Технология 2D-ВЭЖХ-МС в сочетании с молекулярной сетью для идентификации компонентов маятника аконита тибетской медицины

Резюме

В этом исследовании используется технология двумерной высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (2D-ВЭЖХ-МС) в сочетании с молекулярными сетями для разгадки сложного химического состава тибетского лекарственного растения Aconitum pendulum Busch (APB). В статье представлен подробный протокол систематического исследования и идентификации сложных химических компонентов лекарственных препаратов растительного происхождения.

Аннотация

В этом исследовании был использован комплексный подход с использованием технологии 2D-ВЭЖХ-МС в сочетании с молекулярной сетью для раскрытия сложного химического состава тибетского лекарственного растения APB. Благодаря внедрению 2D-ВЭЖХ было достигнуто улучшенное разделение сложных смесей, что позволило выделить отдельные соединения для последующего анализа. Молекулярно-сетевой подход также помог выяснить структурные отношения между этими соединениями, способствуя определению потенциальных биологически активных молекул. Эта интегрированная стратегия позволила эффективно идентифицировать широкий спектр химических компонентов, присутствующих на заводе. Полученные данные выявили разнообразный спектр химических компонентов в APB, включая, среди прочего, алкалоиды. Это исследование не только углубляет понимание фитохимического профиля этой традиционной тибетской медицины, но и дает ценную информацию о ее потенциальных терапевтических свойствах. Интеграция 2D-ВЭЖХ-МС и молекулярной сети оказывается мощным инструментом для систематического изучения и идентификации сложных химических составов в растительных лекарственных средствах, прокладывая путь для дальнейших исследований и разработок в области открытия натуральных продуктов.

Введение

Тибетская медицина является составной частью традиционной китайской медицины, придерживаясь принципов тибетской медицинской практики, и используется для профилактики и лечения заболеваний¹. Тем не менее, тибетская фитотерапия содержит сложные растительные химические компоненты, характеризующиеся значительными колебаниями содержания. Ограниченное понимание фундаментальных биологически активных элементов стало узким местом в модернизации тибетской медицины². Применение жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), сочетающей в себе сильную разделительную способность хроматографии с высокой чувствительностью масс-спектрометрии (МС), широко используется в анализе натуральной медицины³. Однако из-за ограничения одного механизма разделения компоненты с очень сходной структурой имеют тенденцию к коэлюированию при одномерном жидкостном хроматографическом разделении. В последующем масс-спектрометрическом анализе коэлюированные компоненты с низким содержанием трудно обнаружить из-за подавления ионов, вызванного компонентами с высоким содержанием⁴.

2D-ВЭЖХ, что расшифровывается как двумерная высокоэффективная жидкостная хроматография, представляет собой новый хроматографический метод, который гармонично сочетает в себе различные механизмы разделения с помощью пары колонок. Это включает в себя слияние или чередование нормальнофазовой хроматографии с обращенной фазовой жидкостной хроматографией и жидкостной хроматографии с гидрофильным взаимодействием с обращенной фазовой жидкостной хроматографией⁵. За счет объединения этих взаимодополняющих хроматографических свойств достигается улучшенная способность к разделению, что эффективно решает проблемы, вызванные сложными матрицами образцов⁶. Кроме того, сочетая двумерную хроматографию с МС, можно полностью интегрировать мощную способность 2D-ВЭЖХ к разделению и высокую чувствительность к обнаружению РС, обеспечивая поддержку для изучения сложных лекарственных систем и их фундаментальных составляющих ^7,8,9.

Тибетская медицина обычно отличается многогранным набором компонентов и функций, где активные ингредиенты обычно существуют в сложных композициях и в минимальных концентрациях. За счет интеграции 2D-LC в качестве надежной системы разделения и MS в качестве чрезвычайно чувствительного детектора можно более эффективно решить проблемы, связанные со сложными образцами с точки зрения разделения и идентификации 10,11,12. Это объединение вносит существенный вклад в продвижение исследований химического состава тибетской медицины.

Независимо от того, идет ли речь о традиционном LC-MS или 2D-LC-MS, можно получить огромное количество информации. Тем не менее, извлечение структурной информации о сложных компонентах системы из этого огромного объема информации всегда было серьезной проблемой. Поэтому исследователи разработали различные методы скрининга и анализа данных РС. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) — это платформа для организации и визуализации данных MS/MS, на которую могут быть загружены данные масс-спектрометрии 2D-LC-MS¹³. Каждый спектр рассматривается как вектор и сравнивается со всеми другими спектрами с использованием косинусного сходства. Когда сходство между двумя спектрами превышает пороговое значение, они соединяются в молекулярную сеть (МН). Это может быть использовано для быстрой идентификации известных соединений и определения различных неизвестных природных продуктов¹⁴.

Тибетская медицина обычно выполняет несколько функций, но ее сложный состав и значительные различия в концентрации затрудняют эффективное выяснение взаимосвязи между функцией и^{материальной базой}. Углубленное изучение тибетской медицины требует систематической характеристики как можно большего числа компонентов. В рамках данного исследования мы намерены использовать APB в тибетской медицине в качестве объекта исследования для демонстрации стратегии и процесса систематического изучения сложных химических компонентов тибетской медицины с использованием технологий 2D-HPLC-MS и MN. При построении 2D-хроматографической системы мы объединили жидкостную хроматографию с обратной фазой и жидкостную хроматографию гидрофильного взаимодействия со значительными механизмами разделения для достижения более эффективного разделения сложных компонентов APB¹⁶. Кроме того, для преодоления несовместимости растворителей между двумя размерами был принят режим модуляции разрежения в колонке. Сочетая мощную способность разделения 2D-LC с высокой чувствительностью детектирования MS, спектральная информация о сложных компонентах в APB получается более эффективно и всесторонне. Кроме того, с помощью сети и визуализации массивной спектральной информации с помощью технологии MN компоненты APB систематически анализируются. Ожидается, что стратегия и процесс, продемонстрированные в этом исследовании, будут применены к изучению других тибетских лекарств, способствуя исследованиям на материальной основе тибетской медицины, что имеет большое значение для продвижения ресурсов тибетской медицины и улучшения стандартов контроля качества тибетских трав. Общий процесс эксперимента показан на рисунке 1.

В представленном здесь эксперименте новый модулятор разбавления в колонке был введен в систему двумерной жидкостной хроматографии (2D-LC) компании Agilent¹⁸. При добавлении независимого нагнетательного насоса была изменена траектория потока анализа, что привело к высокой ортогональности анализа 2D-LC. Соединение и переключение между двумя размерами осуществляется двумя шестиходовыми клапанами, как показано на рисунке 2. Когда один контур образца заполняется в первом измерении, другой контур образца анализируется во втором измерении. Это означает, что время заполнения 1D цикла и время выполнения 2D равны. Для этого требуется быстрый градиент, генерируемый двоичным насосом во втором измерении. При анализе всех сточных вод не теряются пики. Это особенно полезно при анализе неизвестных образцов. В результате получается большое количество 2D-хроматограмм, которые необходимо объединить для анализа данных.

