チベット医学トリカブト振り子中の成分同定のための分子ネットワークと組み合わせた2D-HPLC-MS技術

要約

この研究では、2次元高速液体クロマトグラフィー-質量分析(2D-HPLC-MS)技術と分子ネットワークを組み合わせて、チベットの薬用植物 であるトリカブ ト振り子ブッシュ(APB)の複雑な化学組成を解明します。この記事では、漢方薬の複雑な化学成分を体系的に調査し、同定するための詳細なプロトコルを提供します。

要約

本研究では、2D-HPLC-MS技術と分子ネットワークを併用し、チベットの薬用植物APBの複雑な化学組成を解明する包括的なアプローチを採用しました。2D-HPLCの導入により、複雑な混合物の分離が向上し、その後の分析のために個々の化合物を単離することが可能になりました。分子ネットワークアプローチは、これらの化合物間の構造的関係の解明にさらに役立ち、潜在的な生理活性分子の決定に貢献しました。この統合戦略により、プラント内に存在するさまざまな化学成分を効率的に特定することができました。その結果、APBにはアルカロイドなど、さまざまな化学成分が含まれていることが明らかになりました。この研究は、この伝統的なチベット医学の植物化学的プロファイルの理解を進めるだけでなく、その潜在的な治療特性に関する貴重な洞察も提供します。2D-HPLC-MSと分子ネットワークの統合は、漢方薬の複雑な化学組成を体系的に探索および同定するための強力なツールであることが証明されており、天然物発見の分野におけるさらなる研究開発への道を開きます。

概要

チベット医学は、チベットの医療行為の原則を遵守し、伝統的な中国医学の不可欠な部分であり、病気の予防と治療に使用されます¹。しかし、チベットの漢方薬には、含有量の大幅な変動を特徴とする複雑な植物化学成分が含まれています。基本的な生理活性元素の理解が限られていることが、チベット医学の近代化のボトルネックとなっています²。クロマトグラフィーの強力な分離力と質量分析(MS)の高感度を組み合わせた液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)の応用は、自然医学分析で広く使用されています³。しかし、単一の分離メカニズムには制限があるため、構造が類似性の高い成分は、1次元液体クロマトグラフィー分離で共溶出する傾向があります。その後の質量分析では、高存在量成分⁴によるイオン抑制により、低存在量の共溶出成分を検出することが困難でした。

2D-HPLCは、Two-Dimensional High-Performance Liquid Chromatographyの略で、一対のカラムを使用して異なる分離メカニズムを調和的に組み合わせた新しいクロマトグラフィー法です。これには、順相クロマトグラフィーと逆相液体クロマトグラフィー、および親水性相互作用液体クロマトグラフィーと逆相液体クロマトグラフィーとの融合または交互使用が含まれます⁵。これらの相補的なクロマトグラフィー特性を融合させることで、分離能力が向上し、複雑なサンプルマトリックス6が引き起こす課題に効果的に対処^{できます。}さらに、2次元クロマトグラフィーとMSを結合させることで、2D-HPLCの強力な分離能とMSの高感度検出能力を存分に発揮することができ、複雑な薬物系とその基本成分の研究を支援する^{ことができる7,8,9}。

チベット医学は一般的に、多面的な成分と機能性を特徴としており、有効成分は通常、複雑な組成で最小限の濃度で存在します。2D-LCを堅牢な分離システムとして、MSを非常に高感度な検出器として統合することにより、分離と同定の観点から複雑なサンプルがもたらす課題により効果的に対処できます^10、11、12。この合併は、チベット医学の化学組成の探求を前進させることに大きく貢献しています。

従来のLC-MSでも2D-LC-MSでも、膨大な情報を得ることができます。しかし、この膨大な情報から複雑なシステム部品の構造情報を抽出することは、常に大きな課題でした。そのため、研究者はMSデータのスクリーニングとマイニングのためのさまざまな方法を開発してきました。Global Natural Products Social Molecular Networking(GNPS)は、2D-LC-MS質量分析データをアップロードできるMS/MSデータ整理および可視化プラットフォームです¹³。各スペクトルはベクトルと見なされ、コサイン類似度を使用して他のすべてのスペクトルと比較されます。2つのスペクトル間の類似性が閾値を超えると、それらは分子ネットワーク(MN)で接続されます。これは、既知の化合物の迅速な同定および種々の未知の天然物の測定に用いることができる¹⁴。

チベット医学は通常、複数の機能を持っていますが、その複雑な組成と大きな濃度の違いにより、機能と物質的基礎との関係を効果的に解明することは困難です¹⁵。チベット医学の詳細な研究には、できるだけ多くの成分を体系的に特徴づけることが必要です。本研究の枠組みでは、チベット医学におけるAPBを研究対象として、2D-HPLC-MS技術とMN技術を用いてチベット医学の複雑な化学成分を体系的に研究する戦略とプロセスを実証するつもりです。2D クロマトグラフィーシステムの構築では、逆相液体クロマトグラフィーと親水性相互作用液体クロマトグラフィーを重要な分離メカニズムと組み合わせて、APB¹⁶ の複雑な成分をより効果的に分離することを達成しました。さらに、2つの次元間の溶媒の不適合を克服するために、アットカラム希釈変調モードが採用されました。2D-LCの強力な分離機能とMSの高感度検出能力を組み合わせることで、APBの複雑な成分のスペクトル情報をより効果的かつ包括的に取得できます。さらに、MN技術による膨大なスペクトル情報のネットワーク化と可視化により、APBの構成要素を系統的に解析します。本研究で実証された戦略とプロセスは、他のチベット医薬品の研究にも応用されることが期待され、チベット医学の物質的基礎に関する研究を促進することは、チベットの医薬品資源の進歩とチベットのハーブの品質管理基準の向上にとって大きな意義を持つ¹⁷。全体的な実験プロセスを 図 1 に示します。

ここで提示した実験では、新しいアットカラム希釈調節器をAgilentの2次元液体クロマトグラフィー(2D-LC)システム¹⁸に導入した。独立した吐出ポンプを追加することで、解析の流路を変更し、2D-LC解析の直交性を高めました。2 つの寸法間の結合と切り替えは、 図 2 に示すように、2 つの 6 ポート バルブによって行われます。1 つ目の次元に 1 つのサンプル ループが埋められると、2 つ目の次元で別のサンプル ループが解析されます。これは、1Dループの充填時間と2Dの実行時間が等しいことを意味します。これには、2次元のバイナリポンプによって生成される高速勾配が必要です。全体の排水を分析するときにピークが失われることはありません。これは、未知のサンプルの分析に特に役立ちます。その結果、データ解析のために組み合わせる必要のある多数の2Dクロマトグラムが生成されます。

プロトコル

1. 事前準備

1. サンプル調製
   1. 1/10,000の感度天秤を使用して、3 mLの微量遠心チューブに0.25 g(乾燥重量)のAPBを秤量し、2.5 mLのメタノールを加えた後、30分間超音波処理します(出力240 W、周波数40 kHz)。
   2. 1.2 x g で5分間遠心分離を行い、上清を回収し、孔径0.22 μmのメンブレンフィルターでろ過します。
2. 実験材料の準備
   1. 二次元移動相を調製し、有機相B相としてアセトニトリルを使用し、水相Aとして0.1%ギ酸超純水を構成します。
   2. 二相ろ過(0.22μm)を行い、超音波装置(40kHz)を用いて15分間超音波処理します。交換した移動相をパージして、気泡を除去します。この実験では、C18カラムを1Dカラム、親水性カラムを2Dカラムとして、カラムを装置に取り付けました。
3. 適切なシャント比の調整
   1. 2D-LC装置のアウトラインをティーを介してマスインレットに接続し、ティーのもう一方の端をシャントラインに接続します。質量スペクトルへの流量が0.3〜0.5mL / minになるように、流量を適切な値に調整します。
      注:2D-LC の 2 次元は通常 2 mL/分以上に設定されているため、この流速は MS には大きすぎるため、スプリットを実行する必要があります。

