טכנולוגיית 2D-HPLC-MS בשילוב רשת מולקולרית לזיהוי רכיבים ברפואה הטיבטית מטוטלת אקוניטום

Summary

מחקר זה משתמש בטכנולוגיה דו-ממדית בעלת ביצועים גבוהים של ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית (2D-HPLC-MS) בשילוב עם רשתות מולקולריות כדי לפענח את ההרכב הכימי המורכב של צמח המרפא הטיבטי Aconitum pendulum Busch (APB). המאמר מספק פרוטוקול מפורט לחקירה שיטתית וזיהוי של רכיבים כימיים מורכבים של תרופות צמחיות.

Abstract

במחקר זה נעשה שימוש בגישה מקיפה, תוך שימוש בטכנולוגיית 2D-HPLC-MS בשילוב עם הרשת המולקולרית כדי לפענח את ההרכב הכימי המורכב של צמח המרפא הטיבטי APB. באמצעות יישום של 2D-HPLC, הושגה הפרדה משופרת של תערובות מורכבות, המאפשרת בידוד של תרכובות בודדות לניתוח הבא. גישת הרשת המולקולרית סייעה עוד יותר בהבהרת היחסים המבניים בין תרכובות אלה, ותרמה לקביעת מולקולות ביו-אקטיביות פוטנציאליות. אסטרטגיה משולבת זו זיהתה ביעילות מגוון רחב של רכיבים כימיים הקיימים במפעל. הממצאים חשפו ספקטרום מגוון של מרכיבים כימיים בתוך APB, כולל אלקלואידים, בין היתר. מחקר זה לא רק מקדם את הבנת הפרופיל הפיטוכימי של רפואה טיבטית מסורתית זו, אלא גם מספק תובנות חשובות לגבי תכונותיה הטיפוליות הפוטנציאליות. השילוב של 2D-HPLC-MS ורשת מולקולרית מוכיח את עצמו ככלי רב עוצמה לחקירה שיטתית וזיהוי הרכבים כימיים מורכבים בתרופות צמחיות, וסולל את הדרך למחקר ופיתוח נוספים בתחום גילוי מוצרים טבעיים.

Introduction

הרפואה הטיבטית היא חלק בלתי נפרד מהרפואה הסינית המסורתית, תוך דבקות בעקרונות הרפואה הטיבטית, ומשמשת למניעת מחלות ולטיפול^{בהן 1}. עם זאת, צמחי מרפא טיבטיים מכילים מרכיבים כימיים צמחיים מורכבים המאופיינים בתנודות משמעותיות בתוכן. הבנה מוגבלת של היסודות הביו-אקטיביים הבסיסיים הפכה לצוואר בקבוק במודרניזציה של הרפואה הטיבטית². היישום של ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית (LC-MS), המשלבת את כוח ההפרדה החזק של הכרומטוגרפיה עם הרגישות הגבוהה של ספקטרומטריית מסות (MS), נמצא בשימוש נרחב בניתוח רפואה טבעית³. עם זאת, בשל מגבלתו של מנגנון הפרדה יחיד, רכיבים בעלי מבנים דומים מאוד נוטים להתלכד בהפרדת כרומטוגרפיה נוזלית חד-ממדית. באנליזה ספקטרומטרית מסה עוקבת, קשה לזהות את הרכיבים בעלי השפע הנמוך עקב דיכוי יונים הנגרם על ידי רכיבים בעלי שפע גבוה⁴.

2D-HPLC, ראשי תיבות של כרומטוגרפיה נוזלית דו-ממדית בעלת ביצועים גבוהים, מייצגת שיטה כרומטוגרפית חדשנית המשלבת בהרמוניה מנגנוני הפרדה שונים באמצעות זוג עמודות. זה כולל היתוך או החלפה של כרומטוגרפיה בשלב רגיל עם כרומטוגרפיה נוזלית בשלב הפוך ואינטראקציה הידרופילית כרומטוגרפיה נוזלית עם כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה⁵. על ידי מיזוג תכונות כרומטוגרפיות משלימות אלה, מושגת יכולת ההפרדה המשופרת, הנותנת מענה יעיל לאתגרים הנגרמים על ידי מטריצות מדגם מורכבות⁶. יתר על כן, על ידי צימוד כרומטוגרפיה דו-ממדית עם טרשת נפוצה, ניתן לשלב באופן מלא את יכולת ההפרדה החזקה של 2D-HPLC ואת יכולת זיהוי הרגישות הגבוהה של טרשת נפוצה, ולספק תמיכה בחקר מערכות תרופות מורכבות ומרכיביהן הבסיסיים ^7,8,9.

הרפואה הטיבטית כוללת בדרך כלל מערך רב פנים של רכיבים ופונקציונליות, כאשר החומרים הפעילים קיימים בדרך כלל בהרכבים מורכבים ובריכוזים מינימליים. על ידי שילוב 2D-LC כמערכת הפרדה חזקה וטרשת נפוצה כגלאי רגיש במיוחד, ניתן לטפל בצורה יעילה יותר באתגרים שמציבות דגימות מורכבות במונחים של הפרדה וזיהוי 10,11,12. מיזוג זה תורם באופן משמעותי לקידום חקר ההרכב הכימי של הרפואה הטיבטית.

לא משנה אם זה LC-MS מסורתי או 2D-LC-MS, כמות עצומה של מידע ניתן להשיג. עם זאת, חילוץ מידע מבני של רכיבי מערכת מורכבים מכמות מסיבית זו של מידע תמיד היה אתגר משמעותי. לכן, חוקרים פיתחו שיטות שונות לסינון וכריית נתוני טרשת נפוצה. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) היא פלטפורמת ארגון נתונים והדמיה של MS/MS שבה ניתן להעלות נתוני ספקטרומטריית מסה 2D-LC-MS¹³. כל ספקטרום נחשב כווקטור ומושווה לכל הספקטרום האחר באמצעות דמיון קוסינוס (cosine similar). כאשר הדמיון בין שני ספקטרום עולה על סף, הם מחוברים ברשת מולקולרית (MN). זה יכול לשמש לזיהוי מהיר של תרכובות ידועות וקביעת מוצרים טבעיים שונים לא ידועים¹⁴.

לרפואה הטיבטית יש בדרך כלל תפקידים מרובים, אך הרכבה המורכב והבדלי הריכוז המשמעותיים מקשים על בירור יעיל של הקשר בין תפקוד לבסיס חומרי¹⁵ . מחקר מעמיק של הרפואה הטיבטית מחייב אפיון שיטתי של כמה שיותר מרכיבים. במסגרת מחקר זה, בכוונתנו להשתמש ב-APB ברפואה הטיבטית כמושא המחקר כדי להדגים את האסטרטגיה והתהליך של לימוד שיטתי של המרכיבים הכימיים המורכבים של הרפואה הטיבטית באמצעות טכנולוגיית 2D-HPLC-MS וטכנולוגיית MN. בבניית המערכת הכרומטוגרפית הדו-ממדית, שילבנו כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה וכרומטוגרפיה נוזלית עם אינטראקציה הידרופילית עם מנגנוני הפרדה משמעותיים כדי להשיג הפרדה יעילה יותר של המרכיבים המורכבים של APB¹⁶. בנוסף, כדי להתגבר על חוסר תאימות ממס בין שני הממדים, אומץ מצב אפנון דילול בעמודה. על ידי שילוב יכולת ההפרדה רבת העוצמה של 2D-LC עם יכולת זיהוי הרגישות הגבוהה של טרשת נפוצה, המידע הספקטרלי של הרכיבים המורכבים ב- APB מתקבל בצורה יעילה ומקיפה יותר. יתר על כן, באמצעות הרשת והדמיה של מידע ספקטרלי מסיבי על ידי טכנולוגיית MN, רכיבי APB מנותחים באופן שיטתי. האסטרטגיה והתהליך שהודגמו במחקר זה צפויים להיות מיושמים בחקר תרופות טיבטיות אחרות, ולקדם את המחקר על הבסיס החומרי של הרפואה הטיבטית, שהוא בעל משמעות רבה לקידום משאבי הרפואה הטיבטית ולשיפור תקני בקרת האיכות של צמחי מרפא טיבטיים¹⁷. תהליך הניסוי הכולל מוצג באיור 1.

