной воде двойной дистилляции. В стерильную бутылку объемом 1 л добавьте 0,35 г порошка бикарбоната натрия для приготовления 1 л сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS) при pH 7,4. Стерилизовать раствор с помощью фильтрующих мембран толщиной 0,22 мкм под стерильным колпаком и хранить при температуре 4 °C до использования.
4. Взвесьте 0,1 г одноосновного фосфата калия, 4,0 г хлорида натрия, 0,1 г хлорида калия и 0,575 г двухосновного фосфата для приготовления 500 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS). Растворите компоненты в стерильной воде двойной дистилляции, а затем проверьте значение pH (7,4). Стерилизовать под стерильным колпаком с помощью фильтрации и хранить при температуре 4 °C до использования.
5. Добавьте 5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 45 мл HBSS, чтобы получить окончательный объем из 50 мл раствора для остановки трипсина (TSS). Хранить при температуре 4 °C до использования.
6. Отмерьте 223,75 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle medium (DMEM) с добавлением 25 мл FBS (конечная концентрация, 10%) и добавьте по 1,25 мл пенициллина и раствора стрептомицина (pen/strep, конечная концентрация, 0,5%) для получения DMEM для выделения и культивирования фибробластов. Хранить при температуре 4 °C до использования.
7. Приготовьте 0,2% (масс./об.) раствор желатина, добавив 0,2 г желатина из порошка свиной кожи на 100 мл PBS.
   Примечание: Компоненты и соответствующие концентрации для каждого раствора, используемого в исследовании, приведены в таблице 1.

2. Примитивное культивирование сердечных фибробластов человека методом вырастания из фрагментов миокарда предсердий

ПРИМЕЧАНИЯ: Шаги 2.2-2.3 следует выполнять в стерильных условиях. Протокол валидирован для образцов предсердий диаметром около 0,3 см, что является типичным размером для образцов биопсии и позволяет выделить примерно 2 x 10⁶ фибробластов.

1. Свежеполученный образец атриума промойте в стеклянной пластине диаметром 100 мм стерильным HBSS, аккуратно встряхивая его для удаления крови. Повторите этот шаг три раза, меняя HBSS и тарелку при каждой стирке.
2. Поместите образец в предварительно смоченную небольшим объемом HBSS пластину диаметром 100 мм и мелко нарежьте скрещенными скальпелями примерно до 2 мм кубиками.
3. Поместите четыре небольших фрагмента миокарда в пластину диаметром 35 мм, достаточно близко, чтобы она лежала примерно под углами покровного стекла размером 22 мм x 22 мм, поместите стерильное покровное стекло поверх фрагментов, слегка надавите и добавьте 1,5 мл DMEM.
4. Инкубируйте культуральные планшеты при 37 °C в 5%_CO2 в течение примерно 15 дней или до тех пор, пока клетки не достигнут 85% конфлюенции, ежедневно проверяя рост клеток в инвертированный фазово-контрастный микроскоп и меняя питательную среду каждые 3 дня.

3. Субкультивирование сердечных фибробластов человека методом теплой трипсинизации

ПРИМЕЧАНИЯ: Описанные ниже шаги должны выполняться в стерильных условиях. Поскольку фибробласты могут мигрировать из эксплантированной ткани по поверхности покровного стекла и культуральной пластины, рекомендуется обрабатывать обе субкультуры для первой субкультуры.

1. Поднимите покровное стекло с помощью тонких стерильных щипцов, поместите его вверх дном в новую пластину диаметром 35 мм и промойте стерильным PBS.
2. Удалите фрагменты миокарда, выбросьте их, а пластину 35 мм с переросшими клетками промойте стерильным ПБС.
3. Выбросьте полоскатель и добавьте по 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в каждую пластину. Инкубировать в течение 5 минут при 37 °C с 5% CO₂. Подтвердите отслойку клеток под микроскопом. Ячейки должны быть полностью округлены вверх и отделены, образуя небольшие комочки.
4. Блокируйте трипсинизацию, добавляя 2 мл TSS в каждую 35-миллиметровую пластину, и соберите суспензию в стерильную пробирку объемом 15 мл, центрифугируйте при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C.
5. Отсадите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки объемом 5 мл, ресуспендируйте гранулу в 3 мл DMEM и поместите клеточную суспензию в пластину диаметром 60 мм.
6. Такие полученные клетки инкубируют в субкультуре 1 (или пассаже 1) в 3 мл DMEM при 37 °С с 5%_СО2, меняя среду каждые три дня до тех пор, пока клетки не достигнут 75% конфлюенции.
7. Субкультивируют фибробласты, достигшие 75% конфлюенции, повторяя теплую трипсинизацию и расщепляя клетки 1:3 на новые 60 мм пластины до двух раз (пассажи 2 и 3).

4. Отложение внеклеточного матрикса

1. Приготовьте посуду, покрытую желатиновой оболочкой, добавив 3 мл стерильного 0,2% раствора желатина на каждую 60-миллиметровую пластину и инкубируя при 37 °C в течение 2 ч; Затем отсадите раствор и добавьте 3 мл стерильного PBS до использования.
2. Отделяют сердечные фибробласты методом теплой трипсинизации и субкультивируют их с высокой плотностью (15 х 10,³ клетки на^см2) на пластинах, покрытых желатином толщиной 60 мм.
3. Культивируйте фибробласты в сливающемся состоянии в течение 21 дня, что позволяет синтезировать и осаждать внеклеточный матрикс. Заменяйте 50% среды свежей средой каждые 3 дня.

5. Децеллюляризация внеклеточного матрикса

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 5.3-5.4 следует выполнять с легким встряхиванием, чтобы вытеснить только клетки без отрыва внеклеточного матрикса.

1. Приготовьте раствор для децеллюляризации, содержащий 0,25% Triton X-100 и 10 мМ NH₄OH в PBS (рассчитайте конечный объем, учитывая 1 мл на каждые 60 мм пластины).
2. Удалите питательную среду и промойте пластины PBS. Выбросьте полоскание.
3. Добавьте 1 мл раствора для децеллюляризации и понаблюдайте за пластинами в инвертированный фазово-контрастный микроскоп; через 1-2 минуты, когда клетки перестанут быть различимы, осторожно добавьте 4 мл PBS для разбавления раствора для децеллюляризации.
4. Удалите разведенный раствор и аккуратно промойте пластины PBS; Выбросьте полоскание.
5. Добавьте 1 мл PBS и храните пластины с покрытием ECM при температуре 4 °C до дальнейшего использования.

Результаты

Отрастание фибробластов из небольших фрагментов нативного миокарда, помещенных в культуру, наблюдалось в течение 3-5 дней (рис. 1).

В последующие дни количество фибробластов продолжало увеличиваться, возможно, из-за устойчивого роста из о...

Обсуждение

Фибробласты, выделенные из образцов сердца человека, культивировали до слияния в течение 21 дня для синтеза и депонирования внеклеточного матрикса, образуя когезивный слой, прочно прилегающий к поверхности культуральной пластины. Последующее удаление сердечных фибр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes