A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
הפרוטוקול המפורט שלנו מתאר את היצירה והשימוש במודל מעי על שבב מתקדם, המדמה רירית מעיים אנושית עם מבנים תלת-ממדיים וסוגי תאים שונים, ומאפשר ניתוח מעמיק של תגובות חיסוניות ותפקודים תאיים בתגובה להתיישבות מיקרוביאלית.
פותח מודל מתקדם של מעי על שבב המשחזר מבנים אפיתל-ממדיים דמויי וילוס אורגנוטיפיים ודמויי קריפטה. המודל החיסוני כולל תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVEC), תאי אפיתל מעי Caco-2, מקרופאגים שוכנים ברקמות, ותאים דנדריטיים, המתארגנים בעצמם בתוך הרקמה, ומשקפים מאפיינים של רירית המעי האנושית. היבט ייחודי של פלטפורמה זו הוא יכולתה לשלב תאי חיסון ראשוניים אנושיים במחזור, מה שמשפר את הרלוונטיות הפיזיולוגית. המודל נועד לחקור את תגובת מערכת החיסון של המעי להתיישבות וזיהום חיידקיים ופטרייתיים. בשל גודל החלל המוגדל שלו, המודל מציע קריאות פונקציונליות מגוונות כגון בדיקות חלחול, שחרור ציטוקינים וחדירת תאי מערכת החיסון, והוא תואם למדידת אימונופלואורסנציה של מבנים תלת ממדיים הנוצרים על ידי שכבת תאי האפיתל. הוא מספק בזאת תובנות מקיפות על התמיינות תאים ותפקודם. פלטפורמת מעי-על-שבב הדגימה את הפוטנציאל שלה בהבהרת אינטראקציות מורכבות בין פונדקאיות של מיקרוביוטה חיה לבין רקמה מארחת אנושית בתוך פלטפורמת שבב ביולוגי מיקרופיזיולוגית.
מערכות איבר-על-שבב (OoC) מייצגות טכניקה מתפתחת של תרבית תאים תלת-ממדית המסוגלת לגשר על הפער בין תרבית תאים דו-ממדית קונבנציונלית לבין מודלים של בעלי חיים. פלטפורמות OoC מורכבות בדרך כלל מתא אחד או יותר המכילים תאים ספציפיים לרקמות הגדלים על מגוון רחב של פיגומים כגון ממברנות או הידרוג'לים1. המודלים מסוגלים לחקות פונקציה אורגנוטיפית מוגדרת אחת או יותר. משאבות מאפשרות זילוח מיקרופלואידי רציף של מדיום תרביות תאים לסילוק תוצרי פסולת תאית, אספקת גורמי תזונה וגדילה לשיפור התמיינות התא ויצירה מחדש של תנאים חיוניים in vivo. עם שילוב של תאי חיסון, מערכות OoC יכולות לחקות תגובה חיסונית אנושית במבחנה2. עד כה, מגוון....
פרוטוקול זה דורש גישה ל~20 מ"ל דם טרי לכל שבב ביולוגי מתורמים בריאים כדי לבודד מונוציטים אנושיים ראשוניים. כל התורמים נתנו הסכמה כתובה ומודעת להשתתף במחקר זה, אשר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי יינה (הרשאה מספר 2018-1052-BO). לפרטים על החומרים, עיין בטבלת החומרים. לפרטים על הרכב כל הפתרונות והמדיה, עיין בטבלה 1.
1. הערות כלליות לטיפול בשבבים ביולוגיים
תוצאות מייצגות אלה מראות את שכבות הרקמה הנפרדות של מודל המעי על שבב. הם מוכתמים immunofluorescent כמתואר בסעיף פרוטוקול 11. התמונות צולמו במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או פלואורסצנטי קונפוקלי כערימות z ועובדו להקרנה אורתוגונלית. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על ההגדרה והתוכנה המיקרוסקופית.......
הפרוטוקול המוצג מפרט את הצעדים הדרושים ליצירת מודל מעי על שבב חיסוני. תיארנו טכניקות ספציפיות ושיטות קריאה אפשריות כגון מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי, ניתוח ציטוקינים ומטבוליטים, ציטומטריית זרימה, ניתוח חלבונים וגנטיקה, ומדידת חדירות.
המודל המתואר מורכב מ- HUVECs ראשוניים, מק?.......
מ.ר. הוא מנכ"ל Dynamic42 GmbH ומחזיק במניות החברה. א.ס.מ היא יועצת מדעית של Dynamic 42 GmbH ומחזיקה במניות בחברה.