בניסוי המוצג כאן, אפנן דילול חדש בעמודה הוכנס למערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית הדו-ממדית האג'ילינטית (2D-LC)¹⁸. על ידי הוספת משאבת אספקה עצמאית, נתיב הזרימה של הניתוח השתנה, וכתוצאה מכך אורתוגונליות גבוהה של ניתוח 2D-LC. הצימוד והמעבר בין שני הממדים מתבצעים באמצעות שני שסתומים בעלי שש יציאות, כפי שמוצג באיור 2. כאשר לולאת דגימה אחת מתמלאת בממד הראשון, לולאת דגימה נוספת מנותחת בממד השני. משמעות הדבר היא שזמן המילוי של הלולאה ה-1D וזמן הריצה של הדו-ממד שווים. זה דורש את השיפוע המהיר שנוצר על ידי המשאבה הבינארית בממד השני. לא הולכים לאיבוד פסגות כאשר מנתחים את כל הקולחים. זה מועיל במיוחד לניתוח של דגימות לא ידועות. התוצאה היא מספר רב של כרומטוגרמות דו-ממדיות שיש לשלב לצורך ניתוח נתונים.

Protocol

1. הכנה

1. הכנת דוגמאות
   1. השתמש במאזן רגישות של 1/10,000 כדי לשקול 0.25 גרם (משקל יבש) של APB בצינור מיקרוצנטריפוגה של 3 מ"ל, הוסף 2.5 מ"ל מתנול ולאחר מכן בצע סוניקציה למשך 30 דקות (הספק 240 W, תדר 40 kHz).
   2. בצע צנטריפוגה ב 1.2 x גרם במשך 5 דקות, לאסוף את supernatant, ולסנן דרך מסנן ממברנה עם גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר.
2. הכנת חומרים ניסיוניים
   1. הכינו את הפאזה הניידת הדו-ממדית, השתמשו באצטוניטריל כשלב B האורגני, והגדירו מים אולטרה-טהורים עם חומצה פורמית 0.1% כשלב A המימי.
   2. בצע סינון דו-פאזי (0.22 מיקרומטר) ובצע סוניזציה באמצעות מכשיר אולטרסאונד (40 קילוהרץ) למשך 15 דקות. נקה את השלב הנייד שהוחלף כדי להסיר את הבועות. בניסוי זה, עמוד C18 שימש כטור 1D, הטור ההידרופילי כטור 2D, והטור הורכב על המכשיר.
3. התאמת יחס השאנט המתאים
   1. חבר את קו היציאה של מכשיר 2D-LC דרך טי לכניסת המסה ואת הקצה השני של הטי לקו שמוט. התאם את קצב הזרימה לערך מתאים כדי להבטיח שקצב הזרימה לספקטרום המסה הוא 0.3-0.5 מ"ל/דקה.
      הערה: מכיוון שהממד השני של 2D-LC מוגדר בדרך כלל מעל 2 מ"ל/דקה, קצב זרימה זה גדול מדי עבור MS, ולכן יש צורך לבצע פיצול.