2. 2D-LC操作

1. Instrument 1 Onlineアイコンをダブルクリックすると、ケミカルワークステーションが自動的に1260 LCと通信し、ワークステーションに入ります。
2. 2D-LCメソッドパラメータ設定では、ViewメニューからMethod and Run Control画面を選択し、通常はデフォルトで入力される目的のインターフェースを呼び出します。インジェクターモジュールをクリックし、[メソッド]を右クリックして、1Dポンプの注入量、流速、移動相の時間勾配を設定します。
3. [停止時間] にサンプルの実行時間を入力します。メインメニューの「Instrument」をクリックし、ドロップダウンメニューの「2D-LC Method」をクリックします。2D-LCモードで[包括的]を選択します。Modulation timeに2分、2D Gradient Stop時間に1.9分を入力します。[Flow Settings]を[2 mL]に設定します。2D-Gradientを編集し、波長に設定します。メソッドを編集した後、「メソッド」メニューの「名前を付けてメソッドを保存」を選択して新しいメソッドに名前を付け、「OK」をクリックします。
   注:外部移送ポンプでは、流量を手動で設定する必要があります。

3. MS操作

1. 真空ポンプのスイッチをONにします。アルゴンシリンダーのメインバルブと分圧器バルブを開き、圧力を約0.3MPaに調整します。窒素バルブを開きます。
2. 実験条件に十分な真空を確保するために、少なくとも8時間待ちます。分析する前に、アルゴンと窒素の空気圧が十分に高いことを確認してください。
3. MS制御ソフトウェアを起動するには、ソフトウェアパネルの [Heating SEI Source ]をクリックし、ヒーター温度(350 °C)、シース流量(35 arb)、補助空気流量(15 arb)、スプレー電圧(ポジティブモードで3.8 KV、ネガティブモードで-2.5 KV)、キャピラリー温度(275 °C)などのMSパラメータを入力します。 Apply ボタンをクリックして、イオン源を活性化します。
4. MSメソッドを設定するには、値を入力して、取り込み時間、極性、質量範囲、転写値番号、転写値持続時間などを設定します。MS 実行時間 (分): 93.00 を設定します。ScanEventの詳細を設定します:ITMS + c norm o(100.0-1200.0)、CV = 0.0v。ITMS + c ノルム Dep MS/MS、(1) からの最も強度の高いイオン: 活性化タイプ: CID、必要な最小信号: 500、分離幅: 2.00、正規化された結合エネルギー: 35.0、デフォルトの充電状態: 3、活性化 Q: 0.250、活性化時間: 93.000.データ依存の設定を行うには、別々の極性設定を無効にします。「Neutral loss in top:3」、「Product in top:3」です。「 Save 」をクリックして、装置メソッドとして設定を構成します。
   メモ: 実行時間の終了時間は 2D-LC と一致しています。
5. 「Sequence Setup」ボタンをクリックして、シーケンステーブルを開きます。サンプルの種類、ファイル名、パス、サンプルID、装置メソッド、場所、注入量、およびその他の情報をフォームに入力します。
6. 「Save」ボタンをクリックしてシーケンスリストを記録し、「Start Analysis」ボタンをクリックしてMS取得をセットアップして開始します。2D-LC装置のRun Controlをクリックし、Run Methodを選択します。同時に、MS 装置は「実行」ボタンもクリックします。
   注:この実験では、2D-LCとMSは同じソフトウェアで制御されないため、両方の装置で別々に設定する必要があります。