העבודה נתמכה כספית על ידי מרכז המחקר השיתופי PolyTarget 1278 (מספר פרויקט 316213987) ל- V.D.W. ו- A.S.M. A.F. ו- A.S.M. כמו כן, מכירים בתמיכה כספית על ידי אשכול המצוינות "איזון המיקרווורס" במסגרת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860. ברצוננו להודות לאסטריד טנרט ולמעבדת Jena Biophotonic and Imaging Laboratory (JBIL) על שסיפקו לנו גישה למיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי שלהם ZEISS LSM980. איור 1C ואיור 2 נוצרו עם Biorender.com.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
96-well plate black, clear bottom | Thermo Fisher | 10000631 | Consumables |
Acetic acid | Roth | 3738.4 | Chemicals |
Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 715-545-150 | Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining |
Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 711-605-152 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | Secondary Antibody Vascular Staining |
Axiocam ERc5s camera | Zeiss | 426540-9901-000 | Technical equipment |
Basal Medium MV, phenol red-free | Promocell | C-22225 | Cell culture consumables |
Biochip | Dynamic 42 | BC002 | Microfluidic consumables |
BSA fraction V | Gibco | 15260-037 | Cell culture consumables |
C2BBe1 (clone of Caco-2) | ATCC | CRL-2102 | Epithelial Cell Source |
Chloroform | Sigma | C2432 | Chemicals |
CO2 Incubator | Heracell | 150i | Technical equipment |
Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | Cell culture consumables |
Coverslips (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | Consumables |
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | Secondary Antibody Vascular Staining |
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | D3571 | Vascular and Epithelial Staining |
Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Cell culture consumables |
DMEM high glucose | Gibco | 41965-062 | Cell culture consumables |
DMEM high glucose w/o phenol red | Gibco | 31053028 | Cell culture consumables |
DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Cell culture consumables |
DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Cell culture consumables |
EDTA solution | Invitrogen | 15575-038 | Cell culture consumables |
Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | Cell culture consumables |
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | Cell culture consumables |
Ethanol 96%, undenatured | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Chemicals |
Fetal bovine Serum | invitrogen | 10270106 | Cell culture consumables |
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Chemicals |
Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | Chemicals |
Gentamycin (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | Cell culture consumables |
GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | Cell culture consumables |
Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell culture consumables |
Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Epithelial Staining |
Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma | Millipore | 616397 | Cell culture consumables |
Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Cell culture consumables |
Human recombinant M-CSF | Peprotech | 300-25 | Cell culture consumables |
Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | Fluorescence Microscope Setup |
Laser Scanning Microscope | Zeiss | CLSM980 | Fluorescence Microscope Setup |
Lidocain hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | Cell culture consumables |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630 | Cell culture consumables |
Loftex Wipes | Loftex | 1250115 | Consumables |
Low attachment tubes (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Consumables |
Luer adapter for the top cap (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Microfluidic consumables |
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | Microfluidic consumables |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140 | Cell culture consumables |
Methanol | Roth | 8388.2 | Chemicals |
Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | Fluorescence Microscope Setup |
Microscope slides | Menzel | MZ-0002 | Consumables |
Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Primary Antibody Vascular Staining |
Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Primary Antibody Epithelial Staining |
Multiskan Go plate reader | Thermo Fisher | 51119300 | Technical equipment |
Normal donkey serum | Biozol | LIN-END9010-10 | Chemicals |
Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | Fluorescence Microscope Setup |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Cell culture consumables |
Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Microfluidic consumables |
Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody | R&D Systems | AF938 | Primary Antibody Vascular Staining |
Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody | Dako | A0082 | Primary Antibody Vascular Staining |
Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Primary Antibody Epithelial Staining |
Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | Fluorescence Microscope Setup |
Primovert microscope | Zeiss | 415510-1101-000 | Technical equipment |
Reglo ICC peristaltic pump | Ismatec | ISM4412 | Technical equipment |
SAHA (Vorinostat) | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | Chemicals |
Saponin | Fluka | 47036 | Chemicals |
S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 01.1602 | Consumables |
S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | Consumables |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-088 | Cell culture consumables |
Tank 4.5 mL | ChipShop | 10000079 | Microfluidic consumables |
Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell culture consumables |
Trypsin | Gibco | 11538876 | Cell culture consumables |
Tubing | Dynamic 42 | ST001 | Microfluidic consumables |
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | Consumables |
Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | Epithelial Staining |
X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium |
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | Consumables |
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile | Greiner Bio-One | 657 160 | Consumables |
Zen Blue Software | Zeiss | Version 3.7 | Microscopy Software |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved