用于研究双色 DC 化学成分的高分辨率串联质谱法

摘要

我们描述了一种在中医研究中整合高分辨率质谱分析和分子对接的通用方案。

摘要

所需化学成分的分离和分析是中医 （TCM） 基础研究的重要课题。超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱法 （UPLC-Q-TOF-MS/MS） 已逐渐成为鉴定中药成分的领先技术。 双色 Gynura DC. （BFH） 是一种多年生无茎草本植物，在中国用于医药和食品，具有清热、润肺、止咳、散瘀、消肿等药用功效。多酚和类黄酮含有许多异构体，这阻碍了 BFH 中复杂化合物的鉴定。本文提出了一种基于溶剂萃取和通过 UPLC-Q-TOF-MS 整合数据研究 BFH 化学成分的系统方案。

此处描述的方法包括用于样品预处理、MS 校准、MS 采集、数据处理和结果分析的系统方案。样品预处理包括收集、清洁、干燥、粉碎和提取。MS 校准包括多点和单点校正。数据处理包括数据导入、方法构建、分析处理和结果呈现。本文介绍了 Gynura bicolor DC. （BFH） 中酚酸、酯和糖苷的典型碎裂模式的代表性结果。此外，还详细讨论了有机溶剂的选择、萃取、数据集成、碰撞能量选择和方法改进。这种通用方案可广泛用于鉴定中医中的复杂化合物。

引言

中医 （TCM） 在中国已有数千年的临床实践，它在维护中国人的健康方面发挥着至关重要的作用¹。中医的成分多样复杂，中医在许多以化学成分为重点的定性研究中被广泛报道²。中医中的化学成分大致可分为以下几类，如生物碱、有机酸、苯丙素类、香豆素、木脂素、醌类、黄酮类、萜类、三萜类皂苷、类固醇皂苷、强心苷和单宁³。鉴于中医中存在大量未知成分和难以区分的异构体，所需化学成分的分离和分析是中医⁴ 基础研究的重要课题。

超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法 （UPLC-Q-TOF-MS） 已用于分析中药 （TCM） 中的物质，可通过超高效液相色谱法分离 ^5,6。MS 的高分辨率可提供广泛的离子信息，用于数据库分析，误差小于 5 ppm⁷。开启碰撞能量后，二级 MS 模式可以获得二级碎片离子，其强度和数量受能量大小⁸ 的影响。

双色 Gynura DC. （BFH） 是一种多年生无茎草本植物，广泛用于医药和食品（图 1A），是中国特有的稀有濒危植物⁹。BFH 含有丰富的花青素、多酚、类黄酮和强大的抗氧化能力¹⁰。BFH 具有清热、凉血、润肺、止咳、散瘀、消肿、解暑、消暑、消暑等药效。很少有研究关注 BFH¹¹ 的化学成分。多酚和类黄酮含有许多异构体，这使得 BFH 中复杂化合物的鉴定变得困难。必须开发一种通用的化学成分鉴定方法，该方法可应用于各种中医。本研究旨在报告一种基于溶剂萃取和 UPLC-Q-TOF-MS 积分数据研究 BFH 化学成分的系统方案。

研究方案

1. 样品前处理

1. 用纯水清洗 BFH 的整个草药，直到没有可见的沉积物和杂质。将干净的 BFH 放入盘子中，然后将其放入烤箱中（图 1B）。将烤箱设置为 50 °C 24 小时。
   注:BFH 的整个工厂收集于中国四川省。
2. 在高速多功能破碎机中粉碎干燥的 BFH。将粗粉末转移到 50 目筛子中（图 1C）。将细粉收集在密封袋中，并储存在干燥塔中。
3. 准确称取 6 个 BFH 样品，每个样品 0.25 g，并将它们放入 6 个锥形瓶中。向每个锥形瓶中加入 30 mL 有机溶剂（50% 乙醇-水、70% 乙醇-水、氯仿、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）（图 1D）。
4. 将混合物转移到超声浴超声仪中，在 25 °C 下提取 30 分钟。 将样品以 14,000 x g 离心 5 分钟。准备注射注射器和 0.22 μm 有机微孔膜过滤器。将所有上清液过滤到 2 mL 样品瓶中。

2. MS 校准

1. 使用 1,000 μL 量程移液器，将 500 μL 0.1 M 氢氧化钠溶液转移至 100 mL 容量瓶中，然后将 450 μL 去离子水或超纯水转移至 100 mL 容量瓶中（图 2）。
2. 使用 200 μL 量程移液器，向 100 mL 容量瓶中加入 50 μL 甲酸。用 90:10 的 2-丙醇:水定总体积为 100 mL，并对溶液进行超声处理 5 分钟。将培养瓶标记为 0.5 mM 甲酸钠溶液，溶于 90:10 2-丙醇:水中 ，并将其储存在冰箱中。
   注:甲酸钠溶液在室温下 1 周后过期。
3. 启动 UPLC-Q-TOF-MS 控制软件，然后打开 MS 调谐 窗口。在" 样品流速" 面板中，在" 进样流速 "选项中设置 25 μL/min，并在 "储液槽 "选项中选择 C。等待大约 1 分钟，让自动清除结束。
4. 单击 Flow 按钮开始提供甲酸钠溶液。单击 正 按钮切换到正离子模式，然后单击 灵敏度 按钮切换到灵敏度模式。
   注:继续下一步，直到甲酸钠的特征峰出现在实时光谱窗口中。
5. 在 UPLC-Q-TOF-MS 控制软件中，打开 MS 控制台 窗口。在左侧位置，依次选择 SYNAPT XS 和 Intellistart 选项。
6. 勾选 创建校准，然后单击 Start 开始 按钮。单击 Next 按钮，然后在下拉菜单中选择 Calibration Profile 。点击 下一页 按钮，然后选择 灵敏度 模式 正 极性.依次单击 Next（下一步）、Tune Page（Tune 页面）、Next（下一步）和 Start（ 开始） 按钮。
7. 切换到 MS tune 窗口，然后单击 Negative（负离子）按钮切换到负离子模式。返回 MS Console 窗口。
8. 勾选 创建校准，然后单击 Start 开始 按钮。单击 Next 按钮，然后在下拉菜单中选择 Calibration Profile 。点击 下一个 按钮，然后选择 灵敏度 模式 在 负 极性.依次单击 Next（下一步）、Tune Page（Tune 页面）、Next（下一步）和 Start（ 开始） 按钮。
9. 在 LockSpray 流量控制面板 中，设置 50 μL/min 的流速，然后单击 "流量 "按钮，让 LE 溶液进入质谱仪。切换到 MS 调谐 窗口，勾选 LockSpray Source Setup，然后单击 Start 开始按钮开始校准。

3. MS 采集

1. 切换到主界面，右键点击 Inlet File 列，打开液相色谱法。
2. 单击 Inlet 按钮，然后设置参数，包括 Run time 和 Gradient。单击 Autosampler（自动进样器） 按钮，然后设置参数，包括 Run time（运行时）、Column（色谱柱）和 Sample（样品）。单击 Save 按钮。
3. 右键单击 MS 方法 列以打开质谱方法。
4. 单击 Information 按钮，然后设置参数，包括 End Time、Polarity、Analyser Mode、Low Mass、High Mass 和 Ramp Transfer Collision Energy。点击 OK 按钮，然后 优惠 按钮。
5. 填写序列表，包括文件名、样品瓶和体积。点击 Save 按钮。
6. 在序列表中选择要运行的示例的行。点击 运行 按钮，然后单击 OK 刚刚弹出的窗口中的按钮。

4. 数据处理

1. 启动数据分析软件。在 My Work（我的工作 ）列中，单击 Import MassLynx Data（导入 MassLynx 数据 ）按钮以打开一个新窗口。
2. 点击 加 签名 按钮，然后从正模式检查所有五个原始文件。输入组名称，然后单击" 创建 UNIFI 样品组 "按钮开始数据导入（图 3A）。
3. 在正模式下双击 Analysis Method 文件。单击 Processing 标签，然后单击 Target by Mass 按钮。在 Target match tolerance 和 Fragment match tolerance 之后的输入框中输入 5 ppm 的数量。
4. 单击 Home 按钮，然后单击 Adducts 按钮。选择 +H 和 +Na 行，然后单击 右侧的箭头形 按钮。单击 Save 按钮（图 3B）。
5. 在负模式下双击 Analysis Method 文件。单击 Processing 标签，然后单击 Target by Mass 按钮。在 Target match tolerance 和 Fragment match tolerance 之后的输入框中输入 5ppm 的数量。
6. 单击主页按钮，然后单击加 合 物按钮。选择 -H 和 +HCOO 行，然后单击 右侧箭头形状 的按钮。点击 Save 按钮。
7. 在 My Work 列中，单击 Analysis 按钮以打开一个新窗口。选择刚刚导入的数据和刚刚创建的方法，然后单击 Next 按钮。输入文件名。选择存储分析数据的文件夹，然后单击 完成 按钮
8. 单击 Process 按钮并等待几分钟，直到结果出现（图 3C）。
9. 将结果表复制到空白表单中（图 3D）。

5. 结果分析

1. 在结果表中选择一种化合物。相应的次级质谱将显示在右下角（图 4A）。
2. 单击 表格形状 的按钮，然后选择 High Energy Fragments 选项以显示二级碎片离子表（图 4B）。
3. 在表中选择二级碎片离子。将鼠标移动到对应于次级质谱的离子峰上，相应的结构裂缝将显示在屏幕上（图 4C）。
   注:手动评估软件给出的开裂合理性，并根据次级碎片离子区分异构体。
4. 在绘图软件中手动绘制碎裂图案。
   注意:代表性结果部分详细介绍了碎片模式的示例。

结果

以 BFH 的化学成分鉴定为模型，展示代表性结果。溶剂萃取的 Gynura bicolor DC 的基峰色谱图。如 补充文件 1-补充图 S1-S6 所示，观察到的保留时间 （RT）、组分名称、分子式、质荷比 （m/z） 和质量误差列于表 S1-S6 中。在 ZBTK 中，从 UPLC-TOF-MS 的分离峰中鉴定出所有 35 种化合物。如 补充文件 1-补充表 S1 所示，主要化学品包括酸（奎宁酸、DL-?...

讨论

除饮水¹² 外，有机溶剂萃取是中医前处理¹³ 的另一种常用方法。根据相似相溶解的原理，通过混合各种有机溶剂提取了许多成分¹⁴。超声辅助提取是 TCM¹⁵ 中用于获取成分的主要方法之一。超临界二氧化碳萃取适用于提取某些种类的物质，如木脂素¹⁶。此外，研究了离子液体 （IL） 中...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
chloroform	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	CAS 67-66-3
ethanol	ChuandongChemical	CAS 64-17-5
ethyl acetate	ChuandongChemical	CAS 141-78-6
liquid chromatograph	Waters	ACQUITY Class 1 plus
MassLynx	Waters	V4.2	MS control software
n-butyl alcohol	ChuandongChemical	CAS 71-36-3
petroleum ether	ChuandongChemical	CAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometry	Waters	SYNAPT XS
UNIFI	Waters		Data analysis software