протокол

1. Подготовка

1. Подготовка образцов
   1. Весы с чувствительностью 1/10 000 весят 0,25 г (сухой вес) APB в микроцентрифужной пробирке объемом 3 мл, добавляют 2,5 мл метанола, а затем обрабатывают ультразвуком в течение 30 мин (мощность 240 Вт, частота 40 кГц).
   2. Проведите центрифугирование при плотности 1,2 x g в течение 5 мин, соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
2. Подготовка экспериментальных материалов
   1. Приготовьте двумерную подвижную фазу, используйте ацетонитрил в качестве органической фазы В и сконфигурируйте 0,1% ультрачистой воды муравьиной кислоты в качестве водной фазы А.
   2. Провести двухфазную фильтрацию (0,22 мкм) и ультразвуковую обработку с помощью ультразвукового аппарата (40 кГц) в течение 15 мин. Продуйте замененную подвижную фазу, чтобы удалить пузыри. В этом эксперименте колонка C18 использовалась в качестве 1D-колонки, гидрофильная колонка — в качестве 2D-колонки, и колонка была установлена на приборе.
3. Регулировка подходящей мощности шунта
   1. Подсоедините выходную линию прибора 2D-LC через тройник к входу для массы, а другой конец тройника — к шунтирующей линии. Отрегулируйте скорость потока до подходящего значения, чтобы скорость потока в масс-спектре составляла 0,3-0,5 мл/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку второй размер 2D-LC обычно устанавливается выше 2 мл/мин, этот расход слишком велик для MS, поэтому необходимо выполнить разделение.

2. Работа 2D-LC

1. Дважды щелкните значок Instrument 1 Online , и химическая рабочая станция автоматически свяжется с 1260 LC и войдет в рабочую станцию.
2. Для настройки параметра метода 2D-LC выберите экран Метод и управление в меню Вид , чтобы вызвать нужный интерфейс, который обычно вводится по умолчанию. Нажмите на модуль инжектора, щелкните правой кнопкой мыши «Метод», установите объем впрыска, расход и временный градиент подвижной фазы насоса 1D.
3. Введите время выполнения образца в поле Время остановки. Нажмите на главное меню «Инструмент» и нажмите «Метод 2D-LC» в выпадающем меню. Выберите «Комплексный» в режиме 2D-LC. Введите 2 минуты в поле Время модуляции, 1,9 минуты в поле 2D Gradient Stop. Установите Настройки расхода на 2 мл. Отредактируйте 2D-градиент и установите длины волн. После редактирования метода выберите «Сохранить метод как» в меню «Метод», чтобы присвоить имя новому методу, а затем нажмите кнопку «ОК».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внешний перекачивающий насос требует ручной настройки расхода.

3. Работа MS

1. Включите переключатель вакуумного насоса. Откройте главный клапан баллона с аргоном и клапан делителя давления и отрегулируйте давление примерно до 0,3 МПа. Откройте азотный клапан.
2. Подождите не менее 8 часов, чтобы обеспечить достаточный вакуум для экспериментальных условий. Перед анализом убедитесь, что давление воздуха аргона и азота достаточно высокое.
3. Чтобы запустить программное обеспечение для управления MS, нажмите на Heating SEI Source на панели программного обеспечения и введите параметры MS, включая температуру нагревателя (350 °C), расход оболочки (35 Arb), расход вспомогательного воздуха (15 arb), напряжение распыления (3,8 кВ в положительном режиме, -2,5 кВ в отрицательном режиме) и температуру капилляров (275 °C). Нажмите кнопку «Применить », чтобы активировать источник ионов.
4. Чтобы настроить метод MS, введите значения для настройки времени захвата, полярности, диапазона масс, номера передаточного значения, длительности передаваемого значения и т. д. Установленное время работы MS (мин): 93.00. Настройте ScanEvent Details: ITMS + c норма o (100.0-1200.0), CV=0.0v. ITMS + c норма Dep MS/MS, наиболее интенсивный ион из (1): Тип активации: CID, Требуемый минимальный сигнал: 500, Ширина изоляции: 2.00, Нормализованная энергия: 35.0, Состояние заряда по умолчанию: 3, Активация Q: 0.250, Время активации: 93.000. Чтобы установить настройки, зависящие от данных, используйте отдельные настройки полярности, как отключено, Нейтральные потери в top:3, Продукт в top: 3. Нажмите Сохранить , чтобы настроить параметры в качестве метода инструмента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время окончания работы соответствует 2D-LC.
5. Нажмите кнопку Настройка последовательности , чтобы открыть таблицу последовательностей. Введите в форму тип образца, имя файла, путь, идентификатор образца, метод прибора, местоположение, объем впрыска и другую информацию.
6. Нажмите кнопку «Сохранить », чтобы записать список последовательностей, затем нажмите кнопку « Начать анализ », чтобы настроить и начать сбор данных MS. Нажмите Run Control на приборе 2D-LC и выберите Run Method. В то же время прибор MS также нажимает кнопку Run .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в этом эксперименте 2D-LC и MS не управляются одним и тем же программным обеспечением, их необходимо настраивать на оба прибора отдельно.

