JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем общий протокол, который объединяет масс-спектрометрический анализ высокого разрешения и молекулярный докинг в исследованиях традиционной китайской медицины.

Аннотация

Разделение и анализ желаемых химических компонентов являются важными предметами для фундаментальных исследований традиционной китайской медицины (ТКМ). Сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография квадрупольная времяпролетная тандемная масс-спектрометрия (UPLC-Q-TOF-MS/MS) постепенно стала ведущей технологией для идентификации ингредиентов ТКМ. Gynura bicolor DC. (BFH), многолетнее бесстебельное травянистое растение, используемое в медицине и пищу в Китае, обладает лечебными эффектами, такими как снятие тепла, увлажнение легких, облегчение кашля, рассеивание стазиса и снятие отеков. Полифенолы и флавоноиды содержат многочисленные изомеры, которые затрудняют идентификацию сложных соединений в БФГ. В данной работе представлен систематический протокол изучения химических составляющих BFH на основе экстракции растворителем и интегрированных данных с помощью UPLC-Q-TOF-MS.

Описанный здесь метод включает в себя систематические протоколы предварительной обработки образца, калибровки МС, сбора МС, обработки данных и анализа результатов. Предварительная обработка образцов включает в себя сбор, очистку, сушку, дробление и экстракцию. Калибровка MS состоит из многоточечной и одноточечной коррекции. Обработка данных включает в себя импорт данных, установление метода, обработку анализа и представление результатов. В данной работе представлены репрезентативные результаты типичной картины фрагментации фенольных кислот, сложных эфиров и гликозидов в Gynura bicolor DC. (BFH). Кроме того, подробно обсуждаются выбор органических растворителей, экстракция, интеграция данных, выбор энергии столкновений и совершенствование метода. Этот универсальный протокол может быть широко использован для идентификации сложных соединений в ТКМ.

Введение

Традиционная китайская медицина (ТКМ) клинически практикуется в Китае на протяжении тысячелетий, и она играет жизненно важную роль в поддержании здоровья китайцев. Состав ТКМ разнообразен и сложен, и ТКМ широко освещалась во многих качественных исследованиях, посвященных химическомусоставу. Химические компоненты ТКМ можно условно разделить на следующие категории, такие как алкалоиды, органические кислоты, фенилпропаноиды, кумарины, лигнаны, хиноны, флавоноиды, терпеноиды, тритерпеноидные сапонины, стероидные сапонины, сердечные гликозиды и дубильныевещества. Учитывая большое количество неизвестных компонентов и неразличимых изомеров в ТКМ, разделение и анализ желаемых химических компонентов являются важными предметами для фундаментальных исследований ТКМ4.

Квадрупольная времяпролетная масс-спектрометрия (UPLC-Q-TOF-MS) была применена для анализа веществ в традиционной китайской медицине (ТКМ), которые могут быть разделены с помощью ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии 5,6. Высокое разрешение МС может предоставить обширную информацию об ионах, которая используется для анализа базы данных с погрешностью менее 5ppm7. После включения энергии столкновения во вторичной моде МС могут получаться вторичные осколочные ионы, на интенсивность и количество которых влияет величина энергии8.

Gynura bicolor DC. (BFH), многолетнее бесстебельное травянистое растение, широко используемое в медицине и в пищу (рис. 1A), является редким и исчезающим растением, уникальным для Китая9. BFH богат антоцианами, полифенолами, флавоноидами и обладает сильной антиоксидантной способностью10. BFH обладает лечебными эффектами, включая очищение от жары, охлаждение крови, увлажнение легких, облегчение кашля, рассеивание стаза, снятие отеков, облегчение летней жары и устранение жары. Немногие исследования были сосредоточены на химическом составе BFH11. Полифенолы и флавоноиды содержат многочисленные изомеры, что затрудняет идентификацию сложных соединений в БФГ. Необходимо разработать универсальный метод идентификации химических компонентов, который может быть применен ко всем видам ТКМ. Целью данного исследования было создание систематического протокола изучения химических составляющих BFH на основе экстракции растворителем и интегрированных данных с помощью UPLC-Q-TOF-MS.

протокол

1. Предварительная обработка образца

  1. Промойте всю траву БФГ в чистой воде до тех пор, пока не останется видимых отложений и загрязнений. Поместите чистый BFH в посуду, а затем поставьте в духовку (Рисунок 1B). Установите духовку на 50 °C на 24 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Весь завод BFH был собран в провинции Сычуань, Китай.
  2. Дробление высушенной BFH в высокоскоростной многофункциональной дробилке. Переложите крупный порошок в сито с плотностью 50 меш (рисунок 1C). Соберите мелкий порошок в герметичный пакет и храните его в сушильной башне.
  3. Аккуратно взвесьте шесть образцов BFH по 0,25 г каждый, и поместите их в шесть конических колб. Добавьте 30 мл органического растворителя (50% этанол-воды, 70% этанол-воды, хлороформа, петролейного эфира, этилацетата и н-бутилового спирта) в каждую коническую бутылку (Рисунок 1D).
  4. Перенесите смесь в ультразвуковой аппарат для ванны на 30 минут экстракции при температуре 25 °C. Центрифугируйте образец при давлении 14 000 x g в течение 5 минут. Подготовьте инъекционный шприц и органический микропористый мембранный фильтр 0,22 мкм. Отфильтруйте все надосадочные жидкости в флаконы объемом 2 мл для образцов.

