2D-HPLC-MS-Technologie kombiniert mit molekularem Netzwerk zur Identifizierung von Bestandteilen in der tibetischen Medizin Aconitum-Pendel

Zusammenfassung

Diese Studie nutzt die zweidimensionale Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (2D-HPLC-MS) Technologie in Verbindung mit molekularen Netzwerken, um die komplizierte chemische Zusammensetzung der tibetischen Heilpflanze Aconitum pendulum Busch (APB) zu entschlüsseln. Der Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die systematische Erforschung und Identifizierung komplexer chemischer Bestandteile pflanzlicher Arzneimittel.

Zusammenfassung

In dieser Studie wurde ein umfassender Ansatz verfolgt, bei dem die 2D-HPLC-MS-Technologie in Verbindung mit dem molekularen Netzwerk verwendet wurde, um die komplizierte chemische Zusammensetzung der tibetischen Heilpflanze APB zu entschlüsseln. Durch die Implementierung der 2D-HPLC wurde eine verbesserte Trennung komplexer Gemische erreicht, die die Isolierung einzelner Verbindungen für die anschließende Analyse ermöglicht. Der Ansatz des molekularen Netzwerks trug weiter zur Aufklärung der strukturellen Beziehungen zwischen diesen Verbindungen bei und trug zur Bestimmung potenzieller bioaktiver Moleküle bei. Diese integrierte Strategie identifizierte effizient eine breite Palette chemischer Komponenten, die in der Anlage vorhanden sind. Die Ergebnisse zeigten ein vielfältiges Spektrum chemischer Bestandteile innerhalb von APB, darunter Alkaloide. Diese Forschung fördert nicht nur das Verständnis des phytochemischen Profils dieser traditionellen tibetischen Medizin, sondern liefert auch wertvolle Einblicke in ihre potenziellen therapeutischen Eigenschaften. Die Integration von 2D-HPLC-MS und molekularem Netzwerk erweist sich als leistungsfähiges Werkzeug zur systematischen Erforschung und Identifizierung komplexer chemischer Zusammensetzungen in pflanzlichen Arzneimitteln und ebnet den Weg für weitere Forschung und Entwicklung im Bereich der Naturstoffentdeckung.

Einleitung

Die tibetische Medizin ist ein integraler Bestandteil der traditionellen chinesischen Medizin, die sich an die Prinzipien der tibetischen Medizin hält und zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten eingesetzt^{wird 1}. Die tibetische Kräutermedizin enthält jedoch komplexe pflanzliche chemische Bestandteile, die durch erhebliche Gehaltsschwankungen gekennzeichnet sind. Das begrenzte Verständnis der grundlegenden bioaktiven Elemente ist zu einem Engpass bei der Modernisierung der tibetischen Medizin geworden². Die Anwendung der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), die die starke Trennkraft der Chromatographie mit der hohen Empfindlichkeit der Massenspektrometrie (MS) kombiniert, ist in der naturmedizinischen Analytik weit verbreitet³. Aufgrund der Beschränkung auf einen einzigen Trennmechanismus neigen Komponenten mit sehr ähnlichen Strukturen jedoch dazu, bei der eindimensionalen Flüssigkeitschromatographie-Trennung zu koelutieren. In der anschließenden massenspektrometrischen Analyse sind die koeluierten Komponenten mit geringer Abundanz aufgrund der Ionensuppression, die durch Komponenten mit hoher Abundanz verursacht wird, schwer zu detektieren⁴.

Die 2D-HPLC, die Abkürzung für zweidimensionale Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, stellt ein neuartiges chromatographisches Verfahren dar, das verschiedene Trennmechanismen mittels eines Säulenpaares harmonisch miteinander verbindet. Dies umfasst die Fusion oder Abwechslung der Normalphasenchromatographie mit der Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie und der hydrophilen Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie mit der Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie⁵. Durch die Zusammenführung dieser komplementären chromatographischen Eigenschaften wird die verbesserte Trennfähigkeit erreicht, wodurch die Herausforderungen, die durch komplexe Probenmatrizen verursacht werden, effektiv bewältigt^{werden 6}. Darüber hinaus können durch die Kopplung der zweidimensionalen Chromatographie mit MS die leistungsstarke Trennfähigkeit der 2D-HPLC und die hochempfindliche Detektionsfähigkeit der MS vollständig integriert werden, was die Untersuchung komplexer Wirkstoffsysteme und ihrer grundlegenden Bestandteile unterstützt ^7,8,9.

Die tibetische Medizin zeichnet sich im Allgemeinen durch eine facettenreiche Palette von Komponenten und Funktionalitäten aus, wobei die Wirkstoffe in der Regel in komplizierten Zusammensetzungen und in minimalen Konzentrationen vorliegen. Durch die Integration von 2D-LC als robustem Trennsystem und MS als äußerst empfindlichem Detektor können die Herausforderungen, die komplizierte Proben in Bezug auf Trennung und Identifizierung mit sich bringen, effektiver bewältigt werden 10,11,12. Diese Verschmelzung trägt wesentlich dazu bei, die Erforschung der chemischen Zusammensetzung der tibetischen Medizin voranzutreiben.

Unabhängig davon, ob es sich um eine traditionelle LC-MS oder 2D-LC-MS handelt, kann eine große Menge an Informationen gewonnen werden. Die Extraktion von Strukturinformationen komplexer Systemkomponenten aus dieser riesigen Informationsmenge war jedoch schon immer eine große Herausforderung. Daher haben die Forscher verschiedene Methoden entwickelt, um MS-Daten zu screenen und zu verwerten. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) ist eine MS/MS-Datenorganisations- und Visualisierungsplattform, auf der 2D-LC-MS-Massenspektrometriedaten hochgeladen werden können¹³. Jedes Spektrum wird als Vektor betrachtet und mit allen anderen Spektren unter Verwendung der Kosinusähnlichkeit verglichen. Wenn die Ähnlichkeit zwischen zwei Spektren einen Schwellenwert überschreitet, werden sie in einem molekularen Netzwerk (MN) verbunden. Dies kann für die schnelle Identifizierung bekannter Verbindungen und die Bestimmung verschiedener unbekannter Naturstoffe verwendet werden¹⁴.

Die tibetische Medizin hat in der Regel mehrere Funktionen, aber ihre komplexe Zusammensetzung und ihre signifikanten Konzentrationsunterschiede machen es schwierig, den Zusammenhang zwischen Funktion und materieller Basis effektiv aufzuklären¹⁵. Eine vertiefte Beschäftigung mit der tibetischen Medizin erfordert die systematische Charakterisierung möglichst vieler Komponenten. Im Rahmen dieser Studie beabsichtigen wir, APB in der tibetischen Medizin als Forschungsobjekt zu verwenden, um die Strategie und den Prozess der systematischen Untersuchung der komplexen chemischen Komponenten der tibetischen Medizin mit Hilfe der 2D-HPLC-MS-Technologie und der MN-Technologie zu demonstrieren. Bei der Konstruktion des 2D-chromatographischen Systems haben wir die Umkehrphasen-Flüssigchromatographie und die hydrophile Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie mit signifikanten Trennmechanismen kombiniert, um eine effektivere Trennung der komplexen Komponenten von APB¹⁶ zu erreichen. Um die Lösungsmittelinkompatibilität zwischen den beiden Dimensionen zu überwinden, wurde außerdem ein Verdünnungsmodulationsmodus an der Säule eingeführt. Durch die Kombination der leistungsstarken Trennfähigkeit von 2D-LC mit der hochempfindlichen Detektionsfähigkeit von MS werden die spektralen Informationen der komplexen Komponenten in APB effektiver und umfassender erhalten. Darüber hinaus werden durch die Vernetzung und Visualisierung massiver spektraler Informationen durch die MN-Technologie die Komponenten von APB systematisch analysiert. Es wird erwartet, dass die in dieser Studie gezeigte Strategie und der Prozess auf die Erforschung anderer tibetischer Arzneimittel angewendet werden und die Forschung über die materiellen Grundlagen der tibetischen Medizin fördern, was für die Förderung der Ressourcen der tibetischen Medizin und die Verbesserung der Qualitätskontrollstandards für tibetische Kräuter von großer Bedeutung ist¹⁷. Der gesamte Versuchsprozess ist in Abbildung 1 dargestellt.

In dem hier vorgestellten Experiment wurde ein neuer At-Säulen-Verdünnungsmodulator in das zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie-System (2D-LC) von Agilent¹⁸ eingeführt. Durch das Hinzufügen einer unabhängigen Förderpumpe wurde der Strömungsweg der Analyse verändert, was zu einer hohen Orthogonalität der 2D-LC-Analyse führte. Das Ankuppeln und Umschalten zwischen den beiden Dimensionen erfolgt durch zwei Sechswegeventile, wie in Abbildung 2 dargestellt. Wenn eine Probenschleife in der ersten Dimension gefüllt ist, wird eine andere Probenschleife in der zweiten Dimension analysiert. Das bedeutet, dass die Füllzeit der 1D-Schleife und die Laufzeit der 2D gleich sind. Dies erfordert den schnellen Gradienten, der von der binären Pumpe in der zweiten Dimension erzeugt wird. Bei der Analyse des gesamten Abwassers gehen keine Spitzen verloren. Dies ist besonders hilfreich für die Analyse unbekannter Proben. Das Ergebnis ist eine große Anzahl von 2D-Chromatogrammen, die für die Datenanalyse kombiniert werden müssen.

Protokoll

1. Vorbereitung

1. Vorbereitung der Probe
   1. Verwenden Sie eine Sensitivitätswaage von 1/10.000, um 0,25 g (Trockengewicht) APB in ein 3-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu wiegen, fügen Sie 2,5 mL Methanol hinzu und beschallen Sie es dann 30 Minuten lang (Leistung 240 W, Frequenz 40 kHz).
   2. Führen Sie eine Zentrifugation bei 1,2 x g für 5 min durch, sammeln Sie den Überstand und filtrieren Sie durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm.
2. Aufbereitung von Versuchsmaterialien
   1. Bereiten Sie die zweidimensionale mobile Phase vor, verwenden Sie Acetonitril als organische Phase B und konfigurieren Sie 0,1 % Ameisensäure Reinstwasser als wässrige Phase A.
   2. Führen Sie eine zweiphasige Filtration (0,22 μm) durch und beschallen Sie sie 15 Minuten lang mit einem Ultraschallgerät (40 kHz). Spülen Sie die ersetzte mobile Phase, um die Blasen zu entfernen. In diesem Experiment wurde die C18-Säule als 1D-Säule verwendet, die hydrophile Säule als 2D-Säule und die Säule wurde am Instrument montiert.
3. Einstellung des passenden Shunt-Verhältnisses
   1. Verbinden Sie die 2D-LC-Instrumentenausgangsleitung durch ein T-Stück mit dem Masseneinlass und das andere Ende des T-Stücks mit einer Nebenrangleitung. Stellen Sie die Flussrate auf einen geeigneten Wert ein, um sicherzustellen, dass die Flussrate in das Massenspektrum 0,3-0,5 mL/min beträgt.
      HINWEIS: Da die zweite Dimension des 2D-LC in der Regel über 2 mL/min eingestellt ist, ist diese Durchflussrate für MS zu groß, so dass eine Teilung erforderlich ist.

2. 2D-LC-Betrieb

1. Doppelklicken Sie auf das Symbol Instrument 1 Online , und die chemische Workstation kommuniziert automatisch mit dem 1260 LC und betritt die Workstation.
2. Wählen Sie für die Einstellung der 2D-LC-Methodenparameter den Bildschirm Methoden- und Ausführungssteuerung aus dem Menü Ansicht aus, um die gewünschte Schnittstelle aufzurufen, die normalerweise standardmäßig eingegeben wird. Klicken Sie auf das Injektormodul, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Methode, stellen Sie das Einspritzvolumen, die Durchflussmenge und den mobilen Phasenzeitgradienten der 1D-Pumpe ein.
3. Geben Sie die Beispiellaufzeit unter Stoppzeit ein. Klicken Sie auf das Hauptmenü Instrument und klicken Sie im Dropdown-Menü auf 2D-LC-Methode. Wählen Sie im 2D-LC-Modus die Option Umfassend. Geben Sie 2 Minuten bei der Modulationszeit ein, 1,9 Minuten bei der Stoppzeit für den 2D-Gradienten. Stellen Sie die Flusseinstellungen auf 2 ml ein. Bearbeiten Sie den 2D-Gradienten und stellen Sie ihn auf Wellenlängen ein. Nachdem Sie die Methode bearbeitet haben, wählen Sie im Menü Methode die Option Methode speichern unter aus, um der neuen Methode einen Namen zu geben, und klicken Sie dann auf OK.
   HINWEIS: Die externe Transferpumpe erfordert eine manuelle Einstellung der Durchflussmenge.

3. MS-Bedienung

1. Schalten Sie den Schalter der Vakuumpumpe ein. Öffnen Sie das Hauptventil des Argonzylinders und das Druckteilerventil und stellen Sie den Druck auf ca. 0,3 MPa ein. Öffnen Sie das Stickstoffventil.
2. Warten Sie mindestens 8 Stunden, um ein ausreichendes Vakuum für die Versuchsbedingungen zu gewährleisten. Vor der Analyse prüfen, ob der Luftdruck von Argon und Stickstoff hoch genug ist.
3. Um die MS-Steuerungssoftware zu starten, klicken Sie im Software-Panel auf die Heiz-SEI-Quelle und geben Sie die MS-Parameter ein, einschließlich der Heiztemperatur (350 °C), der Manteldurchflussrate (35 arb), des Zusatzluftdurchflusses (15 arb), der Sprühspannung (3,8 kV im positiven Modus, -2,5 kV im negativen Modus) und der Kapillartemperatur (275 °C). Klicken Sie auf die Schaltfläche Anwenden , um die Ionenquelle zu aktivieren.
4. Um die MS-Methode einzurichten, geben Sie Werte ein, um die Erfassungszeit, die Polarität, den Massenbereich, die Anzahl der Übertragungswerte, die Dauer des Übertragungswerts und vieles mehr zu konfigurieren. MS-Laufzeit einstellen (min): 93.00. ScanEvent-Details einrichten: ITMS + c norm o (100.0-1200.0), CV=0.0v. ITMS + c Norm Dep MS/MS, intensivstes Ion aus (1): Aktivierungstyp: CID, Min. Signal erforderlich: 500, Isolationsbreite: 2.00, Normalisierte Coll. Energie: 35.0, Standardladezustand: 3, Aktivierung Q: 0.250, Aktivierungszeit: 93.000. Um datenabhängige Einstellungen vorzunehmen, verwenden Sie separate Polaritätseinstellungen als deaktiviert, Neutralverlust oben: 3, Produkt oben: 3. Klicken Sie auf Speichern , um die Einstellungen als Gerätemethode zu konfigurieren.
   HINWEIS: Das Ende der Laufzeit stimmt mit dem des 2D-LC überein.
5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Sequenz einrichten , um die Sequenztabelle zu öffnen. Geben Sie den Probentyp, den Dateinamen, den Pfad, die Proben-ID, die Gerätemethode, den Ort, die Injektionsmenge und andere Informationen in das Formular ein.
6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die Sequenzliste aufzuzeichnen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Analyse starten , um die MS-Erfassung einzurichten und zu starten. Klicken Sie auf Run Control (Steuerung ausführen ) auf dem 2D-LC-Instrument (Run Control) und wählen Sie Run Method (Laufmethode). Gleichzeitig klickt das MS-Instrument auch auf die Schaltfläche Run .
   HINWEIS: Da 2D-LC und MS in diesem Experiment nicht von derselben Software gesteuert werden, müssen sie auf beiden Instrumenten separat eingerichtet werden.

