A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול המפורט שלנו מתאר את היצירה והשימוש במודל מעי על שבב מתקדם, המדמה רירית מעיים אנושית עם מבנים תלת-ממדיים וסוגי תאים שונים, ומאפשר ניתוח מעמיק של תגובות חיסוניות ותפקודים תאיים בתגובה להתיישבות מיקרוביאלית.

Abstract

פותח מודל מתקדם של מעי על שבב המשחזר מבנים אפיתל-ממדיים דמויי וילוס אורגנוטיפיים ודמויי קריפטה. המודל החיסוני כולל תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVEC), תאי אפיתל מעי Caco-2, מקרופאגים שוכנים ברקמות, ותאים דנדריטיים, המתארגנים בעצמם בתוך הרקמה, ומשקפים מאפיינים של רירית המעי האנושית. היבט ייחודי של פלטפורמה זו הוא יכולתה לשלב תאי חיסון ראשוניים אנושיים במחזור, מה שמשפר את הרלוונטיות הפיזיולוגית. המודל נועד לחקור את תגובת מערכת החיסון של המעי להתיישבות וזיהום חיידקיים ופטרייתיים. בשל גודל החלל המוגדל שלו, המודל מציע קריאות פונקציונליות מגוונות כגון בדיקות חלחול, שחרור ציטוקינים וחדירת תאי מערכת החיסון, והוא תואם למדידת אימונופלואורסנציה של מבנים תלת ממדיים הנוצרים על ידי שכבת תאי האפיתל. הוא מספק בזאת תובנות מקיפות על התמיינות תאים ותפקודם. פלטפורמת מעי-על-שבב הדגימה את הפוטנציאל שלה בהבהרת אינטראקציות מורכבות בין פונדקאיות של מיקרוביוטה חיה לבין רקמה מארחת אנושית בתוך פלטפורמת שבב ביולוגי מיקרופיזיולוגית.

Introduction

מערכות איבר-על-שבב (OoC) מייצגות טכניקה מתפתחת של תרבית תאים תלת-ממדית המסוגלת לגשר על הפער בין תרבית תאים דו-ממדית קונבנציונלית לבין מודלים של בעלי חיים. פלטפורמות OoC מורכבות בדרך כלל מתא אחד או יותר המכילים תאים ספציפיים לרקמות הגדלים על מגוון רחב של פיגומים כגון ממברנות או הידרוג'לים1. המודלים מסוגלים לחקות פונקציה אורגנוטיפית מוגדרת אחת או יותר. משאבות מאפשרות זילוח מיקרופלואידי רציף של מדיום תרביות תאים לסילוק תוצרי פסולת תאית, אספקת גורמי תזונה וגדילה לשיפור התמיינות התא ויצירה מחדש של תנאים חיוניים in vivo. עם שילוב של תאי חיסון, מערכות OoC יכולות לחקות תגובה חיסונית אנושית במבחנה2. עד כה, מגוון....

Protocol

פרוטוקול זה דורש גישה ל~20 מ"ל דם טרי לכל שבב ביולוגי מתורמים בריאים כדי לבודד מונוציטים אנושיים ראשוניים. כל התורמים נתנו הסכמה כתובה ומודעת להשתתף במחקר זה, אשר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי יינה (הרשאה מספר 2018-1052-BO). לפרטים על החומרים, עיין בטבלת החומרים. לפרטים על הרכב כל הפתרונות והמדיה, עיין בטבלה 1.

1. הערות כלליות לטיפול בשבבים ביולוגיים

  1. מפרידים בזהירות רצועת מאגרים ומנתקים את המכסים באמצעות סכין מחוממת לקבלת מאגרים ומכסים בודדים. הרחיבו את חור המכסה כך שצינור הסיליקון יתאים היטב.
  2. צינור הסיליקון הוא בעל קוטר פנימי של 0.5 מ"מ, הוא א-סימטר....

תוצאות

תוצאות מייצגות אלה מראות את שכבות הרקמה הנפרדות של מודל המעי על שבב. הם מוכתמים immunofluorescent כמתואר בסעיף פרוטוקול 11. התמונות צולמו במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או פלואורסצנטי קונפוקלי כערימות z ועובדו להקרנה אורתוגונלית. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על ההגדרה והתוכנה המיקרוסקופית.......

Discussion

הפרוטוקול המוצג מפרט את הצעדים הדרושים ליצירת מודל מעי על שבב חיסוני. תיארנו טכניקות ספציפיות ושיטות קריאה אפשריות כגון מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי, ניתוח ציטוקינים ומטבוליטים, ציטומטריית זרימה, ניתוח חלבונים וגנטיקה, ומדידת חדירות.

המודל המתואר מורכב מ- HUVECs ראשוניים, מק?.......

Disclosures

מ.ר. הוא מנכ"ל Dynamic42 GmbH ומחזיק במניות החברה. א.ס.מ היא יועצת מדעית של Dynamic 42 GmbH ומחזיקה במניות בחברה.