2. פעולת 2D-LC

1. לחץ פעמיים על סמל Instrument 1 Online , ותחנת העבודה הכימית תתקשר באופן אוטומטי עם 1260 LC ותכנס לתחנת העבודה.
2. להגדרת פרמטר שיטת 2D-LC, בחר במסך שיטה והפעל בקרה מתפריט תצוגה כדי להפעיל את הממשק הרצוי, שיוזן בדרך כלל כברירת מחדל. לחץ על מודול המזרק, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על שיטה, הגדר את נפח ההזרקה, קצב הזרימה ושיפוע זמן הפאזה הנייד של משאבת 1D.
3. הזן את זמן הריצה לדוגמה תחת זמן עצירה. לחץ על התפריט הראשי מכשיר ולחץ על שיטת 2D-LC בתפריט הנפתח. בחר מקיף במצב 2D-LC. הזן 2 דקות בזמן אפנון, 1.9 דקות בזמן עצירה הדרגתית דו-ממדית. הגדר את הגדרות הזרימה ל- 2 מ"ל. ערוך מעבר צבע דו-ממדי והגדר לאורכי גל. לאחר עריכת השיטה, בחר Save Method As בתפריט Method כדי לתת שם לשיטה החדשה, ולחץ על OK.
   הערה: משאבת ההעברה החיצונית דורשת הגדרה ידנית של קצב הזרימה.

3. פעולת טרשת נפוצה

1. הפעל את המתג של משאבת הוואקום. פתח את השסתום הראשי של גליל הארגון ואת שסתום מחלק הלחץ והתאם את הלחץ לכ- 0.3 מגפ"ס. פתח את שסתום החנקן.
2. המתן לפחות 8 שעות כדי להבטיח ואקום מספיק לתנאי ניסוי. בדוק כי לחץ האוויר של ארגון וחנקן גבוה מספיק לפני הניתוח.
3. כדי להפעיל את תוכנת הבקרה של MS, לחץ על מקור SEI חימום בלוח התוכנה והזן את הפרמטרים של MS, כולל טמפרטורת החימום (350 ° C), קצב זרימת הנדן (35 arb), קצב זרימת אוויר עזר (15 arb), מתח ריסוס (3.8 KV במצב חיובי, -2.5 KV במצב שלילי) וטמפרטורה נימית (275 ° C). לחץ על הלחצן החל כדי להפעיל את מקור היונים.
4. כדי להגדיר את שיטת MS, הזן ערכים להגדרת זמן רכישה, קוטביות, טווח מסה, מספר ערך העברה, משך ערך העברה ועוד. הגדר זמן ריצה של MS (דקות): 93.00. הגדרת פרטי ScanEvent: ITMS + c norm o (100.0-1200.0), CV=0.0v. ITMS + c נורמה Dep MS/MS, יון אינטנסיבי ביותר מ (1): סוג הפעלה: CID, מינימום אות נדרש: 500, רוחב בידוד: 2.00, קול' מנורמל. אנרגיה: 35.0, מצב טעינה ברירת מחדל:3, הפעלה Q: 0.250, זמן הפעלה: 93.000. כדי להגדיר הגדרות תלויות נתונים, השתמש בהגדרות קוטביות נפרדות כמושבתות, אובדן ניטרלי בחלק העליון:3, המוצר למעלה: 3. לחץ על שמור כדי להגדיר את ההגדרות כשיטת המכשיר.
   הערה: סוף זמן הפעולה תואם ל-2D-LC.
5. לחץ על הלחצן Sequence Setup כדי לפתוח את טבלת הרצפים. הזן את סוג הדגימה, שם הקובץ, הנתיב, מזהה הדגימה, שיטת המכשיר, המיקום, כמות ההזרקה ומידע נוסף בטופס.
6. לחץ על להציל כפתור כדי להקליט את רישום הרצף, ולאחר מכן לחץ על התחל ניתוח כפתור כדי להגדיר ולהתחיל רכישת MS. לחץ על Run Control במכשיר 2D-LC ובחר Run Method. במקביל, מכשיר MS גם לוחץ על כפתור הפעלה .
   הערה: מאחר ש-2D-LC ו-MS אינם נשלטים על-ידי אותה תוכנה בניסוי זה, יש להתקין אותם בשני המכשירים בנפרד.