4. Работа с молекулярными сетями

1. Подготовка данных: Экспортируйте необработанные масс-спектральные данные 2D-HPLC-MS и преобразуйте вторичные масс-спектральные данные в данные mzXML или mzML с помощью Msconvert от ProteoWizard. (http://proteowizard.sourceforge.net/).
2. Чтобы загрузить данные, скачайте программное обеспечение WinSCP на официальном сайте и загрузите данные mzML в учетную запись, созданную GNPS по протоколу FTP. После завершения установки запустите WinSCP.
3. Подключитесь к FTP-серверу GNPS: В интерфейсе WinSCP на странице Конфигурация сессии заполните следующую информацию о подключении: Протокол файла: Выберите FTP. Для имени хоста: введите massive.ucsd.edu., для номера порта: оставьте значение по умолчанию 22.
4. Введите номер счета и пароль. После заполнения вышеуказанной информации нажмите кнопку «Войти», чтобы установить соединение с FTP-сервером GNPS.
5. Создавайте молекулярные сети, открывая веб-браузер и посещая веб-сайт GNPS (https://gnps.ucsd.edu/). Новым пользователям необходимо зарегистрировать учетную запись, а затем войти в систему.
6. В главном интерфейсе веб-сайта GNPS перейдите на вкладку «Задачи » на верхней панели навигации и выберите «Создать новую задачу » в раскрывающемся меню. На странице создания задачи нажмите кнопку « Добавить файлы», затем выберите и загрузите файл данных. (например, формат mzML).
7. На вкладке Параметры задачи задайте различные параметры, которые генерируют MN. Эти параметры включают алгоритм извлечения пиков, значение перебега пика, метод расчета подобия и т. д. При необходимости выполните соответствующие настройки параметров. Нажмите кнопку «Запустить анализ » в нижней части страницы, чтобы запустить задачу.
8. После выполнения задачи найдите созданную задачу в списке задач и нажмите на имя службы , чтобы просмотреть результаты анализа. На веб-сайте представлены диаграммы MN, заменители, симбиотические сети и другая связанная с этим информация.

Результаты

APB был использован в качестве модельного организма для проверки осуществимости технологии 2D-ВЭЖХ-МС в сочетании с методом MN. Путем импорта исходных данных MS в MN с параметрами, установленными по умолчанию, был сгенерирован MN. MN — это визуальная вычислительная стратегия, которая визуализ...

Обсуждение

Основным направлением данного эксперимента была оптимизация частичного метода в рамках двумерного разделения жидкой фазы. Для достижения этой цели новый модулятор разбавления в колонке был бесшовно интегрирован в систему двумерной жидкостной хроматографии (2D-LC). Эта техническая кор?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Fisher chemical	F22M81203	Mobile phase
Aconitum pendulum	/	/	Herb medicine
Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC	Agilent Technologies	G2198-90001	Liquid chromatography
Disposable syringes	Chengdu Keen experimental equipment	/	1ml
EP tube	Chengdu Keen experimental equipment	/	3ml
Liquid phase injection bottle	Chengdu Keen experimental equipment	/	1.5ml
LTQ XL Mass Spectrometer	Thermo Fisher	LTQ21991	Mass Spectrometer
Microporous membranes	Chengdu Keen experimental equipment	/	0.22μm
Ultimate XB-C18,5 μm,2.1 x 200 mm	Welch	00201-31015	Reversed-phase column
Ultrasonic Cleaner	GT Sonic	UGT20DEC048Y	Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz
XAmide,3 μm,100A	Dalian Mondi Technology	D2019110601	Hydrophilic column