نموذج الأمعاء على الرقاقة المناعي لتحليل الاستجابات المناعية المخاطية للأمعاء

Summary

يحدد بروتوكولنا التفصيلي إنشاء واستخدام نموذج الأمعاء على الرقاقة المتقدم ، والذي يحاكي الغشاء المخاطي المعوي البشري مع هياكل 3D وأنواع الخلايا المختلفة ، مما يتيح التحليل المتعمق للاستجابات المناعية والوظائف الخلوية استجابة للاستعمار الميكروبي.

Abstract

تم تطوير نموذج متقدم للأمعاء على الرقاقة يعيد إنشاء هياكل ظهارية 3D تشبه الزغابات العضوية وتشبه السرداب. يشمل نموذج الكفاءة المناعية الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC) ، والخلايا الظهارية المعوية Caco-2 ، والبلاعم المقيمة في الأنسجة ، والخلايا المتغصنة ، التي تنظم نفسها ذاتيا داخل الأنسجة ، وتعكس خصائص الغشاء المخاطي المعوي البشري. يتمثل أحد الجوانب الفريدة لهذه المنصة في قدرتها على دمج الخلايا المناعية الأولية البشرية المنتشرة ، مما يعزز الأهمية الفسيولوجية. تم تصميم النموذج للتحقيق في استجابة الجهاز المناعي المعوي للاستعمار والعدوى البكتيرية والفطرية. نظرا لحجم تجويفه الموسع ، يقدم النموذج قراءات وظيفية متنوعة مثل مقايسات التخلل ، وإطلاق السيتوكين ، وتسلل الخلايا المناعية ، وهو متوافق مع قياس التألق المناعي لهياكل 3D التي شكلتها طبقة الخلايا الظهارية. يوفر بموجب هذا رؤى شاملة حول تمايز الخلايا ووظيفتها. أثبتت منصة الأمعاء على الرقاقة إمكاناتها في توضيح التفاعلات المعقدة بين بدائل الجراثيم الحية والأنسجة المضيفة البشرية داخل منصة رقاقة حيوية فسيولوجية دقيقة.

Introduction

تمثل أنظمة Organ-on-Chip (OoC) تقنية ناشئة لثقافة الخلايا 3D القادرة على سد الفجوة بين زراعة الخلايا 2D التقليدية والنماذج الحيوانية. تتكون منصات OoC عادة من حجرة واحدة أو أكثر تحتوي على خلايا خاصة بالأنسجة تنمو على مجموعة واسعة من السقالات مثل الأغشية أو الهلاميات المائية¹. النماذج قادرة على محاكاة واحدة أو أكثر من وظائف النمط العضوي المحددة. تتيح المضخات التروية الدقيقة المستمرة لوسط زراعة الخلايا لإزالة الفضلات الخلوية ، وتزويدها بعوامل التغذية والنمو لتحسين التمايز الخلوي ، وإعادة إنشاء الظروف الأساسية في الجسم الحي. مع تكامل الخلايا المناعية ، يمكن لأنظمة OoC محاكاة الاستجابة المناعية البشرية في المختبر^2....

Protocol

يتطلب هذا البروتوكول الوصول إلى ~ 20 مل من الدم الطازج لكل رقاقة حيوية من المتبرعين الأصحاء لعزل الخلايا الوحيدة البشرية الأولية. أعطى جميع المتبرعين موافقة خطية مستنيرة للمشاركة في هذه الدراسة ، والتي تمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة جينا (رقم الإذن 2018-1052-BO). للحصول على تفاصيل حول المواد، راجع جدول المواد. للحصول على تفاصيل حول تكوين جميع الحلول والوسائط ، راجع الجدول 1.

1. ملاحظات عامة للتعامل مع الرقاقة الحيوية

1. افصل شريط من الخزانات بعناية وافصل الأغطية باستخدام سكين ساخن للحصول على خزانات وأغطية مفردة. قم بتوسيع فتحة الغطاء بحيث يتناسب أنبوب السيل....

النتائج

تظهر هذه النتائج التمثيلية طبقات الأنسجة المميزة لنموذج الأمعاء على الرقاقة. وهي ملطخة بالفلورسنت المناعي كما هو موضح في قسم البروتوكول 11. تم التقاط الصور باستخدام مجهر مضان أو مضان متحد البؤر كمداخن z ومعالجتها إلى إسقاط متعامد. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الإعداد ال?.......

Discussion

يفصل البروتوكول المقدم الخطوات اللازمة لتوليد نموذج الأمعاء على الرقاقة المناعي. وصفنا تقنيات محددة وطرق قراءات محتملة مثل الفحص المجهري المناعي ، وتحليل السيتوكين والأيض ، وقياس التدفق الخلوي ، والبروتين والتحليل الجيني ، وقياس النفاذية.

يتكون النموذج الموصوف من HUVECs ال?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate black, clear bottom	Thermo Fisher	10000631	Consumables
Acetic acid	Roth	3738.4	Chemicals
Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	715-545-150	Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining
Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	711-605-152	Secondary Antibody Epithelial Staining
Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A31573	Secondary Antibody Vascular Staining
Axiocam ERc5s camera	Zeiss	426540-9901-000	Technical equipment
Basal Medium MV, phenol red-free	Promocell	C-22225	Cell culture consumables
Biochip	Dynamic 42	BC002	Microfluidic consumables
BSA fraction V	Gibco	15260-037	Cell culture consumables
C2BBe1 (clone of Caco-2)	ATCC	CRL-2102	Epithelial Cell Source
Chloroform	Sigma	C2432	Chemicals
CO2 Incubator	Heracell	150i	Technical equipment
Collagen IV from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533	Cell culture consumables
Coverslips (24 x 40 mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592	Consumables
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	705-165-147	Secondary Antibody Vascular Staining
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	712-165-150	Secondary Antibody Epithelial Staining
DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	D3571	Vascular and Epithelial Staining
Descosept PUR	Dr.Schuhmacher	00-323-100	Cell culture consumables
DMEM high glucose	Gibco	41965-062	Cell culture consumables
DMEM high glucose w/o phenol red	Gibco	31053028	Cell culture consumables
DPBS (-/-)	Gibco	14190-169	Cell culture consumables
DPBS (+/+)	Gibco	14040-133	Cell culture consumables
EDTA solution	Invitrogen	15575-038	Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020	Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225	Cell culture consumables
Ethanol 96%, undenatured	Nordbrand-Nordhausen	410	Chemicals
Fetal bovine Serum	invitrogen	10270106	Cell culture consumables
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG	Chemicals
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023	Chemicals
Gentamycin (10mg/mL)	Sigma Aldrich	G1272	Cell culture consumables
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050061	Cell culture consumables
Histopaque	Sigma-Aldrich	10771	Cell culture consumables
Hoechst (bisBenzimid) H33342	Sigma-Aldrich	14533	Epithelial Staining
Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma	Millipore	616397	Cell culture consumables
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30	Cell culture consumables
Human recombinant M-CSF	Peprotech	300-25	Cell culture consumables
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C	Fluorescence Microscope Setup
Laser Scanning Microscope	Zeiss	CLSM980	Fluorescence Microscope Setup
Lidocain hydrochloride	Sigma-Aldrich	L5647	Cell culture consumables
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma	L2630	Cell culture consumables
Loftex Wipes	Loftex	1250115	Consumables
Low attachment tubes (PS, 5 mL)	Falcon	352052	Consumables
Luer adapter for the top cap (M)	Mo Bi Tec	M3003	Microfluidic consumables
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09	Microfluidic consumables
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140	Cell culture consumables
Methanol	Roth	8388.2	Chemicals
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5	Fluorescence Microscope Setup
Microscope slides	Menzel	MZ-0002	Consumables
Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	14-0688-82	Primary Antibody Vascular Staining
Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1)	Sigma-Aldrich, Millipore	MABT26	Primary Antibody Epithelial Staining
Multiskan Go plate reader	Thermo Fisher	51119300	Technical equipment
Normal donkey serum	Biozol	LIN-END9010-10	Chemicals
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome	Fluorescence Microscope Setup
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Cell culture consumables
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56	Microfluidic consumables
Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody	R&D Systems	AF938	Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody	Dako	A0082	Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	61-7300	Primary Antibody Epithelial Staining
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232	Fluorescence Microscope Setup
Primovert microscope	Zeiss	415510-1101-000	Technical equipment
Reglo ICC peristaltic pump	Ismatec	ISM4412	Technical equipment
SAHA (Vorinostat)	Sigma Aldrich	SML0061-25MG	Chemicals
Saponin	Fluka	47036	Chemicals
S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel	Sarstedt	01.1602	Consumables
S-Monovette, 9.0 mL K3E	Sarstedt	02.1066.001	Consumables
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-088	Cell culture consumables
Tank 4.5 mL	ChipShop	10000079	Microfluidic consumables
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	Cell culture consumables
Trypsin	Gibco	11538876	Cell culture consumables
Tubing	Dynamic 42	ST001	Microfluidic consumables
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1	Consumables
Wheat Germ Agglutinin (WGA)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	W32464	Epithelial Staining
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F	Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160	Consumables
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile	Greiner Bio-One	657 160	Consumables
Zen Blue Software	Zeiss	Version 3.7	Microscopy Software