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* Estos autores han contribuido por igual
Este estudio utiliza la tecnología de cromatografía líquida bidimensional de alta resolución-espectrometría de masas (2D-HPLC-MS) junto con redes moleculares para desentrañar la intrincada composición química de la planta medicinal tibetana Aconitum pendulum Busch (APB). El artículo proporciona un protocolo detallado para la exploración sistemática y la identificación de componentes químicos complejos de los medicamentos a base de hierbas.
En este estudio, se empleó un enfoque integral, utilizando la tecnología 2D-HPLC-MS junto con la red molecular para desentrañar la intrincada composición química de la planta medicinal tibetana APB. A través de la implementación de la HPLC 2D, se logró una mejor separación de mezclas complejas, lo que permitió el aislamiento de compuestos individuales para su posterior análisis. El enfoque de redes moleculares ayudó aún más a dilucidar las relaciones estructurales entre estos compuestos, lo que contribuyó a la determinación de posibles moléculas bioactivas. Esta estrategia integrada identificó de manera eficiente una amplia gama de componentes químicos presentes dentro de la planta. Los hallazgos revelaron un espectro diverso de constituyentes químicos dentro de APB, incluidos los alcaloides, entre otros. Esta investigación no solo avanza en la comprensión del perfil fitoquímico de esta medicina tradicional tibetana, sino que también proporciona información valiosa sobre sus posibles propiedades terapéuticas. La integración de 2D-HPLC-MS y la red molecular demuestra ser una poderosa herramienta para explorar e identificar sistemáticamente composiciones químicas complejas en medicamentos a base de hierbas, allanando el camino para futuras investigaciones y desarrollos en el campo del descubrimiento de productos naturales.
La medicina tibetana es una parte integral de la medicina tradicional china, se adhiere a los principios de las prácticas médicas tibetanas y se utiliza para la prevencióny el tratamiento de enfermedades. Sin embargo, la medicina herbal tibetana contiene componentes químicos complejos de las plantas caracterizados por fluctuaciones significativas en el contenido. La comprensión limitada de los elementos bioactivos fundamentales se ha convertido en un cuello de botella en la modernización dela medicina tibetana. La aplicación de la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), que combina el fuerte poder de separación de la cromatografía con la alta sensibilidad de la espectrometría de masas (MS), ha sido ampliamente utilizada en el análisis de medicina natural3. Sin embargo, debido a la limitación de un único mecanismo de separación, los componentes con estructuras muy similares tienden a coeluir en la separación por cromatografía líquida unidimensional. En el análisis de espectrometría de masas posterior, los componentes coeluidos de baja abundancia son difíciles de detectar debido a la supresión de iones causada por los componentes de alta abundancia4.
La 2D-HPLC, acrónimo de cromatografía líquida bidimensional de alta resolución, representa un método cromatográfico novedoso que combina armoniosamente diferentes mecanismos de separación mediante un par de columnas. Esto incluye la fusión o alternancia de la cromatografía de fase normal con la cromatografía líquida de fase reversa y la cromatografía líquida de interacción hidrofílica con la cromatografía líquida de fase reversa5. Al fusionar estas propiedades cromatográficas complementarias, se logra una capacidad de separación mejorada, abordando de manera efectiva los desafíos causados por matrices de muestras complejas6. Además, al acoplar la cromatografía bidimensional con la MS, la potente capacidad de separación de la 2D-HPLC y la capacidad de detección de alta sensibilidad de la EM pueden integrarse completamente, lo que proporciona apoyo para el estudio de sistemas farmacológicos complejos y sus constituyentes fundamentales 7,8,9.
La medicina tibetana suele presentar una gama multifacética de componentes y funcionalidades, en la que los ingredientes activos suelen existir en composiciones intrincadas y en concentraciones mínimas. Al integrar 2D-LC como un sistema de separación robusto y MS como un detector extremadamente sensible, los desafíos que plantean las muestras complejas en términos de separación e identificación pueden abordarse de manera más efectiva 10,11,12. Esta amalgama contribuye sustancialmente al avance de la exploración de la composición química de la medicina tibetana.
Independientemente de si se trata de LC-MS tradicional o 2D-LC-MS, se puede obtener una gran cantidad de información. Sin embargo, extraer información estructural de componentes complejos del sistema a partir de esta enorme cantidad de información siempre ha sido un desafío importante. Por lo tanto, los investigadores han desarrollado varios métodos para detectar y extraer datos de EM. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) es una plataforma de organización y visualización de datos MS/MS donde se pueden cargar datos de espectrometría de masas 2D-LC-MS13. Cada espectro se considera como un vector y se compara con todos los demás espectros utilizando la similitud de coseno. Cuando la similitud entre dos espectros supera un umbral, se conectan en una red molecular (MN). Esto puede utilizarse para la identificación rápida de compuestos conocidos y la determinación de diversos productos naturales desconocidos14.
La medicina tibetana suele tener múltiples funciones, pero su compleja composición y sus significativas diferencias de concentración dificultan la elucidación efectiva de la relación entre la función y la base material15. Un estudio en profundidad de la medicina tibetana requiere la caracterización sistemática de tantos componentes como sea posible. En el marco de este estudio, tenemos la intención de utilizar APB en la medicina tibetana como objeto de investigación para demostrar la estrategia y el proceso de estudio sistemático de los componentes químicos complejos de la medicina tibetana utilizando la tecnología 2D-HPLC-MS y la tecnología MN. En la construcción del sistema cromatográfico 2D, combinamos la cromatografía líquida de fase reversa y la cromatografía líquida de interacción hidrofílica con mecanismos de separación significativos para lograr una separación más efectiva de los componentes complejos de APB16. Además, para superar la incompatibilidad de solventes entre las dos dimensiones, se adoptó un modo de modulación de dilución en columna. Al combinar la potente capacidad de separación de 2D-LC con la capacidad de detección de alta sensibilidad de MS, la información espectral de los componentes complejos en APB se obtiene de manera más efectiva y completa. Además, a través de la red y visualización de información espectral masiva mediante tecnología MN, se analizan sistemáticamente los componentes de APB. Se espera que la estrategia y el proceso demostrados en este estudio se apliquen al estudio de otras medicinas tibetanas, promoviendo la investigación sobre la base material de la medicina tibetana, que es de gran importancia para el avance de los recursos de medicina tibetana y la mejora de los estándares de control de calidad de las hierbas tibetanas. El proceso experimental general se muestra en la Figura 1.
En el experimento que aquí se presenta, se introdujo un nuevo modulador de dilución en columna en el sistema de cromatografía líquida bidimensional (2D-LC) de Agilent18. Al agregar una bomba de suministro independiente, se cambió la ruta de flujo del análisis, lo que resultó en una alta ortogonalidad del análisis 2D-LC. El acoplamiento y la conmutación entre las dos dimensiones se realizan mediante dos válvulas de seis puertos, como se muestra en la Figura 2. Cuando se rellena un bucle de muestra en la primera dimensión, se analiza otro bucle de muestra en la segunda dimensión. Esto significa que el tiempo de llenado del bucle 1D y el tiempo de ejecución del 2D son iguales. Esto requiere el gradiente rápido generado por la bomba binaria en la segunda dimensión. No se pierden picos cuando se analiza todo el efluente. Esto es particularmente útil para el análisis de muestras desconocidas. El resultado es un gran número de cromatogramas 2D que deben combinarse para el análisis de datos.
1. Preparación
2. Operación 2D-LC
3. Funcionamiento de la EM
4. Operación de redes moleculares
Se utilizó APB como organismo modelo para validar la viabilidad de la tecnología 2D-HPLC-MS junto con el método MN. Al importar los datos brutos de MS en el MN con los parámetros establecidos en los valores predeterminados, se generó un MN. MN es una estrategia computacional visual que visualiza todos los iones moleculares detectados en un experimento LC-MS-MS completo y las relaciones químicas entre estos iones moleculares13.
La MN se basa en los fragmentos secun...
El objetivo principal de este experimento fue la optimización de un método parcial en el marco de la separación bidimensional de fases líquidas. Para lograr esto, un nuevo modulador de dilución en columna se integró a la perfección en el sistema de cromatografía líquida bidimensional (2D-LC). Este ajuste técnico fue de suma importancia, ya que elevó significativamente la competencia en el perfil de los constituyentes químicos presentes en la medicina tibetana conocida como APB. La incorporación de la tecnolo...
Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82130113), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82204765), la Fundación de Ciencias de la Naturaleza de Sichuan (2022NSFSC1470), el Proyecto de Financiación Especial Postdoctoral Provincial de Sichuan (TB2023020) y el Programa de Promoción de la Investigación Xinglin Scholars de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (BSH2021030). Estos fondos proporcionan apoyo en términos de equipos experimentales, materiales experimentales y tarifas de publicación.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetonitrile | Fisher chemical | F22M81203 | Mobile phase |
Aconitum pendulum | / | / | Herb medicine |
Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC | Agilent Technologies | G2198-90001 | Liquid chromatography |
Disposable syringes | Chengdu Keen experimental equipment | / | 1ml |
EP tube | Chengdu Keen experimental equipment | / | 3ml |
Liquid phase injection bottle | Chengdu Keen experimental equipment | / | 1.5ml |
LTQ XL Mass Spectrometer | Thermo Fisher | LTQ21991 | Mass Spectrometer |
Microporous membranes | Chengdu Keen experimental equipment | / | 0.22μm |
Ultimate XB-C18,5 μm,2.1 x 200 mm | Welch | 00201-31015 | Reversed-phase column |
Ultrasonic Cleaner | GT Sonic | UGT20DEC048Y | Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz |
XAmide,3 μm,100A | Dalian Mondi Technology | D2019110601 | Hydrophilic column |
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