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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este estudio utiliza la tecnología de cromatografía líquida bidimensional de alta resolución-espectrometría de masas (2D-HPLC-MS) junto con redes moleculares para desentrañar la intrincada composición química de la planta medicinal tibetana Aconitum pendulum Busch (APB). El artículo proporciona un protocolo detallado para la exploración sistemática y la identificación de componentes químicos complejos de los medicamentos a base de hierbas.

Resumen

En este estudio, se empleó un enfoque integral, utilizando la tecnología 2D-HPLC-MS junto con la red molecular para desentrañar la intrincada composición química de la planta medicinal tibetana APB. A través de la implementación de la HPLC 2D, se logró una mejor separación de mezclas complejas, lo que permitió el aislamiento de compuestos individuales para su posterior análisis. El enfoque de redes moleculares ayudó aún más a dilucidar las relaciones estructurales entre estos compuestos, lo que contribuyó a la determinación de posibles moléculas bioactivas. Esta estrategia integrada identificó de manera eficiente una amplia gama de componentes químicos presentes dentro de la planta. Los hallazgos revelaron un espectro diverso de constituyentes químicos dentro de APB, incluidos los alcaloides, entre otros. Esta investigación no solo avanza en la comprensión del perfil fitoquímico de esta medicina tradicional tibetana, sino que también proporciona información valiosa sobre sus posibles propiedades terapéuticas. La integración de 2D-HPLC-MS y la red molecular demuestra ser una poderosa herramienta para explorar e identificar sistemáticamente composiciones químicas complejas en medicamentos a base de hierbas, allanando el camino para futuras investigaciones y desarrollos en el campo del descubrimiento de productos naturales.

Introducción

La medicina tibetana es una parte integral de la medicina tradicional china, se adhiere a los principios de las prácticas médicas tibetanas y se utiliza para la prevencióny el tratamiento de enfermedades. Sin embargo, la medicina herbal tibetana contiene componentes químicos complejos de las plantas caracterizados por fluctuaciones significativas en el contenido. La comprensión limitada de los elementos bioactivos fundamentales se ha convertido en un cuello de botella en la modernización dela medicina tibetana. La aplicación de la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), que combina el fuerte poder de separación de la cromatografía con la alta sensibilidad de la espectrometría de masas (MS), ha sido ampliamente utilizada en el análisis de medicina natural3. Sin embargo, debido a la limitación de un único mecanismo de separación, los componentes con estructuras muy similares tienden a coeluir en la separación por cromatografía líquida unidimensional. En el análisis de espectrometría de masas posterior, los componentes coeluidos de baja abundancia son difíciles de detectar debido a la supresión de iones causada por los componentes de alta abundancia4.

La 2D-HPLC, acrónimo de cromatografía líquida bidimensional de alta resolución, representa un método cromatográfico novedoso que combina armoniosamente diferentes mecanismos de separación mediante un par de columnas. Esto incluye la fusión o alternancia de la cromatografía de fase normal con la cromatografía líquida de fase reversa y la cromatografía líquida de interacción hidrofílica con la cromatografía líquida de fase reversa5. Al fusionar estas propiedades cromatográficas complementarias, se logra una capacidad de separación mejorada, abordando de manera efectiva los desafíos causados por matrices de muestras complejas6. Además, al acoplar la cromatografía bidimensional con la MS, la potente capacidad de separación de la 2D-HPLC y la capacidad de detección de alta sensibilidad de la EM pueden integrarse completamente, lo que proporciona apoyo para el estudio de sistemas farmacológicos complejos y sus constituyentes fundamentales 7,8,9.

La medicina tibetana suele presentar una gama multifacética de componentes y funcionalidades, en la que los ingredientes activos suelen existir en composiciones intrincadas y en concentraciones mínimas. Al integrar 2D-LC como un sistema de separación robusto y MS como un detector extremadamente sensible, los desafíos que plantean las muestras complejas en términos de separación e identificación pueden abordarse de manera más efectiva 10,11,12. Esta amalgama contribuye sustancialmente al avance de la exploración de la composición química de la medicina tibetana.

