ספקטרומטריית מסות טנדם ברזולוציה גבוהה לחקר מרכיבים כימיים של Gynura bicolor DC

Summary

אנו מתארים פרוטוקול כללי המשלב ניתוח ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה ועגינה מולקולרית במחקר הרפואה הסינית המסורתית.

Abstract

ההפרדה והניתוח של המרכיבים הכימיים הרצויים הם נושאים חשובים למחקר הבסיסי של הרפואה הסינית המסורתית (TCM). כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד Quadrupole זמן טיסה טנדם ספקטרומטריית מסה (UPLC-Q-TOF-MS/MS) הפכה בהדרגה לטכנולוגיה מובילה לזיהוי רכיבי TCM. Gynura bicolor DC. (BFH), צמח רב-שנתי ללא גזע המשמש לרפואה ולמזון בסין יש השפעות רפואיות כגון פינוי חום, הרטבת הריאה, הקלה על שיעול, פיזור קיפאון והקלה על נפיחות. פוליפנולים ופלבנואידים מכילים איזומרים רבים, המעכבים את זיהוי התרכובות המורכבות ב-BFH. מאמר זה מציג פרוטוקול שיטתי לחקר מרכיבים כימיים של BFH המבוסס על מיצוי ממס ונתונים משולבים באמצעות UPLC-Q-TOF-MS.

השיטה המתוארת כאן כוללת פרוטוקולים שיטתיים לטיפול מקדים בדגימה, כיול טרשת נפוצה, רכישת טרשת נפוצה, עיבוד נתונים וניתוח תוצאות. טיפול מקדים לדוגמה כולל איסוף, ניקוי, ייבוש, ריסוק ומיצוי. כיול טרשת נפוצה מורכב מתיקון רב-נקודתי וחד-נקודתי. עיבוד נתונים כולל ייבוא נתונים, הקמת שיטות, עיבוד ניתוח והצגת תוצאות. תוצאות מייצגות של דפוס הפיצול האופייני של חומצות פנוליות, אסטרים וגליקוזידים ב- Gynura bicolor DC. (BFH) מוצגות במאמר זה. בנוסף, בחירת ממס אורגני, מיצוי, שילוב נתונים, בחירת אנרגיית התנגשות ושיפור השיטה נדונים בפירוט. פרוטוקול אוניברסלי זה יכול להיות בשימוש נרחב לזיהוי תרכובות מורכבות ב- TCM.

Introduction

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) מיושמת קלינית בסין כבר אלפי שנים, והיא ממלאת תפקיד חיוני בשמירה על בריאותם של הסינים¹. הרכב ה-TCM מגוון ומורכב, וה-TCM דווח רבות במחקרים איכותניים רבים המתמקדים בהרכב הכימי². ניתן לחלק באופן גס את המרכיבים הכימיים ברפואה סינית מסורתית לקטגוריות הבאות כגון אלקלואידים, חומצות אורגניות, פנילפרופנואידים, קומרין, ליגננים, קווינונים, פלבנואידים, טרפנואידים, ספונינים טריטרפנואידים, ספונינים סטרואידים, גליקוזידים לבביים וטאנינים³. בהתחשב במספר הגדול של רכיבים לא ידועים ואיזומרים בלתי ניתנים להבחנה ב- TCM, ההפרדה והניתוח של המרכיבים הכימיים הרצויים הם נושאים חשובים למחקר הבסיסי של TCM⁴.

כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד Quadrupole זמן טיסה ספקטרומטריית מסה (UPLC-Q-TOF-MS) יושמה לניתוח חומרים ברפואה הסינית המסורתית (TCM), אשר ניתן להפריד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד ^5,6. הרזולוציה הגבוהה של MS יכולה לספק מידע יונים נרחב, המשמש לניתוח מסד נתונים עם שגיאה פחות מ 5 עמודים^{לדקה 7}. לאחר הפעלת אנרגיית ההתנגשות, מצב MS המשני יכול לקבל יוני פרגמנט משניים, שעוצמתם ומספרם מושפעים מגודל האנרגיה⁸.