4. Funktionsweise des molekularen Netzwerks

1. Datenaufbereitung: Exportieren Sie 2D-HPLC-MS-Massenspektraldaten und konvertieren Sie sekundäre Massenspektraldaten in mzXML- oder mzML-Daten über Msconvert von ProteoWizard. (http://proteowizard.sourceforge.net/).
2. Um Daten hochzuladen, laden Sie die WinSCP-Software von der offiziellen Website herunter und laden Sie mzML-Daten über das FTP-Protokoll auf das von GNPS erstellte Konto hoch. Sobald die Installation abgeschlossen ist, starten Sie WinSCP.
3. Verbindung zum GNPS-FTP-Server herstellen: Geben Sie in der WinSCP-Benutzeroberfläche auf der Sitzungskonfigurationsseite die folgenden Verbindungsinformationen ein: Dateiprotokoll: Wählen Sie FTP aus. Für Hostname: Geben Sie massive.ucsd.edu. ein, für Portnummer: Behalten Sie den Standardwert 22 bei.
4. Geben Sie die Kontonummer und das Passwort ein. Nachdem Sie die obigen Informationen eingegeben haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Anmelden , um eine Verbindung zum GNPS-FTP-Server herzustellen.
5. Erstellen Sie molekulare Netzwerke, indem Sie einen Webbrowser öffnen und die GNPS-Website (https://gnps.ucsd.edu/) besuchen. Neue Benutzer müssen sich für ein Konto anmelden und sich dann anmelden.
6. Klicken Sie auf der Hauptoberfläche der GNPS-Website in der oberen Navigationsleiste auf die Registerkarte Aufgaben und wählen Sie im Dropdown-Menü die Option Neue Aufgabe erstellen aus. Klicken Sie auf der Seite zur Aufgabenerstellung auf die Schaltfläche Dateien hinzufügen , wählen Sie die Datendatei aus und laden Sie sie hoch. (z. B. mzML-Format).
7. Legen Sie auf der Registerkarte Task-Parameter die verschiedenen Parameter fest, mit denen der MN generiert wird. Zu diesen Parametern gehören der Peak-Extraktionsalgorithmus, der Peak-Überlaufwert, die Ähnlichkeitsberechnungsmethode usw. Nehmen Sie bei Bedarf die entsprechenden Parametereinstellungen vor. Klicken Sie unten auf der Seite auf die Schaltfläche Analyse starten , um die Aufgabe auszuführen.
8. Suchen Sie nach dem Ausführen der Aufgabe die erstellte Aufgabe in der Aufgabenliste, und klicken Sie auf den Dienstnamen , um die Analyseergebnisse anzuzeigen. Die Website bietet MN-Diagramme, Substitute, symbiotische Netzwerke und andere verwandte Informationen.

Ergebnisse

APB wurde als Modellorganismus verwendet, um die Machbarkeit der 2D-HPLC-MS-Technologie in Verbindung mit der MN-Methode zu validieren. Durch den Import der MS-Rohdaten in die MN mit den standardmäßig eingestellten Parametern wurde eine MN generiert. MN ist eine visuelle Rechenstrategie, die alle molekularen Ionen, die in einem vollständigen LC-MS-MS-Experiment nachgewiesen wurden, und die chemischen Beziehungen zwischen diesen molekularen Ionen visualisiert¹³.

MN ba...

Diskussion

Der Schwerpunkt dieses Versuchs lag auf der Optimierung eines partiellen Verfahrens im Rahmen der zweidimensionalen Flüssigphasentrennung. Um dies zu erreichen, wurde ein neuartiger At-Säulen-Verdünnungsmodulator nahtlos in das zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie-System (2D-LC) integriert. Diese technische Anpassung war von größter Bedeutung, da sie die Fähigkeit zur Profilierung der chemischen Bestandteile der tibetischen Medizin, bekannt als APB, erheblich verbesserte. Die Integration der 2D-HPLC-MS-Tec...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Fisher chemical	F22M81203	Mobile phase
Aconitum pendulum	/	/	Herb medicine
Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC	Agilent Technologies	G2198-90001	Liquid chromatography
Disposable syringes	Chengdu Keen experimental equipment	/	1ml
EP tube	Chengdu Keen experimental equipment	/	3ml
Liquid phase injection bottle	Chengdu Keen experimental equipment	/	1.5ml
LTQ XL Mass Spectrometer	Thermo Fisher	LTQ21991	Mass Spectrometer
Microporous membranes	Chengdu Keen experimental equipment	/	0.22μm
Ultimate XB-C18,5 μm,2.1 x 200 mm	Welch	00201-31015	Reversed-phase column
Ultrasonic Cleaner	GT Sonic	UGT20DEC048Y	Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz
XAmide,3 μm,100A	Dalian Mondi Technology	D2019110601	Hydrophilic column