Independientemente de si se trata de LC-MS tradicional o 2D-LC-MS, se puede obtener una gran cantidad de información. Sin embargo, extraer información estructural de componentes complejos del sistema a partir de esta enorme cantidad de información siempre ha sido un desafío importante. Por lo tanto, los investigadores han desarrollado varios métodos para detectar y extraer datos de EM. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) es una plataforma de organización y visualización de datos MS/MS donde se pueden cargar datos de espectrometría de masas 2D-LC-MS13. Cada espectro se considera como un vector y se compara con todos los demás espectros utilizando la similitud de coseno. Cuando la similitud entre dos espectros supera un umbral, se conectan en una red molecular (MN). Esto puede utilizarse para la identificación rápida de compuestos conocidos y la determinación de diversos productos naturales desconocidos14.

La medicina tibetana suele tener múltiples funciones, pero su compleja composición y sus significativas diferencias de concentración dificultan la elucidación efectiva de la relación entre la función y la base material15. Un estudio en profundidad de la medicina tibetana requiere la caracterización sistemática de tantos componentes como sea posible. En el marco de este estudio, tenemos la intención de utilizar APB en la medicina tibetana como objeto de investigación para demostrar la estrategia y el proceso de estudio sistemático de los componentes químicos complejos de la medicina tibetana utilizando la tecnología 2D-HPLC-MS y la tecnología MN. En la construcción del sistema cromatográfico 2D, combinamos la cromatografía líquida de fase reversa y la cromatografía líquida de interacción hidrofílica con mecanismos de separación significativos para lograr una separación más efectiva de los componentes complejos de APB16. Además, para superar la incompatibilidad de solventes entre las dos dimensiones, se adoptó un modo de modulación de dilución en columna. Al combinar la potente capacidad de separación de 2D-LC con la capacidad de detección de alta sensibilidad de MS, la información espectral de los componentes complejos en APB se obtiene de manera más efectiva y completa. Además, a través de la red y visualización de información espectral masiva mediante tecnología MN, se analizan sistemáticamente los componentes de APB. Se espera que la estrategia y el proceso demostrados en este estudio se apliquen al estudio de otras medicinas tibetanas, promoviendo la investigación sobre la base material de la medicina tibetana, que es de gran importancia para el avance de los recursos de medicina tibetana y la mejora de los estándares de control de calidad de las hierbas tibetanas. El proceso experimental general se muestra en la Figura 1.

En el experimento que aquí se presenta, se introdujo un nuevo modulador de dilución en columna en el sistema de cromatografía líquida bidimensional (2D-LC) de Agilent18. Al agregar una bomba de suministro independiente, se cambió la ruta de flujo del análisis, lo que resultó en una alta ortogonalidad del análisis 2D-LC. El acoplamiento y la conmutación entre las dos dimensiones se realizan mediante dos válvulas de seis puertos, como se muestra en la Figura 2. Cuando se rellena un bucle de muestra en la primera dimensión, se analiza otro bucle de muestra en la segunda dimensión. Esto significa que el tiempo de llenado del bucle 1D y el tiempo de ejecución del 2D son iguales. Esto requiere el gradiente rápido generado por la bomba binaria en la segunda dimensión. No se pierden picos cuando se analiza todo el efluente. Esto es particularmente útil para el análisis de muestras desconocidas. El resultado es un gran número de cromatogramas 2D que deben combinarse para el análisis de datos.

Protocolo

1. Preparación

  1. Preparación de la muestra
    1. Utilice una balanza de sensibilidad 1/10.000 para pesar 0,25 g (peso seco) de APB en un tubo de microcentrífuga de 3 mL, añada 2,5 mL de metanol y, a continuación, sonique durante 30 min (potencia 240 W, frecuencia 40 kHz).
    2. Realice la centrifugación a 1,2 x g durante 5 minutos, recoja el sobrenadante y filtre a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,22 μm.
  2. Preparación de materiales experimentales
    1. Prepare la fase móvil bidimensional, use acetonitrilo como fase orgánica B y configure agua ultrapura con ácido fórmico al 0,1% como fase acuosa A.
    2. Realizar una filtración bifásica (0,22 μm) y sonicar con un ecógrafo (40 kHz) durante 15 min. Purgue la fase móvil reemplazada para eliminar las burbujas. En este experimento, se utilizó la columna C18 como columna 1D, la columna hidrofílica como columna 2D, y la columna se montó en el instrumento.
  3. Ajuste de la relación de derivación adecuada
    1. Conecte la línea de salida del instrumento 2D-LC a través de una T a la entrada de masa y el otro extremo de la T a una línea derivada. Ajuste el caudal a un valor adecuado para garantizar que el caudal en el espectro másico sea de 0,3-0,5 mL/min.
      NOTA: Dado que la segunda dimensión del 2D-LC suele estar por encima de 2 mL/min, este caudal es demasiado grande para la MS, por lo que es necesario realizar una división.

2. Operación 2D-LC

  1. Haga doble clic en el icono Instrument 1 Online y la estación de trabajo química se comunicará automáticamente con el 1260 LC e ingresará a la estación de trabajo.
  2. Para la configuración de parámetros de método 2D-LC, seleccione la pantalla Control de método y ejecución en el menú Ver para invocar la interfaz deseada, que normalmente se ingresará de forma predeterminada. Haga clic en el módulo del inyector, haga clic con el botón derecho en Método, configure el volumen de inyección, el caudal y el gradiente de tiempo de fase móvil de la bomba 1D.
  3. Introduzca el tiempo de ejecución de ejemplo en Tiempo de detención. Haga clic en el menú principal Instrumento y haga clic en Método 2D-LC en el menú desplegable. Seleccione Completo en el modo 2D-LC. Introduzca 2 minutos en el tiempo de modulación , 1,9 minutos en el tiempo de parada de degradado 2D . Establezca los ajustes de flujo en 2 ml. Edite el degradado 2D y configúrelo en longitudes de onda. Después de editar el método, seleccione Guardar método como en el menú Método para asignar un nombre al nuevo método y, a continuación, haga clic en Aceptar.
    NOTA: La bomba de transferencia externa requiere un ajuste manual del caudal.

3. Funcionamiento de la EM

  1. Encienda el interruptor de la bomba de vacío. Abra la válvula principal del cilindro de argón y la válvula divisora de presión y ajuste la presión a aproximadamente 0,3 MPa. Abra la válvula de nitrógeno.
  2. Espere al menos 8 h para asegurar un vacío adecuado para las condiciones experimentales. Verifique que la presión del aire de argón y nitrógeno sea lo suficientemente alta antes del análisis.
  3. Para iniciar el software de control MS, haga clic en la fuente de calefacción SEI en el panel del software e ingrese los parámetros MS, incluida la temperatura del calentador (350 °C), el caudal de la vaina (35 arb), el caudal de aire auxiliar (15 arb), el voltaje de pulverización (3,8 KV en modo positivo, -2,5 KV en modo negativo) y la temperatura capilar (275 °C). Haga clic en el botón Aplicar para activar la fuente de iones.
  4. Para configurar el método MS, introduzca valores para configurar el tiempo de adquisición, la polaridad, el rango de masas, el número de valor de transferencia, la duración del valor de transferencia, etc. Establecer el tiempo de ejecución de MS (min): 93.00. Detalles de ScanEvent: ITMS + c norm o (100.0-1200.0), CV=0.0v. ITMS + c norma Dep MS/MS, ion más intenso de (1): Tipo de activación: CID, Señal mínima requerida: 500, Ancho de aislamiento: 2.00, Energía normalizada de la colección: 35.0, Estado de carga predeterminado: 3, Activación Q: 0.250, Tiempo de activación: 93.000. Para establecer la configuración dependiente de los datos, use configuraciones de polaridad separadas como deshabilitada, Pérdida de neutro en la parte superior:3, Producto en la parte superior: 3. Haga clic en Guardar para configurar los ajustes como el método del instrumento.
    NOTA: El final del tiempo de ejecución es coherente con el 2D-LC.
  5. Haga clic en el botón Configuración de secuencia para abrir la tabla de secuencias. Introduzca el tipo de muestra, el nombre del archivo, la ruta, el ID de la muestra, el método del instrumento, la ubicación, la cantidad de inyección y otra información en el formulario.
  6. Haga clic en el botón Guardar para registrar la lista de secuencias y, a continuación, haga clic en el botón Iniciar análisis para configurar e iniciar la adquisición de MS. Haga clic en Control de ejecución en el instrumento 2D-LC y seleccione Método de ejecución. Al mismo tiempo, el instrumento MS también hace clic en el botón Ejecutar .
    NOTA: Debido a que el 2D-LC y el MS no están controlados por el mismo software en este experimento, deben configurarse en ambos instrumentos por separado.

4. Operación de redes moleculares

  1. Preparación de datos: Exporte datos espectrales de masas en bruto 2D-HPLC-MS y convierta datos espectrales de masas secundarios en datos mzXML o mzML a través de Msconvert de ProteoWizard. (http://proteowizard.sourceforge.net/).
  2. Para cargar datos, descargue el software WinSCP en el sitio web oficial y cargue los datos mzML en la cuenta creada por GNPS a través del protocolo FTP. Una vez completada la instalación, inicie WinSCP.
  3. Conectarse al servidor FTP GNPS: En la interfaz de WinSCP, en la página Configuración de sesión , rellene la siguiente información de conexión: Protocolo de archivo: seleccione FTP. Para Nombre de host: Ingrese massive.ucsd.edu., para Número de puerto: Mantenga el valor predeterminado 22.
  4. Introduzca el número de cuenta y la contraseña. Después de completar la información anterior, haga clic en el botón Iniciar sesión para establecer una conexión con el servidor FTP GNPS.
  5. Cree redes moleculares abriendo un navegador web y visitando el sitio web de GNPS (https://gnps.ucsd.edu/). Los nuevos usuarios deben registrarse para obtener una cuenta y luego iniciar sesión.
  6. En la interfaz principal del sitio web de GNPS, haga clic en la pestaña Tareas en la barra de navegación superior y seleccione Crear una nueva tarea en el menú desplegable. En la página de creación de tareas, haga clic en el botón Agregar archivos y, a continuación, seleccione y cargue el archivo de datos. (por ejemplo, formato mzML).
  7. En la pestaña Parámetros de tarea, establezca los distintos parámetros que generan el MN. Estos parámetros incluyen el algoritmo de extracción de picos, el valor de sobrerecorrido máximo, el método de cálculo de similitud, etcétera. Realice los ajustes de parámetros adecuados según sea necesario. Haga clic en el botón Iniciar análisis en la parte inferior de la página para ejecutar la tarea.
  8. Una vez ejecutada la tarea, busque la tarea creada en la lista de tareas y haga clic en el nombre del servicio para ver los resultados del análisis. El sitio web proporciona diagramas MN, sustitutos, redes simbióticas y otra información relacionada.

Resultados

Se utilizó APB como organismo modelo para validar la viabilidad de la tecnología 2D-HPLC-MS junto con el método MN. Al importar los datos brutos de MS en el MN con los parámetros establecidos en los valores predeterminados, se generó un MN. MN es una estrategia computacional visual que visualiza todos los iones moleculares detectados en un experimento LC-MS-MS completo y las relaciones químicas entre estos iones moleculares13.

La MN se basa en los fragmentos secun...

Discusión

El objetivo principal de este experimento fue la optimización de un método parcial en el marco de la separación bidimensional de fases líquidas. Para lograr esto, un nuevo modulador de dilución en columna se integró a la perfección en el sistema de cromatografía líquida bidimensional (2D-LC). Este ajuste técnico fue de suma importancia, ya que elevó significativamente la competencia en el perfil de los constituyentes químicos presentes en la medicina tibetana conocida como APB. La incorporación de la tecnolo...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82130113), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82204765), la Fundación de Ciencias de la Naturaleza de Sichuan (2022NSFSC1470), el Proyecto de Financiación Especial Postdoctoral Provincial de Sichuan (TB2023020) y el Programa de Promoción de la Investigación Xinglin Scholars de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (BSH2021030). Estos fondos proporcionan apoyo en términos de equipos experimentales, materiales experimentales y tarifas de publicación.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileFisher chemicalF22M81203Mobile phase
Aconitum pendulum//Herb medicine
Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC Agilent TechnologiesG2198-90001Liquid chromatography
Disposable syringesChengdu Keen experimental equipment/1ml
EP tubeChengdu Keen experimental equipment/3ml
Liquid phase injection bottleChengdu Keen experimental equipment/1.5ml
LTQ XL Mass SpectrometerThermo FisherLTQ21991Mass Spectrometer
Microporous membranes Chengdu Keen experimental equipment/0.22μm
Ultimate XB-C18,5 μm,2.1 x 200 mmWelch00201-31015Reversed-phase column
Ultrasonic CleanerGT SonicUGT20DEC048YUltrasonic Cleaner 240W 40KHz
XAmide,3 μm,100ADalian Mondi TechnologyD2019110601Hydrophilic column

Referencias

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