Gynura bicolor DC. (BFH), צמח רב-שנתי חסר גזע שנמצא בשימוש נרחב לרפואה ולמזון (איור 1A), הוא צמח נדיר שנמצא בסכנת הכחדה ייחודי לסין⁹. BFH עשיר באנתוציאנינים, פוליפנולים, פלבנואידים ויכולת נוגדת חמצון חזקה¹⁰. ל-BFH יש השפעות רפואיות הכוללות פינוי חום, קירור דם, הרטבת ריאות, הקלה על שיעול, פיזור קיפאון, הקלה על נפיחות, הקלה על חום הקיץ וסילוק חום. מחקרים מעטים התמקדו בהרכב הכימי של BFH¹¹. פוליפנולים ופלבנואידים מכילים איזומרים רבים, מה שמקשה על זיהוי התרכובות המורכבות ב-BFH. יש לפתח שיטה אוניברסלית לזיהוי רכיבים כימיים, אשר ניתן ליישם על כל מיני TCM. מחקר זה נועד לדווח על פרוטוקול שיטתי לחקר מרכיבים כימיים של BFH המבוסס על מיצוי ממס ונתונים משולבים באמצעות UPLC-Q-TOF-MS.

Protocol

1. טיפול מקדים לדוגמה

1. לשטוף את כל העשב של BFH במים טהורים עד שאין פיקדונות גלויים וזיהומים. הניחו את ה-BFH הנקי בתבנית ולאחר מכן הכניסו אותו לתנור (איור 1B). מכוונים את התנור ל-50 מעלות למשך 24 שעות.
   הערה: כל המפעל של BFH נאסף במחוז סצ'ואן, סין.
2. למחוץ BFH מיובש במגרסה רב תכליתית במהירות גבוהה. העבירו את האבקה הגסה למסננת בעלת 50 רשתות (איור 1C). אספו את האבקה הדקה בשקית אטומה, ואחסנו אותה במגדל ייבוש.
3. שקלו במדויק שש דגימות BFH של 0.25 גרם כל אחת, והניחו אותן בשש צלוחיות חרוטיות. הוסיפו 30 מ"ל של ממס אורגני (50% אתנול-מים, 70% אתנול-מים, כלורופורם, אתר נפט, אתיל אצטט ו-n-בוטיל אלכוהול) לכל בקבוק חרוטי (איור 1D).
4. מעבירים את התערובת לסוניק אמבט אולטרסאונד למשך 30 דקות מיצוי ב-25°C. צנטריפוגה את הדגימה ב 14,000 x גרם במשך 5 דקות. הכינו מזרק הזרקה ומסנן קרום מיקרונקבובי אורגני 0.22 מיקרומטר. סננו את כל הסופרנאטנטים לבקבוקי דגימה של 2 מ"ל.

