Spectrométrie de masse en tandem haute résolution pour l’étude des constituants chimiques de Gynura bicolor DC

Résumé

Nous décrivons un protocole général qui intègre l’analyse par spectrométrie de masse à haute résolution et l’amarrage moléculaire dans la recherche en médecine traditionnelle chinoise.

Résumé

La séparation et l’analyse des composants chimiques souhaités sont des sujets importants pour la recherche fondamentale de la médecine traditionnelle chinoise (MTC). La chromatographie liquide à ultra-haute performance et la spectrométrie de masse en tandem quadripolaire à temps de vol (UPLC-Q-TOF-MS/MS) est progressivement devenue une technologie de pointe pour l’identification des ingrédients de la MTC. Gynura bicolor DC. (BFH), une plante vivace sans tige utilisée pour la médecine et l’alimentation en Chine, a des effets médicinaux tels que l’élimination de la chaleur, l’humidification des poumons, le soulagement de la toux, la dispersion de la stase et le soulagement de l’enflure. Les polyphénols et les flavonoïdes contiennent de nombreux isomères, ce qui entrave l’identification des composés complexes dans la BFH. Cet article présente un protocole systématique pour l’étude des constituants chimiques de la BFH basé sur l’extraction par solvant et les données intégrées via UPLC-Q-TOF-MS.

La méthode décrite ici comprend des protocoles systématiques pour le prétraitement des échantillons, l’étalonnage MS, l’acquisition MS, le traitement des données et l’analyse des résultats. Le prétraitement de l’échantillon comprend la collecte, le nettoyage, le séchage, le broyage et l’extraction. L’étalonnage MS consiste en une correction multipoint et monopoint. Le traitement des données comprend l’importation de données, l’établissement de méthodes, le traitement de l’analyse et la présentation des résultats. Des résultats représentatifs du modèle de fragmentation typique des acides phénoliques, des esters et des glycosides chez Gynura bicolor DC (BFH) sont présentés dans cet article. De plus, la sélection des solvants organiques, l’extraction, l’intégration des données, la sélection de l’énergie de collision et l’amélioration de la méthode sont discutées en détail. Ce protocole universel peut être largement utilisé pour identifier des composés complexes en MTC.

Introduction

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) est pratiquée cliniquement en Chine depuis des milliers d’années et joue un rôle essentiel dans le maintien de la santé des Chinois¹. La composition de la MTC est diverse et complexe, et la MTC a été largement rapportée dans de nombreuses études qualitatives axées sur la composition chimique². Les composants chimiques de la MTC peuvent être grossièrement divisés dans les catégories suivantes telles que les alcaloïdes, les acides organiques, les phénylpropanoïdes, les coumarines, les lignanes, les quinones, les flavonoïdes, les terpénoïdes, les saponines triterpénoïdes, les saponines stéroïdes, les glycosides cardiaques et les tanins³. Étant donné le grand nombre de composants inconnus et d’isomères indiscernables dans la MTC, la séparation et l’analyse des composants chimiques souhaités sont des sujets importants pour la recherche fondamentale de la MTC⁴.

La chromatographie liquide à ultra-haute performance et la spectrométrie de masse quadripolaire à temps de vol (UPLC-Q-TOF-MS) ont été appliquées pour analyser des substances de la médecine traditionnelle chinoise (MTC), qui peuvent être séparées par chromatographie liquide à ultra-haute performance ^5,6. La haute résolution de MS peut fournir des informations ioniques étendues, qui sont utilisées pour l’analyse de bases de données avec une erreur inférieure à 5 ppm⁷. Après avoir activé l’énergie de collision, le mode MS secondaire peut obtenir des ions de fragments secondaires, dont l’intensité et le nombre sont affectés par l’intensité de l’énergie⁸.

Gynura bicolor DC. (BFH), une plante vivace sans tige largement utilisée en médecine et en alimentation (Figure 1A), est une plante rare et menacée unique à la Chine⁹. BFH a une abondance d’anthocyanes, de polyphénols, de flavonoïdes et une forte capacité antioxydante¹⁰. BFH a des effets médicinaux, notamment l’élimination de la chaleur, le refroidissement du sang, l’humidification des poumons, le soulagement de la toux, la dispersion de la stase, le soulagement de l’enflure, le soulagement de la chaleur estivale et l’élimination de la chaleur. Peu d’études se sont concentrées sur la composition chimique de BFH¹¹. Les polyphénols et les flavonoïdes contiennent de nombreux isomères, ce qui rend difficile l’identification des composés complexes dans la BFH. Il faut développer une méthode universelle d’identification des composants chimiques, qui puisse être appliquée à tous les types de MTC. Cette étude visait à rendre compte d’un protocole systématique d’étude des constituants chimiques de la BFH basé sur l’extraction par solvant et les données intégrées via UPLC-Q-TOF-MS.