4. 分子ネットワーク操作

1. データ準備:2D-HPLC-MSの生質量スペクトルデータをエクスポートし、ProteoWizardのMsconvertを介して二次質量スペクトルデータをmzXMLまたはmzMLデータに変換します。(http://proteowizard.sourceforge.net/)。
2. データをアップロードするには、公式WebサイトでWinSCPソフトウェアをダウンロードし、FTPプロトコルを介してGNPSが作成したアカウントにmzMLデータをアップロードします。インストールが完了したら、WinSCPを起動します。
3. GNPS FTP サーバーに接続する: WinSCP インターフェイスの [セッション 構成] ページで、次の接続情報を入力します。 ファイル プロトコル: FTP を選択します。[ホスト名] に massive.ucsd.edu. と入力し、[ポート番号] にデフォルトの 22 のままにします。
4. アカウント番号とパスワードを入力します。上記の情報を入力したら、[ ログイン ]ボタンをクリックしてGNPSFTPサーバーへの接続を確立します。
5. Webブラウザを開き、GNPSのWebサイト(https://gnps.ucsd.edu/)にアクセスして、分子ネットワークを作成します。新規ユーザーは、アカウントにサインアップしてからログインする必要があります。
6. GNPS Webサイトのメインインターフェイスで、上部のナビゲーションバーの [タスク ]タブをクリックし、ドロップダウンメニューから [新しいタスクの作成 ]を選択します。タスク作成ページで、[ ファイルの追加 ] ボタンをクリックし、データ ファイルを選択してアップロードします。(例:mzML形式)。
7. [タスク パラメーター] タブで、MN を生成するさまざまなパラメーターを設定します。これらのパラメータには、ピーク抽出アルゴリズム、ピークオーバートラベル値、類似性計算方法などが含まれます。必要に応じて、適切なパラメータ設定を行います。ページの下部にある 「Launch Analysis 」ボタンをクリックして、タスクを実行します。
8. タスクの実行後、タスクリストで作成したタスクを見つけ、[ サービス名 ] をクリックして分析結果を表示します。このWebサイトでは、MN図、代替図、共生ネットワーク、およびその他の関連情報を提供しています。

結果

APBは、MN法と組み合わせた2D-HPLC-MSテクノロジーの実現可能性を検証するためのモデル生物として利用されました。パラメーターをデフォルトに設定して MS の生データを MN にインポートすると、MN が生成されました。MNは、完全なLC-MS-MS実験で検出されたすべての分子イオンと、これらの分子イオン間の化学関係を視覚化する視覚的な計算戦略です¹³。

MN?...

ディスカッション

この実験の主な焦点は、2次元液相分離の枠組み内での部分法の最適化でした。これを達成するために、新しいアットカラム希釈モジュレーターを 2 次元液体クロマトグラフィー(2D-LC)システムにシームレスに統合しました。この技術的な調整は、APBとして知られるチベット医学に存在する化学成分のプロファイリングの習熟度を大幅に向上させたため、最も重要でした。2D-HPLC-MS技術を組み込?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Fisher chemical	F22M81203	Mobile phase
Aconitum pendulum	/	/	Herb medicine
Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC	Agilent Technologies	G2198-90001	Liquid chromatography
Disposable syringes	Chengdu Keen experimental equipment	/	1ml
EP tube	Chengdu Keen experimental equipment	/	3ml
Liquid phase injection bottle	Chengdu Keen experimental equipment	/	1.5ml
LTQ XL Mass Spectrometer	Thermo Fisher	LTQ21991	Mass Spectrometer
Microporous membranes	Chengdu Keen experimental equipment	/	0.22μm
Ultimate XB-C18,5 μm,2.1 x 200 mm	Welch	00201-31015	Reversed-phase column
Ultrasonic Cleaner	GT Sonic	UGT20DEC048Y	Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz
XAmide,3 μm,100A	Dalian Mondi Technology	D2019110601	Hydrophilic column