Immunkompetentes Darm-on-Chip-Modell zur Analyse der Immunantworten der Darmschleimhaut

Zusammenfassung

Unser detailliertes Protokoll beschreibt die Erstellung und Verwendung des fortschrittlichen Darm-on-Chip-Modells, das die menschliche Darmschleimhaut mit 3D-Strukturen und verschiedenen Zelltypen simuliert und eine eingehende Analyse von Immunantworten und zellulären Funktionen als Reaktion auf mikrobielle Besiedlung ermöglicht.

Zusammenfassung

Es wurde ein fortschrittliches Darm-on-Chip-Modell entwickelt, das epitheliale 3D-organotypische zottenartige und kryptenartige Strukturen nachbildet. Das immunkompetente Modell umfasst humane Nabelvenendothelzellen (HUVEC), Caco-2-Darmepithelzellen, geweberesidente Makrophagen und dendritische Zellen, die sich selbst im Gewebe organisieren und die Eigenschaften der menschlichen Darmschleimhaut widerspiegeln. Ein einzigartiger Aspekt dieser Plattform ist ihre Fähigkeit, zirkulierende menschliche primäre Immunzellen zu integrieren, was die physiologische Relevanz erhöht. Das Modell soll die Reaktion des intestinalen Immunsystems auf bakterielle und pilzliche Besiedlung und Infektion untersuchen. Aufgrund seiner vergrößerten Kavitätengröße bietet das Modell vielfältige funktionelle Messwerte wie Permeationsassays, Zytokinfreisetzung und Immunzellinfiltration und ist kompatibel mit der Immunfluoreszenzmessung von 3D-Strukturen, die von der Epithelzellschicht gebildet werden. Dabei bietet es umfassende Einblicke in die Zelldifferenzierung und -funktion. Die Darm-on-Chip-Plattform hat ihr Potenzial bei der Aufklärung komplexer Wechselwirkungen zwischen Surrogaten einer lebenden Mikrobiota und menschlichem Wirtsgewebe innerhalb einer mikrophysiologischen durchbluteten Biochip-Plattform unter Beweis gestellt.

Einleitung

Organ-on-Chip (OoC)-Systeme stellen eine aufstrebende Technik der 3D-Zellkultur dar, die in der Lage ist, die Lücke zwischen herkömmlichen 2D-Zellkulturen und Tiermodellen zu schließen. OoC-Plattformen bestehen in der Regel aus einem oder mehreren Kompartimenten, die gewebespezifische Zellen enthalten, die auf einer Vielzahl von Gerüsten wie Membranen oder Hydrogelen gezüchtet^{werden 1}. Die Modelle sind in der Lage, eine oder mehrere definierte organotypische Funktionen nachzuahmen. Pumpen ermöglichen die kontinuierliche mikrofluidische Perfusion von Zellkulturmedium zur Entfernung zellulärer Abfallprodukte, zur Versorgung mit Nährstoffen und Wa....

Protokoll

Dieses Protokoll erfordert den Zugang zu ~20 ml frischem Blut pro Biochip von gesunden Spendern, um primäre menschliche Monozyten zu isolieren. Alle Spenderinnen und Spender gaben eine schriftliche, informierte Einwilligung zur Teilnahme an dieser Studie, die von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Jena genehmigt wurde (Zulassungsnummer 2018-1052-BO). Weitere Informationen zu den Materialien finden Sie in der Materialtabelle. Einzelheiten zur Zusammensetzung aller Lösungen und Medien finden Sie in Tabelle 1.

1. Allgemeine Bemerkungen zur Handhabung von Biochips

1. Trennen S....

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Generierung eines immunkompetenten Darm-on-Chip-Modells. Wir haben spezifische Techniken und mögliche Auslesemethoden wie Immunfluoreszenzmikroskopie, Zytokin- und Metabolitenanalyse, Durchflusszytometrie, Protein- und Genanalyse sowie Permeabilitätsmessung beschrieben.

Das beschriebene Modell besteht aus primären HUVECs, Monozyten-abgeleiteten Makrophagen und von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen, die mit einer 3D.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate black, clear bottom	Thermo Fisher	10000631	Consumables
Acetic acid	Roth	3738.4	Chemicals
Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	715-545-150	Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining
Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	711-605-152	Secondary Antibody Epithelial Staining
Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A31573	Secondary Antibody Vascular Staining
Axiocam ERc5s camera	Zeiss	426540-9901-000	Technical equipment
Basal Medium MV, phenol red-free	Promocell	C-22225	Cell culture consumables
Biochip	Dynamic 42	BC002	Microfluidic consumables
BSA fraction V	Gibco	15260-037	Cell culture consumables
C2BBe1 (clone of Caco-2)	ATCC	CRL-2102	Epithelial Cell Source
Chloroform	Sigma	C2432	Chemicals
CO2 Incubator	Heracell	150i	Technical equipment
Collagen IV from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533	Cell culture consumables
Coverslips (24 x 40 mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592	Consumables
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	705-165-147	Secondary Antibody Vascular Staining
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	712-165-150	Secondary Antibody Epithelial Staining
DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	D3571	Vascular and Epithelial Staining
Descosept PUR	Dr.Schuhmacher	00-323-100	Cell culture consumables
DMEM high glucose	Gibco	41965-062	Cell culture consumables
DMEM high glucose w/o phenol red	Gibco	31053028	Cell culture consumables
DPBS (-/-)	Gibco	14190-169	Cell culture consumables
DPBS (+/+)	Gibco	14040-133	Cell culture consumables
EDTA solution	Invitrogen	15575-038	Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020	Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225	Cell culture consumables
Ethanol 96%, undenatured	Nordbrand-Nordhausen	410	Chemicals
Fetal bovine Serum	invitrogen	10270106	Cell culture consumables
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG	Chemicals
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023	Chemicals
Gentamycin (10mg/mL)	Sigma Aldrich	G1272	Cell culture consumables
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050061	Cell culture consumables
Histopaque	Sigma-Aldrich	10771	Cell culture consumables
Hoechst (bisBenzimid) H33342	Sigma-Aldrich	14533	Epithelial Staining
Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma	Millipore	616397	Cell culture consumables
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30	Cell culture consumables
Human recombinant M-CSF	Peprotech	300-25	Cell culture consumables
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C	Fluorescence Microscope Setup
Laser Scanning Microscope	Zeiss	CLSM980	Fluorescence Microscope Setup
Lidocain hydrochloride	Sigma-Aldrich	L5647	Cell culture consumables
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma	L2630	Cell culture consumables
Loftex Wipes	Loftex	1250115	Consumables
Low attachment tubes (PS, 5 mL)	Falcon	352052	Consumables
Luer adapter for the top cap (M)	Mo Bi Tec	M3003	Microfluidic consumables
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09	Microfluidic consumables
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140	Cell culture consumables
Methanol	Roth	8388.2	Chemicals
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5	Fluorescence Microscope Setup
Microscope slides	Menzel	MZ-0002	Consumables
Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	14-0688-82	Primary Antibody Vascular Staining
Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1)	Sigma-Aldrich, Millipore	MABT26	Primary Antibody Epithelial Staining
Multiskan Go plate reader	Thermo Fisher	51119300	Technical equipment
Normal donkey serum	Biozol	LIN-END9010-10	Chemicals
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome	Fluorescence Microscope Setup
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Cell culture consumables
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56	Microfluidic consumables
Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody	R&D Systems	AF938	Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody	Dako	A0082	Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	61-7300	Primary Antibody Epithelial Staining
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232	Fluorescence Microscope Setup
Primovert microscope	Zeiss	415510-1101-000	Technical equipment
Reglo ICC peristaltic pump	Ismatec	ISM4412	Technical equipment
SAHA (Vorinostat)	Sigma Aldrich	SML0061-25MG	Chemicals
Saponin	Fluka	47036	Chemicals
S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel	Sarstedt	01.1602	Consumables
S-Monovette, 9.0 mL K3E	Sarstedt	02.1066.001	Consumables
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-088	Cell culture consumables
Tank 4.5 mL	ChipShop	10000079	Microfluidic consumables
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	Cell culture consumables
Trypsin	Gibco	11538876	Cell culture consumables
Tubing	Dynamic 42	ST001	Microfluidic consumables
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1	Consumables
Wheat Germ Agglutinin (WGA)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	W32464	Epithelial Staining
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F	Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160	Consumables
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile	Greiner Bio-One	657 160	Consumables
Zen Blue Software	Zeiss	Version 3.7	Microscopy Software