用于分析肠道粘膜免疫反应的免疫活性肠芯片模型

摘要

我们的详细方案概述了高级肠芯片模型的创建和使用，该模型模拟具有 3D 结构和各种细胞类型的人类肠粘膜，能够深入分析响应微生物定植的免疫反应和细胞功能。

摘要

已经开发了一种先进的肠芯片模型，可重建上皮 3D 器官型绒毛样和隐窝样结构。免疫活性模型包括人脐静脉内皮细胞 （HUVEC）、Caco-2 肠上皮细胞、组织驻留巨噬细胞和树突状细胞，它们在组织内自组织，反映了人肠粘膜的特征。该平台的一个独特之处在于它能够整合循环的人类原代免疫细胞，增强生理相关性。该模型旨在研究肠道免疫系统对细菌和真菌定植和感染的反应。由于其扩大的腔体尺寸，该模型提供了多种功能读数，例如渗透分析、细胞因子释放和免疫细胞浸润，并且与上皮细胞层形成的 3D 结构的免疫荧光测量兼容。因此，它提供了对细胞分化和功能的全面见解。在微生理灌注生物芯片平台中，肠道芯片平台已证明其在阐明活微生物群的替代物与人类宿主组织之间的复杂相互作用方面的潜力。

引言

器官芯片 （OoC） 系统代表了一种新兴的 3D 细胞培养技术，能够弥合传统 2D 细胞培养和动物模型之间的差距。OoC 平台通常由一个或多个隔室组成，这些隔室包含在各种支架（如膜或水凝胶）上生长的组织特异性细胞¹。这些模型能够模拟一个或多个定义的器官型功能。泵能够对细胞培养基进行连续微流控灌流，以去除细胞废物，提供营养和生长因子以改善细胞分化，并重建必要的体内条件。随着免疫细胞的整合，OoC 系统可以在体外模拟人类免疫反应 ²。迄今为止，已经提出了广泛的器官和功能单位¹。这些系统包括脉管系统³（vaschorue）、肺⁴（lung）、肝脏²（h）^2,5和肠道⁶（intestine 6）的模型，可用于药物检测^5,7和感染研究^6,8。

研究方案

该方案要求每个生物芯片从健康供体那里获得 ~20 mL 的新鲜血液，以分离原代人单核细胞。所有捐献者都书面知情同意参与这项研究，该研究得到了耶拿大学医院伦理委员会的批准（许可号 2018-1052-BO）。有关材料的详细信息，请参阅 材料表。有关所有解决方案和介质的组成的详细信息，请参阅 表 1。

1. 一般生物芯片处理备注

1. 小心地分离一条储液槽，并使用加热的刀拆下盖子，以获得单个储液槽和盖子。加宽盖子的孔，使硅胶管紧密贴合。
2. 硅胶管的内径为 0.5 mm，不对称，由两个蠕动泵塞分隔成较长 （20 cm） 和较短 （12 cm） 的侧面。通过将管子连接到公鲁尔锁连接器和管子另一侧的盖子，每个生物芯片组装两个每种对称的管子。每个生物芯片还要组装四个储液槽。
   注：提前准备管路和储液槽，并在使用前通过高压灭菌进行消毒。由于硅胶管的使用寿命有限，请在 3-5 次实验后更换管。对于某些研究兴趣，例如药物测试，建议为每个实验准备新的管路。该协议的许多步骤并行运行;请参阅概述图，该图突出显示了在一天内执行的不同步骤，如图 2 所示。

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讨论

所提出的协议详细介绍了生成免疫活性肠芯片模型的必要步骤。我们描述了特定的技术和可能的读出方法，例如免疫荧光显微镜、细胞因子和代谢物分析、流式细胞术、蛋白质和遗传分析以及通透性测量。

所描述的模型由原代 HUVEC、单核细胞衍生的巨噬细胞和单核细胞衍生的树突状细胞组成，与代表粘液分泌、吸收、肠内分泌和 Paneth 细胞样群体的各个方面的肠上皮细胞 3D ?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate black, clear bottom	Thermo Fisher	10000631	Consumables
Acetic acid	Roth	3738.4	Chemicals
Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	715-545-150	Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining
Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	711-605-152	Secondary Antibody Epithelial Staining
Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A31573	Secondary Antibody Vascular Staining
Axiocam ERc5s camera	Zeiss	426540-9901-000	Technical equipment
Basal Medium MV, phenol red-free	Promocell	C-22225	Cell culture consumables
Biochip	Dynamic 42	BC002	Microfluidic consumables
BSA fraction V	Gibco	15260-037	Cell culture consumables
C2BBe1 (clone of Caco-2)	ATCC	CRL-2102	Epithelial Cell Source
Chloroform	Sigma	C2432	Chemicals
CO2 Incubator	Heracell	150i	Technical equipment
Collagen IV from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533	Cell culture consumables
Coverslips (24 x 40 mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592	Consumables
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	705-165-147	Secondary Antibody Vascular Staining
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	712-165-150	Secondary Antibody Epithelial Staining
DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	D3571	Vascular and Epithelial Staining
Descosept PUR	Dr.Schuhmacher	00-323-100	Cell culture consumables
DMEM high glucose	Gibco	41965-062	Cell culture consumables
DMEM high glucose w/o phenol red	Gibco	31053028	Cell culture consumables
DPBS (-/-)	Gibco	14190-169	Cell culture consumables
DPBS (+/+)	Gibco	14040-133	Cell culture consumables
EDTA solution	Invitrogen	15575-038	Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020	Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225	Cell culture consumables
Ethanol 96%, undenatured	Nordbrand-Nordhausen	410	Chemicals
Fetal bovine Serum	invitrogen	10270106	Cell culture consumables
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG	Chemicals
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023	Chemicals
Gentamycin (10mg/mL)	Sigma Aldrich	G1272	Cell culture consumables
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050061	Cell culture consumables
Histopaque	Sigma-Aldrich	10771	Cell culture consumables
Hoechst (bisBenzimid) H33342	Sigma-Aldrich	14533	Epithelial Staining
Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma	Millipore	616397	Cell culture consumables
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30	Cell culture consumables
Human recombinant M-CSF	Peprotech	300-25	Cell culture consumables
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C	Fluorescence Microscope Setup
Laser Scanning Microscope	Zeiss	CLSM980	Fluorescence Microscope Setup
Lidocain hydrochloride	Sigma-Aldrich	L5647	Cell culture consumables
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma	L2630	Cell culture consumables
Loftex Wipes	Loftex	1250115	Consumables
Low attachment tubes (PS, 5 mL)	Falcon	352052	Consumables
Luer adapter for the top cap (M)	Mo Bi Tec	M3003	Microfluidic consumables
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09	Microfluidic consumables
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140	Cell culture consumables
Methanol	Roth	8388.2	Chemicals
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5	Fluorescence Microscope Setup
Microscope slides	Menzel	MZ-0002	Consumables
Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	14-0688-82	Primary Antibody Vascular Staining
Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1)	Sigma-Aldrich, Millipore	MABT26	Primary Antibody Epithelial Staining
Multiskan Go plate reader	Thermo Fisher	51119300	Technical equipment
Normal donkey serum	Biozol	LIN-END9010-10	Chemicals
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome	Fluorescence Microscope Setup
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Cell culture consumables
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56	Microfluidic consumables
Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody	R&D Systems	AF938	Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody	Dako	A0082	Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	61-7300	Primary Antibody Epithelial Staining
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232	Fluorescence Microscope Setup
Primovert microscope	Zeiss	415510-1101-000	Technical equipment
Reglo ICC peristaltic pump	Ismatec	ISM4412	Technical equipment
SAHA (Vorinostat)	Sigma Aldrich	SML0061-25MG	Chemicals
Saponin	Fluka	47036	Chemicals
S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel	Sarstedt	01.1602	Consumables
S-Monovette, 9.0 mL K3E	Sarstedt	02.1066.001	Consumables
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-088	Cell culture consumables
Tank 4.5 mL	ChipShop	10000079	Microfluidic consumables
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	Cell culture consumables
Trypsin	Gibco	11538876	Cell culture consumables
Tubing	Dynamic 42	ST001	Microfluidic consumables
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1	Consumables
Wheat Germ Agglutinin (WGA)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	W32464	Epithelial Staining
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F	Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160	Consumables
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile	Greiner Bio-One	657 160	Consumables
Zen Blue Software	Zeiss	Version 3.7	Microscopy Software