2. כיול טרשת נפוצה

1. באמצעות פיפטה בטווח של 1,000 μL, העבירו 500 μL של תמיסת נתרן הידרוקסידי 0.1 M לבקבוק נפחי של 100 מ"ל ולאחר מכן העבירו 450 μL של מים דה-יוניים או אולטרה-טהורים לבקבוק הנפח של 100 מ"ל (איור 2).
2. באמצעות פיפטה בטווח של 200 μL, הוסף 50 μL של חומצה פורמית לצלוחית נפחית של 100 מ"ל. צור נפח כולל של 100 מ"ל עם 90:10 2-פרופנול:מים, וסוניק את התמיסה במשך 5 דקות. תייגו את הבקבוק כתמיסת נתרן 0.5 מ"מ ב-90:10 2-פרופנול:מים ואחסנו אותה במקרר.
   הערה: תמיסת נתרן פורמט פג בעוד שבוע אחד בטמפרטורת החדר.
3. הפעל את תוכנת הבקרה UPLC-Q-TOF-MS ולאחר מכן פתח את חלון MS tune . בחלונית Sample Flow Control , קבעו 25 μL/min באפשרות Infusion Flow Rate ובחרו C באפשרות Reservoir . המתן כדקה לטיהור האוטומטי עד הסוף.
4. לחץ על Flow כפתור כדי להתחיל לספק פתרון פורמט נתרן. לחץ על כפתור חיובי כדי לעבור למצב יונים חיוביים, ולחץ על כפתור רגישות כדי לעבור למצב רגישות.
   הערה: המשך לשלב הבא עד שהפסגות האופייניות של פורמט נתרן יופיעו בחלון הספקטרום בזמן אמת.
5. בתוכנת הבקרה UPLC-Q-TOF-MS, פתח את חלון MS Console . במיקום השמאלי, בחר אפשרויות SYNAPT XS ו - Intellistart ברצף.
6. סמן את צור כיול ולחץ על לחצן התחל . לחץ על הבא כפתור ובחר פרופיל כיול בתפריט הנפתח. לחץ על כפתור הבא , ובחר את מצב רגישות בקוטביות חיובית . לחץ על הבא כוונון דף כפתורים, הבא והתחל בתורו.
7. עבור לחלון כוונון MS ולחץ על הלחצן שלילי כדי לעבור למצב יון שלילי. חזור לחלון MS Console .
8. סמן את צור כיול ולחץ על לחצן התחל . לחץ על הבא כפתור ובחר פרופיל כיול בתפריט הנפתח. לחץ על כפתור הבא , ובחר את מצב רגישות בקוטביות שלילית . לחץ על הבא כוונון דף כפתורים, הבא והתחל בתורו.
9. בלוח בקרת הזרימה של LockSpray , הגדר קצב זרימה של 50 μL/min ולחץ על כפתור Flow כדי לאפשר לתמיסת LE להיכנס לספקטרומטר המסות. עבור לחלון המנגינה של MS , סמן את הגדרת המקור של LockSpray ולחץ על לחצן התחל כדי להתחיל בכיול.

3. רכישת טרשת נפוצה

1. עבור לממשק הראשי ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על קובץ כניסה עמודה כדי לפתוח את שיטת הכרומטוגרפיה הנוזלית.
2. לחץ על כפתור הכניסה ולאחר מכן הגדר פרמטרים כולל זמן ריצה ומעבר צבע. לחץ על כפתור Autosampler ולאחר מכן הגדר פרמטרים כולל זמן ריצה, עמודה ודגימה. לחץ על להציל לחצן.
3. לחץ לחיצה ימנית על העמודה MS Method כדי לפתוח את שיטת ספקטרומטריית המסות.
4. לחץ על כפתור המידע ולאחר מכן הגדר פרמטרים כולל שעת סיום, קוטביות, מצב אנלייזר, מסה נמוכה, מסה גבוהה ואנרגיית התנגשות העברת רמפה. לחץ על בסדר כפתור ולאחר מכן על להציל לחצן.
5. מלא את טבלת הרצפים כולל שם הקובץ, בקבוקון וכרך. לחץ על להציל לחצן.
6. בחר את השורה בטבלת הרצף עבור המדגם שברצונך להפעיל. לחץ על כפתור הפעלה , ולחץ על בסדר כפתור בחלון שפשוט צץ.