4. פעולת רשת מולקולרית

1. הכנת נתונים: ייצוא נתונים ספקטרליים גולמיים מסוג 2D-HPLC-MS והמרת נתונים ספקטרליים משניים לנתוני mzXML או mzML באמצעות Msconvert של ProteoWizard. (http://proteowizard.sourceforge.net/).
2. כדי להעלות נתונים, הורד את תוכנת WinSCP באתר הרשמי והעלה נתוני mzML לחשבון שנוצר על ידי GNPS באמצעות פרוטוקול FTP. לאחר השלמת ההתקנה, הפעל את WinSCP.
3. התחברות לשרת FTP GNPS: בממשק WinSCP, בדף תצורת הפעלה , מלא את פרטי החיבור הבאים: פרוטוקול קובץ: בחר FTP. עבור Hostname: הזן massive.ucsd.edu., עבור מספר יציאה: שמור על 22 ברירת המחדל.
4. הזן את מספר החשבון והסיסמה. לאחר מילוי המידע לעיל, לחץ על הלחצן Login כדי ליצור חיבור לשרת GNPS FTP.
5. צור רשתות מולקולריות על ידי פתיחת דפדפן אינטרנט וביקור באתר האינטרנט של GNPS (https://gnps.ucsd.edu/). משתמשים חדשים צריכים להירשם לחשבון ולאחר מכן להיכנס.
6. בממשק הראשי של אתר האינטרנט של GNPS, לחץ על הכרטיסייה משימות בסרגל הניווט העליון ובחר צור משימה חדשה מהתפריט הנפתח. בדף יצירת המשימות, לחץ על הלחצן הוסף קבצים ולאחר מכן בחר והעלה את קובץ הנתונים. (למשל, פורמט mzML).
7. בכרטיסייה פרמטרים של משימה, הגדר את הפרמטרים השונים היוצרים את MN. פרמטרים אלה כוללים אלגוריתם מיצוי שיא, ערך overtravel שיא, שיטת חישוב דמיון וכו '. בצע את הגדרות הפרמטרים המתאימות לפי הצורך. לחץ על לחצן הפעל ניתוח בתחתית הדף כדי להפעיל את המשימה.
8. לאחר הפעלת המשימה, אתר את המשימה שנוצרה ברשימת המשימות ולחץ על שם השירות כדי להציג את תוצאות הניתוח. האתר מספק דיאגרמות MN, תחליפים, רשתות סימביוטיות ומידע קשור אחר.

תוצאות

APB שימש כאורגניזם מודל כדי לאמת את ההיתכנות של טכנולוגיית 2D-HPLC-MS בשילוב עם שיטת MN. על ידי ייבוא הנתונים הגולמיים של MS לתוך MN עם הפרמטרים מוגדרים כברירת מחדל, MN נוצר. MN היא אסטרטגיה חישובית חזותית הממחישה את כל היונים המולקולריים שזוהו בניסוי LC-MS-MS-MS מלא ואת היחסים הכימיים בין יונים מולקולריי?...

Discussion

המוקד העיקרי של ניסוי זה היה אופטימיזציה של שיטה חלקית במסגרת הפרדת פאזות נוזליות דו-ממדיות. כדי להשיג זאת, אפנן דילול חדשני בעמודה שולב בצורה חלקה במערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית הדו-ממדית (2D-LC). התאמה טכנית זו הייתה בעלת חשיבות עליונה מכיוון שהיא העלתה באופן משמעותי את המיומנות בפרופיל המרכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Fisher chemical	F22M81203	Mobile phase
Aconitum pendulum	/	/	Herb medicine
Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC	Agilent Technologies	G2198-90001	Liquid chromatography
Disposable syringes	Chengdu Keen experimental equipment	/	1ml
EP tube	Chengdu Keen experimental equipment	/	3ml
Liquid phase injection bottle	Chengdu Keen experimental equipment	/	1.5ml
LTQ XL Mass Spectrometer	Thermo Fisher	LTQ21991	Mass Spectrometer
Microporous membranes	Chengdu Keen experimental equipment	/	0.22μm
Ultimate XB-C18,5 μm,2.1 x 200 mm	Welch	00201-31015	Reversed-phase column
Ultrasonic Cleaner	GT Sonic	UGT20DEC048Y	Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz
XAmide,3 μm,100A	Dalian Mondi Technology	D2019110601	Hydrophilic column