Protocole

1. Prétraitement de l’échantillon

1. Lavez toute l’herbe de BFH dans de l’eau pure jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de dépôts et d’impuretés visibles. Placez le BFH propre dans un plat, puis placez-le au four (Figure 1B). Réglez le four à 50 °C pendant 24 h.
   REMARQUE : La plante entière de BFH a été récoltée dans la province du Sichuan, en Chine.
2. Broyage séché BFH dans un broyeur multifonction à grande vitesse. Transférez la poudre grossière dans un tamis de 50 mailles (Figure 1C). Recueillez la poudre fine dans un sac hermétique et stockez-la dans une tour de séchage.
3. Pesez avec précision six échantillons BFH de 0,25 g chacun et placez-les dans six flacons coniques. Ajouter 30 mL de solvant organique (50 % d’éthanol dans l’eau, 70 % d’éthanol dans l’eau, de chloroforme, d’éther de pétrole, d’acétate d’éthyle et d’alcool n-butylique) dans chaque bouteille conique (figure 1D).
4. Transvaser le mélange dans un sonicateur à bain d’ultrasons pendant 30 min d’extraction à 25 °C. Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 5 min. Préparez une seringue d’injection et un filtre à membrane microporeuse organique de 0,22 μm. Filtrer tous les surnageants dans des flacons d’échantillon de 2 ml.

2. Étalonnage MS

1. À l’aide d’une pipette de 1 000 μL, transférez 500 μL de solution d’hydroxyde de sodium 0,1 M dans une fiole jaugée de 100 mL, puis transférez 450 μL d’eau désionisée ou ultrapure dans la fiole jaugée de 100 mL (figure 2).
2. À l’aide d’une pipette de 200 μL, ajouter 50 μL d’acide formique dans la fiole jaugée de 100 mL. Préparer un volume total de 100 mL avec du 2-propanol 90:10 et soniser la solution pendant 5 min. Étiquetez le ballon avec une solution de formiate de sodium de 0,5 mM dans du 2-propanol 90:10 et conservez-le au réfrigérateur.
   REMARQUE : La solution de formiate de sodium expire en 1 semaine à température ambiante.
3. Lancez le logiciel de contrôle UPLC-Q-TOF-MS, puis ouvrez la fenêtre MS tune . Dans le panneau de contrôle du débit d’échantillon , réglez 25 μL/min dans l’option Débit d’infusion et sélectionnez C dans l’option Réservoir . Attendez environ 1 min pour que la purge automatique soit terminée.
4. Cliquez sur le bouton Flow pour commencer à administrer la solution de formiate de sodium. Cliquez sur le bouton Positif pour passer en mode ion positif, puis cliquez sur le bouton Sensibilité pour passer en mode sensibilité.
   REMARQUE : Passez à l’étape suivante jusqu’à ce que les pics caractéristiques de formiate de sodium apparaissent sur la fenêtre de spectre en temps réel.
5. Dans le logiciel de contrôle UPLC-Q-TOF-MS, ouvrez la fenêtre MS Console . En position gauche, sélectionnez les options SYNAPT XS et Intellistart dans l’ordre.
6. Cochez la case Créer un étalonnage et cliquez sur le bouton Démarrer . Cliquez sur le bouton Suivant , puis sélectionnez Profil d’étalonnage dans le menu déroulant. Cliquez sur le bouton Suivant et sélectionnez le mode Sensibilité en polarité positive . Cliquez successivement sur les boutons Suivant, Régler la page, Suivant et Démarrer .
7. Basculez vers la fenêtre MS tune , puis cliquez sur le bouton Negative pour passer en mode ions négatifs. Revenez à la fenêtre MS Console .
8. Cochez la case Créer un étalonnage et cliquez sur le bouton Démarrer . Cliquez sur le bouton Suivant et sélectionnez Profil d’étalonnage dans le menu déroulant. Cliquez sur le bouton Suivant et sélectionnez le mode Sensibilité en polarité négative . Cliquez successivement sur les boutons Suivant, Régler la page, Suivant et Démarrer .
9. Dans le panneau de contrôle de débit LockSpray , réglez un débit de 50 μL/min et cliquez sur le bouton Débit pour laisser la solution LE entrer dans le spectromètre de masse. Passez à la fenêtre de réglage MS , cochez la configuration de la source LockSpray et cliquez sur le bouton Démarrer pour commencer l’étalonnage.

3. Acquisition de MS

1. Passez à l’interface principale et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la colonne Fichier d’entrée pour ouvrir la méthode de chromatographie liquide.
2. Cliquez sur le bouton Entrée , puis définissez les paramètres, notamment le temps d’exécution et le dégradé. Cliquez sur le bouton Échantillonneur automatique , puis définissez les paramètres, notamment le temps d’exécution, la colonne et l’échantillon. Cliquez sur le bouton Enregistrer .
3. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la colonne Méthode MS pour ouvrir la méthode de spectrométrie de masse.
4. Cliquez sur le bouton Informations , puis définissez les paramètres, notamment l’heure de fin, la polarité, le mode analyseur, la masse faible, la masse élevée et l’énergie de collision de transfert de rampe. Cliquez sur le bouton OK , puis sur le bouton Enregistrer .
5. Remplissez le tableau de séquence, y compris le nom du fichier, le flacon et le vol. Cliquez sur le bouton Enregistrer .
6. Sélectionnez la ligne de la table de séquence pour l’échantillon que vous souhaitez exécuter. Cliquez sur le bouton Exécuter , puis cliquez sur le bouton OK dans la fenêtre qui s’affiche.

4. Traitement des données

1. Lancez le logiciel d’analyse de données. Dans la colonne Mon travail , cliquez sur le bouton Importer des données MassLynx pour ouvrir une nouvelle fenêtre.
2. Cliquez sur le bouton du signe plus et vérifiez les cinq fichiers bruts en mode positif. Entrez un nom de groupe et cliquez sur le bouton Créer un jeu d’échantillons UNIFI pour lancer l’importation des données (Figure 3A).
3. Double-cliquez sur le fichier de la méthode d’analyse en mode positif. Cliquez sur l’étiquette Traitement , puis sur le bouton Cible par masse . Entrez le nombre de 5 ppm dans la zone de saisie après Tolérance de correspondance cible et Tolérance de correspondance de fragment.
4. Cliquez sur le bouton Accueil , puis sur le bouton Adduits . Sélectionnez les lignes +H et +Na, puis cliquez sur le bouton en forme de flèche droite . Cliquez sur le bouton Enregistrer (Figure 3B).
5. Double-cliquez sur le fichier de la méthode d’analyse en mode négatif. Cliquez sur l’étiquette Traitement , puis sur le bouton Cible par masse . Entrez le nombre de 5 ppm dans la zone de saisie après Tolérance de correspondance cible et Tolérance de correspondance de fragment.
6. Cliquez sur le bouton Accueil, puis sur le bouton Adduits . Sélectionnez les rangées -H et +HCOO et cliquez sur le bouton en forme de flèche droite . Cliquez sur le bouton Enregistrer .
7. Dans la colonne Mon travail, cliquez sur le bouton Analyse pour ouvrir une nouvelle fenêtre. Choisissez les données qui viennent d’être importées et la méthode qui vient d’être créée, puis cliquez sur le bouton Suivant. Entrez le nom du fichier. Sélectionnez le dossier dans lequel les données d’analyse sont stockées, puis cliquez sur le bouton Terminer
8. Cliquez sur le bouton Traiter et attendez quelques minutes jusqu’à ce que les résultats s’affichent (Figure 3C).
9. Copiez la table des résultats dans un formulaire vide (Figure 3D).

5. Analyse des résultats

1. Sélectionnez un composé dans la table des résultats. Le spectre de masse secondaire correspondant sera affiché dans le coin inférieur droit (Figure 4A).
2. Cliquez sur le bouton en forme de tableau et sélectionnez l’option Fragments de haute énergie pour afficher le tableau des ions de fragments secondaires (Figure 4B).
3. Sélectionnez un ion de fragment secondaire dans le tableau. Déplacez la souris sur le pic d’ions correspondant au spectre de masse secondaire, et la rupture structurelle correspondante s’affichera à l’écran (Figure 4C).
   REMARQUE : Évaluez manuellement le caractère raisonnable de la fissuration donnée par le logiciel et distinguez les isomères en fonction des ions de fragments secondaires.
4. Dessinez manuellement le motif de fragmentation dans le logiciel de dessin.
   REMARQUE : Des exemples de modèles de fragmentation sont décrits en détail dans la section des résultats représentatifs.

Résultats

L’identification de la composition chimique de la BFH a été utilisée comme modèle pour afficher les résultats représentatifs. Chromatogrammes de pointe de base de Gynura bicolor DC extrait par solvant. sont indiqués dans le fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S1-S6, et le temps de rétention observé (RT), le nom du composant, la formule, le rapport masse/charge (m/z) et l’erreur de masse sont répertoriés dans les tableaux S1-S6. Dans l...

Discussion

Outre la décoction d’eau¹², l’extraction par solvant organique est une autre méthode courante de prétraitement MTC¹³. Selon le principe de la dissolution de phase similaire, de nombreux composants ont été extraits par la combinaison de divers solvants organiques¹⁴. L’extraction assistée par ultrasons est l’une des principales méthodes utilisées pour obtenir des composants dans la MTC^...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
chloroform	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	CAS 67-66-3
ethanol	ChuandongChemical	CAS 64-17-5
ethyl acetate	ChuandongChemical	CAS 141-78-6
liquid chromatograph	Waters	ACQUITY Class 1 plus
MassLynx	Waters	V4.2	MS control software
n-butyl alcohol	ChuandongChemical	CAS 71-36-3
petroleum ether	ChuandongChemical	CAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometry	Waters	SYNAPT XS
UNIFI	Waters		Data analysis software