4. עיבוד נתונים

1. הפעל את תוכנת ניתוח הנתונים. בעמודה העבודה שלי , לחץ על הלחצן Import MassLynx Data כדי לפתוח חלון חדש.
2. לחץ על כפתור סימן הפלוס , ובדוק את כל חמשת הקבצים הגולמיים מהמצב החיובי. הזינו שם קבוצה ולחצו על הלחצן Create UNIFI Sample Set כדי להתחיל בייבוא נתונים (איור 3A).
3. לחץ פעמיים על קובץ שיטת הניתוח במצב חיובי. לחץ על תווית עיבוד ולחץ על יעד לפי מסה כפתור. הזן את המספר של 5 עמודים לדקה בתיבת הקלט לאחר סובלנות התאמת יעד וסובלנות התאמת פרגמנט.
4. לחץ על כפתור הבית , ולחץ על כפתור Adducts . בחר את השורות של +H ו- +Na, ולחץ על הלחצן הימני בצורת חץ . לחצו על כפתור השמירה (איור 3B).
5. לחץ פעמיים על קובץ שיטת הניתוח במצב שלילי. לחץ על תווית עיבוד ולחץ על יעד לפי מסה כפתור. הזן את המספר של 5 דפים לדקה בתיבת הקלט לאחר סובלנות התאמת יעד וסובלנות התאמת שברים.
6. לחץ על כפתור הבית ולאחר מכן לחץ על כפתור Adducts . בחר את השורות של -H ו- +HCOO ולחץ על הלחצן הימני בצורת חץ . לחץ על להציל לחצן.
7. בעמודה העבודה שלי, לחץ על לחצן ניתוח כדי לפתוח חלון חדש. בחר את הנתונים שיובאו זה עתה ואת השיטה שנוצרה זה עתה ולאחר מכן לחץ על הבא לחצן. הזן את שם הקובץ. בחר את התיקיה שבה מאוחסנים נתוני הניתוח ולאחר מכן לחץ על לחצן סיום
8. לחצו על כפתור התהליך והמתינו כמה דקות עד שהתוצאות יופיעו (איור 3C).
9. העתק את טבלת התוצאות לטופס ריק (איור 3D).

5. ניתוח תוצאות

1. בחר מתחם בטבלת התוצאות. ספקטרום המסה המשני המתאים יוצג בפינה הימנית התחתונה (איור 4A).
2. לחצו על הכפתור בצורת טבלה ובחרו באפשרות High Energy Fragments כדי להציג את טבלת יוני המקטעים המשניים (איור 4B).
3. בחר יון שבר משני בטבלה. העבר את העכבר מעל שיא היונים המתאים לספקטרום המסה המשני, והשבר המבני המתאים יוצג על המסך (איור 4C).
   הערה: להעריך ידנית את סבירות הפיצוח שניתן על ידי התוכנה, ולהבחין בין איזומרים בהתבסס על יוני השבר המשניים.
4. צייר ידנית את תבנית הפיצול בתוכנת הציור.
   הערה: דוגמאות לדפוסי פיצול מתוארות בפירוט בסעיף תוצאות מייצגות.

תוצאות

זיהוי ההרכב הכימי של BFH שימש כמודל להצגת התוצאות המייצגות. כרומטוגרמות שיא בסיס של Gynura bicolor DC שחולץ ממס. מוצגים בקובץ משלים 1-משלים איור S1-S6, וזמן השמירה שנצפה (RT), שם הרכיב, הנוסחה, יחס המסה לטעינה (m/z) ושגיאת המסה מפורטים בטבלאות S1-S6. ב-ZBTK זוהו כל 35 סוגי התרכובות ...

Discussion

מלבד מרתח מים¹², מיצוי ממס אורגני הוא שיטה נפוצה נוספת של טיפול מקדים^{TCM 13}. על פי העיקרון של פירוק פאזה דומה, רכיבים רבים הופקו על ידי שילוב של ממיסים אורגניים שונים¹⁴. מיצוי בסיוע אולטראסוני הוא אחת השיטות העיקריות המשמשות להשגת רכיבי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
chloroform	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	CAS 67-66-3
ethanol	ChuandongChemical	CAS 64-17-5
ethyl acetate	ChuandongChemical	CAS 141-78-6
liquid chromatograph	Waters	ACQUITY Class 1 plus
MassLynx	Waters	V4.2	MS control software
n-butyl alcohol	ChuandongChemical	CAS 71-36-3
petroleum ether	ChuandongChemical	CAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometry	Waters	SYNAPT XS
UNIFI	Waters		Data analysis software