Acknowledgements

העבודה נתמכה כספית על ידי מרכז המחקר השיתופי PolyTarget 1278 (מספר פרויקט 316213987) ל- V.D.W. ו- A.S.M. A.F. ו- A.S.M. כמו כן, מכירים בתמיכה כספית על ידי אשכול המצוינות "איזון המיקרווורס" במסגרת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860. ברצוננו להודות לאסטריד טנרט ולמעבדת Jena Biophotonic and Imaging Laboratory (JBIL) על שסיפקו לנו גישה למיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי שלהם ZEISS LSM980. איור 1C ואיור 2 נוצרו עם Biorender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plate black, clear bottomThermo Fisher10000631Consumables
Acetic acidRoth3738.4Chemicals
Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L)Jackson Immuno Research715-545-150Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining
Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research711-605-152Secondary Antibody Epithelial Staining
Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenA31573Secondary Antibody Vascular Staining
Axiocam ERc5s cameraZeiss426540-9901-000Technical equipment
Basal Medium MV, phenol red-freePromocellC-22225Cell culture consumables
BiochipDynamic 42BC002Microfluidic consumables
BSA fraction VGibco15260-037Cell culture consumables
C2BBe1 (clone of Caco-2)ATCCCRL-2102Epithelial Cell Source
ChloroformSigmaC2432Chemicals
CO2 IncubatorHeracell150iTechnical equipment
Collagen IV from human placentaSigma-AldrichC5533Cell culture consumables
Coverslips (24 x 40 mm; #1.5)Menzel-Gläser15747592Consumables
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L)Jackson Immuno Research705-165-147Secondary Antibody Vascular Staining
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L)Jackson Immuno Research712-165-150Secondary Antibody Epithelial Staining
DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenD3571Vascular and Epithelial Staining
Descosept PURDr.Schuhmacher00-323-100Cell culture consumables
DMEM high glucoseGibco41965-062Cell culture consumables
DMEM high glucose w/o phenol redGibco31053028Cell culture consumables
DPBS (-/-)Gibco14190-169Cell culture consumables
DPBS (+/+)Gibco14040-133Cell culture consumables
EDTA solutionInvitrogen15575-038Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth MediumPromocellC-22020Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium supplement mixPromocellC-39225Cell culture consumables
Ethanol 96%, undenaturedNordbrand-Nordhausen410Chemicals
Fetal bovine Seruminvitrogen10270106Cell culture consumables
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa)Sigma AldrichFD4-100MGChemicals
Fluorescent Mounting MediumDakoS3023Chemicals
Gentamycin (10mg/mL)Sigma AldrichG1272Cell culture consumables
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050061Cell culture consumables
HistopaqueSigma-Aldrich10771Cell culture consumables
Hoechst (bisBenzimid) H33342Sigma-Aldrich14533Epithelial Staining
Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human PlasmaMillipore616397Cell culture consumables
Human recombinant GM-CSFPeprotech300-30Cell culture consumables
Human recombinant M-CSFPeprotech300-25Cell culture consumables
Illumination deviceZeissHXP 120 CFluorescence Microscope Setup
Laser Scanning MicroscopeZeissCLSM980Fluorescence Microscope Setup
Lidocain hydrochlorideSigma-AldrichL5647Cell culture consumables
Lipopolysaccharide (LPS)SigmaL2630Cell culture consumables
Loftex WipesLoftex1250115Consumables
Low attachment tubes (PS, 5 mL)Falcon352052Consumables
Luer adapter for the top cap (M)Mo Bi TecM3003Microfluidic consumables
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaqueMicrofluidic chipshop09-0556-0336-09Microfluidic consumables
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140Cell culture consumables
MethanolRoth8388.2Chemicals
MicroscopeZeissAxio Observer 5Fluorescence Microscope Setup
Microscope slidesMenzelMZ-0002Consumables
Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen14-0688-82Primary Antibody Vascular Staining
Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1)Sigma-Aldrich, MilliporeMABT26Primary Antibody Epithelial Staining
Multiskan Go plate readerThermo Fisher51119300Technical equipment
Normal donkey serumBiozolLIN-END9010-10Chemicals
Optical SectioningZeissApoTomeFluorescence Microscope Setup
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122Cell culture consumables
PlugsCole ParmerGZ-45555-56Microfluidic consumables
Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin AntibodyR&D SystemsAF938Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor AntibodyDakoA0082Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibodyThermo Fisher Scientific, Invitrogen61-7300Primary Antibody Epithelial Staining
Power Supply MicroscopeZeissEplax Vp232Fluorescence Microscope Setup
Primovert microscopeZeiss415510-1101-000Technical equipment
Reglo ICC peristaltic pumpIsmatecISM4412Technical equipment
SAHA (Vorinostat)Sigma AldrichSML0061-25MGChemicals
SaponinFluka47036Chemicals
S-Monovette, 7.5 mL Z-GelSarstedt01.1602Consumables
S-Monovette, 9.0 mL K3ESarstedt02.1066.001Consumables
Sodium PyruvateGibco11360-088Cell culture consumables
Tank 4.5 mLChipShop10000079Microfluidic consumables
Trypane blue stain 0.4%InvitrogenT10282Cell culture consumables
TrypsinGibco11538876Cell culture consumables
TubingDynamic 42ST001Microfluidic consumables
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)RothK343.1Consumables
Wheat Germ Agglutinin (WGA)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenW32464Epithelial Staining
X-VIVO 15LonzaBE02-060FCell culture consumables, Hematopoietic cell medium
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterileGreiner Bio-One662 160Consumables
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterileGreiner Bio-One657 160Consumables
Zen Blue SoftwareZeissVersion 3.7Microscopy Software

References

  1. Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
  2. Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. Functional integration of nat....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

HUVECCaco 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved