티베트 의학 Aconitum pendulum 의 구성 요소 식별을 위해 분자 네트워크와 결합 된 2D-HPLC-MS 기술

요약

이 연구는 분자 네트워킹과 함께 2차원 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석법(2D-HPLC-MS) 기술을 활용하여 티베트 약용 식물 Aconitum pendulum Busch(APB)의 복잡한 화학 조성을 밝힙니다. 이 기사는 생약의 복잡한 화학 성분을 체계적으로 탐색하고 식별하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

이 연구에서는 티베트 약용 식물 APB의 복잡한 화학 조성을 밝히기 위해 분자 네트워크와 함께 2D-HPLC-MS 기술을 활용하는 포괄적인 접근 방식을 채택했습니다. 2D-HPLC의 구현을 통해 복잡한 혼합물의 분리를 향상시켜 후속 분석을 위해 개별 화합물을 분리할 수 있게 되었습니다. 분자 네트워크 접근법은 이러한 화합물 간의 구조적 관계를 규명하는 데 더욱 도움이 되어 잠재적인 생체 활성 분자의 결정에 기여했습니다. 이 통합 전략은 공장 내에 존재하는 다양한 화학 성분을 효율적으로 식별했습니다. 그 결과, APB 내에 알칼로이드를 포함한 다양한 화학 성분이 존재한다는 사실이 밝혀졌습니다. 이 연구는 이 전통 티베트 의학의 식물화학적 프로파일에 대한 이해를 증진시킬 뿐만 아니라 잠재적인 치료 특성에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 2D-HPLC-MS와 분자 네트워크의 통합은 생약의 복잡한 화학 조성을 체계적으로 탐구하고 식별하기 위한 강력한 도구임이 입증되어 천연물 발견 분야에서 추가 연구 개발을 위한 길을 열었습니다.

서문

티베트 의학은 티베트 의료 행위의 원칙을 고수하는 중국 전통 의학의 필수적인 부분이며 질병 예방 및 치료에 사용됩니다¹. 그러나 티베트 약초에는 함량의 상당한 변동을 특징으로 하는 복잡한 식물 화학 성분이 포함되어 있습니다. 근본적인 생리활성 원소에 대한 제한된 이해는 티베트 의학의 현대화에서 병목 현상이 되었다². 크로마토그래피의 강력한 분리력과 질량 분석법(MS)의 높은 감도를 결합한 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)의 적용은 자연 의학 분석에 널리 사용되었습니다³. 그러나 단일 분리 메커니즘의 한계로 인해 매우 유사한 구조를 가진 성분은 1차원 액체 크로마토그래피 분리에서 용리되는 경향이 있습니다. 후속 질량 분석 결과에서, 저농도 공용리(low-abundance co-elut) 성분은 고농도 성분에 의한 이온 억제로 인해 검출하기 어렵다⁴.

2D HPLC는 2차원 고성능 액체 크로마토그래피를 의미하며, 한 쌍의 컬럼을 사용하여 서로 다른 분리 메커니즘을 조화롭게 결합하는 새로운 크로마토그래피 방법을 나타냅니다. 여기에는 순상 크로마토그래피와 역상 액체 크로마토그래피의 융합 또는 교대, 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피와 역상 액체 크로마토그래피의 융합 또는 교대가 포함된다⁵. 이러한 상호보완적인 크로마토그래피 특성을 결합함으로써 향상된 분리 능력이 달성되어 복잡한 시료 매트릭스⁶로 인한 문제를 효과적으로 해결할 수 있습니다. 또한 2차원 크로마토그래피와 MS를 결합함으로써 2D-HPLC의 강력한 분리 능력과 MS의 고감도 검출 기능을 완전히 통합할 수 있어 복잡한 약물 시스템 및 기본 구성 요소 ^7,8,9의 연구를 지원합니다.

티베트 의학은 일반적으로 다각적인 구성 요소와 기능을 특징으로 하며, 활성 성분은 일반적으로 복잡한 구성과 최소한의 농도로 존재합니다. 2D-LC를 견고한 분리 시스템으로, MS를 매우 민감한 검출기로 통합함으로써 분리 및 식별 측면에서 복잡한 샘플로 인해 발생하는 문제를 보다 효과적으로 해결할 수 있습니다^10,11,12. 이 융합은 티베트 의학의 화학 성분에 대한 탐구를 발전시키는 데 실질적으로 기여합니다.

기존의 LC-MS든 2D-LC-MS든 상관없이 방대한 양의 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나 이러한 방대한 양의 정보에서 복잡한 시스템 구성 요소의 구조 정보를 추출하는 것은 항상 중요한 과제였습니다. 따라서 연구자들은 MS 데이터를 스크리닝하고 마이닝하는 다양한 방법을 개발했습니다. GNPS(Global Natural Products Social Molecular Networking)는 2D-LC-MS 질량 분석 데이터를 업로드할 수 있는 MS/MS 데이터 구성 및 시각화 플랫폼입니다¹³. 각 스펙트럼은 벡터로 간주되며 코사인 유사성을 사용하여 다른 모든 스펙트럼과 비교됩니다. 두 스펙트럼 간의 유사성이 임계값을 초과하면 분자 네트워크(MN)로 연결됩니다. 이것은 알려진 화합물의 신속한 식별과 다양한 알려지지 않은 천연 제품¹⁴의 측정에 사용할 수 있습니다.

티베트 의학은 일반적으로 여러 가지 기능을 가지고 있지만, 복잡한 구성과 현저한 농도 차이로 인해 기능과 물질적 기초 사이의 관계를 효과적으로 설명하기가 어렵다¹⁵. 티베트 의학에 대한 심층적인 연구를 위해서는 가능한 한 많은 성분의 체계적인 특성화가 필요합니다. 본 연구의 틀에서는 티베트 의학의 APB를 연구 대상으로 삼아 2D-HPLC-MS 기술과 MN 기술을 이용하여 티베트 의학의 복잡한 화학 성분을 체계적으로 연구하는 전략과 과정을 보여주고자 한다. 2D 크로마토그래피 시스템을 구축할 때 APB¹⁶의 복잡한 구성 요소를 보다 효과적으로 분리하기 위해 역상 액체 크로마토그래피와 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피를 중요한 분리 메커니즘과 결합했습니다. 또한 두 차원 간의 용매 비호환성을 극복하기 위해 at-column dilution modulation mode가 채택되었습니다. 2D-LC의 강력한 분리 기능과 MS의 고감도 검출 기능을 결합함으로써 APB의 복잡한 구성 요소에 대한 스펙트럼 정보를 보다 효과적이고 포괄적으로 얻을 수 있습니다. 또한 MN 기술에 의한 방대한 스펙트럼 정보의 네트워크 및 시각화를 통해 APB의 구성 요소를 체계적으로 분석합니다. 본 연구에서 보여준 전략과 과정은 다른 티베트 의약품 연구에도 적용될 것으로 기대되며, 티베트 의약품의 물질적 기반에 대한 연구를 촉진할 것으로 기대되며, 이는 티베트 의약품 자원을 발전시키고 티베트 허브의 품질 관리 기준을 개선하는 데 큰 의미가 있다¹⁷. 전체 실험 과정은 그림 1에 나와 있습니다.

여기에 제시된 실험에서는 새로운 at-column 희석 조절기가 애질런트 2차원 액체 크로마토그래피(2D-LC) 시스템¹⁸에 도입되었습니다. 독립적인 전달 펌프를 추가함으로써 해석의 흐름 경로를 변경하여 2D-LC 해석의 직교성이 높아졌습니다. 두 치수 사이의 커플링 및 스위칭은 그림 2와 같이 두 개의 6포트 밸브에 의해 수행됩니다. 첫 번째 차원에서 하나의 샘플 루프가 채워지면 두 번째 차원에서 다른 샘플 루프가 분석됩니다. 이는 1D 루프의 충전 시간과 2D 루프의 실행 시간이 동일하다는 것을 의미합니다. 이를 위해서는 2차원에서 Binary 펌프에 의해 생성된 빠른 기울기가 필요합니다. 전체 유출물을 분석할 때 피크가 손실되지 않습니다. 이는 미지의 시료 분석에 특히 유용합니다. 그 결과 데이터 분석을 위해 결합해야 하는 많은 수의 2D 크로마토그램이 생성됩니다.

프로토콜

1. 준비

1. 시료 전처리
   1. 1/10,000 감도 저울을 사용하여 3mL 미세 원심분리기 튜브에 0.25g(건조 중량)의 APB를 계량하고 2.5mL의 메탄올을 첨가한 다음 30분 동안 초음파 처리합니다(전력 240W, 주파수 40kHz).
   2. 1.2 x g 에서 5분 동안 원심분리를 수행하고 상층액을 수집하고 0.22μm 공극 크기의 멤브레인 필터를 통해 여과합니다.
2. 실험 재료의 준비
   1. 2차원 이동상을 준비하고, 아세토니트릴을 유기상 B상으로 사용하고, 0.1% 포름산 초순수를 수성 상 A로 구성합니다.
   2. 2 상 여과 (0.22 μm)를 수행하고 초음파 기계 (40 kHz)를 사용하여 15 분 동안 초음파 처리합니다. 교체된 이동상을 퍼지하여 기포를 제거합니다. 이 실험에서는 C18 컬럼을 1D 컬럼으로, 친수성 컬럼을 2D 컬럼으로 사용하고, 컬럼을 기기에 장착했습니다.
3. 적절한 션트 비율 조정
   1. 티를 통해 2D-LC 기기 출력 라인을 질량 주입구에 연결하고 티의 다른 쪽 끝을 션트 라인에 연결합니다. 질량 스펙트럼으로의 유속이 0.3-0.5mL/분이 되도록 유속을 적절한 값으로 조정합니다.
      참고: 2D-LC의 2차원은 일반적으로 2mL/min 이상으로 설정되기 때문에 이 유속은 MS에 비해 너무 커서 분할을 수행해야 합니다.

2. 2D-LC 작동

1. Instrument 1 Online 아이콘을 두 번 클릭하면 화학 워크스테이션이 자동으로 1260 LC와 통신하고 워크스테이션으로 들어갑니다.
2. 2D-LC 방법 매개변수 설정의 경우 View 메뉴에서 Method and Run Control 화면을 선택하여 일반적으로 기본적으로 입력되는 원하는 인터페이스를 호출합니다. 인젝터 모듈을 클릭하고, Method를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, 1D 펌프의 주입 부피, 유량 및 이동상 시간 구배를 설정합니다.
3. 중지 시간 아래에 샘플 실행 시간을 입력합니다. 메인 메뉴인 Instrument를 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 2D-LC Method를 클릭합니다. 2D-LC 모드에서 Comprehensive 를 선택합니다. 변조 시간에 2분, 2D 그래디언트 정지 시간에 1.9분을 입력합니다. 유량 설정을 2mL로 설정합니다. 2D-그라디언트를 편집하고 파장으로 설정합니다. 메서드를 편집한 후 메서드 메뉴에서 다른 이름으로 메서드 저장을 선택하여 새 메서드의 이름을 지정한 다음 확인을 클릭합니다.
   알림: 외부 전달 펌프는 유량을 수동으로 설정해야 합니다.

3. MS 작동

1. 진공 펌프의 스위치를 켭니다. 아르곤 실린더 메인 밸브와 압력 분배 밸브를 열고 압력을 약 0.3MPa로 조정합니다. 질소 밸브를 엽니다.
2. 실험 조건에 적합한 진공을 보장하기 위해 최소 8시간 동안 기다리십시오. 분석하기 전에 아르곤과 질소의 공기 압력이 충분히 높은지 확인하십시오.
3. MS 제어 소프트웨어를 시작하려면 소프트웨어 패널에서 가열 SEI 소스를 클릭하고 히터 온도(350°C), 피복 유량(35 arb), 보조 공기 유량(15 arb), 스프레이 전압(포지티브 모드에서 3.8KV, 네거티브 모드에서 -2.5KV) 및 모세관 온도(275°C)를 포함한 MS 매개변수를 입력합니다. Apply( 적용 ) 버튼을 클릭하여 이온 소스를 활성화합니다.
4. MS Method를 설정하려면 값을 입력하여 수집 시간, 극성, 질량 범위, 전달값 수, 전달값 지속 시간 등을 구성합니다. MS 실행 시간(분) 설정: 93.00. ScanEvent 세부 정보 설정: ITMS + c norm o (100.0-1200.0), CV=0.0v. ITMS + c norm Dep MS/MS, (1)에서 가장 강한 이온: 활성화 유형: CID, 최소 필요한 신호: 500, 절연 폭: 2.00, 정규화 열간 에너지: 35.0, 기본 충전 상태: 3, 활성화 Q: 0.250, 활성화 시간: 93.000. 데이터 종속 설정을 지정하려면 disabled, Neutral loss in top:3, Product in top: 3과 같은 별도의 극성 설정을 사용합니다. Save( 저장 )를 클릭하여 기기 방법으로 설정을 구성합니다.
   참고: 실행 시간의 끝은 2D-LC와 일치합니다.
5. 시퀀스 설정 버튼을 클릭하여 시퀀스 테이블을 엽니다. 양식에 샘플 유형, 파일 이름, 경로, 샘플 ID, 기기 방법, 위치, 주입량 및 기타 정보를 입력합니다.
6. Save( 저장 ) 버튼을 클릭하여 염기서열 목록을 기록한 다음 Start Analysis(분석 시작 ) 버튼을 클릭하여 MS Acquisition을 설정하고 시작합니다. 2D-LC 기기에서 Run Control 을 클릭하고 Run Method를 선택합니다. 동시에 MS 기기는 Run 버튼도 클릭합니다.
   참고: 이 실험에서 2D-LC와 MS는 동일한 소프트웨어로 제어되지 않기 때문에 두 기기에 별도로 설정해야 합니다.

4. 분자 네트워크 운영

1. 데이터 준비: ProteoWizard의 Msconvert를 통해 2D-HPLC-MS 원시 질량 스펙트럼 데이터를 내보내고 2차 질량 스펙트럼 데이터를 mzXML 또는 mzML 데이터로 변환합니다. (http://proteowizard.sourceforge.net/).
2. 데이터를 업로드하려면 공식 웹 사이트에서 WinSCP 소프트웨어를 다운로드하고 FTP 프로토콜을 통해 GNPS에서 만든 계정에 mzML 데이터를 업로드하십시오. 설치가 완료되면 WinSCP를 시작합니다.
3. GNPS FTP 서버에 연결: WinSCP 인터페이스의 세션 구성 페이지에서 다음 연결 정보를 입력합니다. 파일 프로토콜: FTP를 선택합니다. 호스트 이름: massive.ucsd.edu.를 입력하고, 포트 번호: 기본값 22를 유지합니다.
4. 계좌 번호와 비밀번호를 입력합니다. 위 정보를 입력한 후 로그인 버튼을 클릭하여 GNPS FTP 서버에 연결합니다.
5. 웹 브라우저를 열고 GNPS 웹사이트(https://gnps.ucsd.edu/)를 방문하여 분자 네트워크를 만듭니다. 새 사용자는 계정에 가입한 다음 로그인해야 합니다.
6. GNPS 웹사이트의 기본 인터페이스에서 상단 네비게이션 바의 작업 탭을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 새 작업 만들기 를 선택합니다. 작업 생성 페이지에서 파일 추가 버튼을 클릭한 다음 데이터 파일을 선택하고 업로드합니다. (예: mzML 형식).
7. Task Parameters(작업 매개변수) 탭에서 MN을 생성하는 다양한 매개변수를 설정합니다. 이러한 매개변수에는 피크 추출 알고리즘, 피크 초과 이동 값, 유사성 계산 방법 등이 포함됩니다. 필요에 따라 적절한 매개 변수 설정을 지정합니다. 페이지 하단의 Launch Analysis 버튼을 클릭하여 작업을 실행합니다.
8. 작업이 실행된 후 작업 목록에서 생성된 작업을 찾아 서비스 이름을 클릭하면 분석 결과를 확인할 수 있습니다. 이 웹사이트는 MN 다이어그램, 대체품, 공생 네트워크 및 기타 관련 정보를 제공합니다.

결과

APB는 MN 방법과 함께 2D-HPLC-MS 기술의 실현 가능성을 검증하기 위한 모델 유기체로 활용되었습니다. 파라미터를 default로 설정하여 MS 원시 데이터를 MN으로 가져오면 MN이 생성되었습니다. MN은 전체 LC-MS-MS 실험에서 검출된 모든 분자 이온과 이러한 분자 이온 간의 화학적 관계를 시각화하는 시각적 계산 전략입니다¹³.

MN은 MS-MS에 진입한 후 화합물에 의해 형성?...

토론

이 실험의 주요 초점은 2차원 액상 분리의 틀 내에서 부분 방법을 최적화하는 것이었습니다. 이를 달성하기 위해 새로운 at-column 희석 조절기가 2차원 액체 크로마토그래피(2D-LC) 시스템에 완벽하게 통합되었습니다. 이 기술적 조정은 APB로 알려진 티베트 의학에 존재하는 화학 성분을 프로파일링하는 능력을 크게 향상시켰기 때문에 매우 중요했습니다. 2D-HPLC-MS 기술을 통합함으로써 APB의 복잡한 조...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Fisher chemical	F22M81203	Mobile phase
Aconitum pendulum	/	/	Herb medicine
Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC	Agilent Technologies	G2198-90001	Liquid chromatography
Disposable syringes	Chengdu Keen experimental equipment	/	1ml
EP tube	Chengdu Keen experimental equipment	/	3ml
Liquid phase injection bottle	Chengdu Keen experimental equipment	/	1.5ml
LTQ XL Mass Spectrometer	Thermo Fisher	LTQ21991	Mass Spectrometer
Microporous membranes	Chengdu Keen experimental equipment	/	0.22μm
Ultimate XB-C18,5 μm,2.1 x 200 mm	Welch	00201-31015	Reversed-phase column
Ultrasonic Cleaner	GT Sonic	UGT20DEC048Y	Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz
XAmide,3 μm,100A	Dalian Mondi Technology	D2019110601	Hydrophilic column