2. Калибровка MS

  1. С помощью дозатора объемом 1 000 мкл переведите 500 мкл 0,1 М раствора гидроксида натрия в мерную колбу объемом 100 мл, а затем переведите 450 мкл деионизированной или сверхчистой воды в мерную колбу объемом 100 мл (рис. 2).
  2. С помощью дозатора объемом 200 мкл добавьте 50 мкл муравьиной кислоты в мерную колбу объемом 100 мл. Сделайте общий объем 100 мл с 2-пропанол:водой 90:10 и обрабатывайте раствор ультразвуком в течение 5 минут. Пометьте колбу как 0,5 мМ раствора формиата натрия в соотношении 90:10 2-пропанол:вода и храните в холодильнике.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Срок годности раствора формиата натрия истекает через 1 неделю при комнатной температуре.
  3. Запустите управляющее программное обеспечение UPLC-Q-TOF-MS, а затем откройте окно настройки MS . На панели «Управление потоком пробы » установите 25 μл/мин в параметре «Скорость потока инфузии » и выберите C в параметре «Резервуар ». Подождите около 1 минуты до окончания автоматической продувки.
  4. Нажмите на кнопку «Поток», чтобы начать подачу раствора формиата натрия. Нажмите на кнопку Положительный , чтобы переключиться в режим положительных ионов, и нажмите на кнопку Чувствительность , чтобы переключиться в режим чувствительности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переходите к следующему шагу до тех пор, пока характерные пики формиата натрия не появятся в окне спектра в реальном времени.
  5. В управляющем программном обеспечении UPLC-Q-TOF-MS откройте окно MS Console . В левой позиции последовательно выберите параметры SYNAPT XS и Intellistart .
  6. Отметьте галочкой « Создать калибровку» и нажмите кнопку « Пуск ». Нажмите кнопку «Далее » и выберите «Профиль калибровки » в раскрывающемся меню. Нажмите на кнопку «Далее » и выберите режим «Чувствительность » в поле «Положительная полярность». Нажимайте по очереди кнопки «Далее», «Страница настройки», «Далее» и «Пуск ».
  7. Переключитесь в окно MS tune и нажмите кнопку Negative, чтобы переключиться в режим отрицательных ионов. Вернитесь в окно MS Console .
  8. Отметьте галочкой « Создать калибровку» и нажмите кнопку « Пуск ». Нажмите кнопку «Далее » и выберите «Профиль калибровки » в раскрывающемся меню. Нажмите на кнопку «Далее » и выберите режим «Чувствительность » в разделе «Отрицательная полярность». Нажимайте по очереди кнопки «Далее», «Страница настройки», «Далее» и «Пуск ».
  9. На панели управления потоком LockSpray установите расход 50 μл/мин и нажмите кнопку Flow, чтобы раствор LE попал в масс-спектрометр. Переключитесь в окно настройки MS , отметьте галочкой настройку источника LockSpray и нажмите кнопку « Пуск », чтобы начать калибровку.

3. Получение MS

  1. Переключитесь на главный интерфейс и щелкните правой кнопкой мыши столбец «Входной файл », чтобы открыть метод жидкостной хроматографии.
  2. Нажмите на кнопку «Вход», а затем установите параметры, включая «Время выполнения» и «Градиент». Нажмите кнопку «Автосэмплер», а затем задайте параметры, включая «Время выполнения», «Столбец» и «Образец». Нажмите кнопку «Сохранить ».
  3. Щелкните правой кнопкой мыши столбец MS Method , чтобы открыть метод масс-спектрометрии.
  4. Нажмите кнопку « Информация », а затем установите параметры, включая «Время окончания», «Полярность», «Режим анализатора», «Малая масса», «Большая масса» и «Энергия коллизии при переходе на рампу». Нажмите кнопку OK , а затем кнопку Сохранить .
  5. Заполните таблицу последовательностей, включая имя файла, флакон и объем. Нажмите на кнопку «Сохранить ».
  6. Выберите строку в таблице последовательностей для образца, который требуется выполнить. Нажмите на кнопку «Выполнить », и нажмите на кнопку «ОК» в окне, которое просто выскочит.

4. Обработка данных

  1. Запустите программу для анализа данных. В столбце «Моя работа » нажмите кнопку «Импортировать данные MassLynx », чтобы открыть новое окно.
  2. Нажмите на кнопку со знаком плюса , и проверьте все пять raw-файлов из положительного режима. Введите имя группы и нажмите кнопку Create UNIFI Sample Set , чтобы начать импорт данных (рисунок 3A).
  3. Дважды кликните по файлу Analysis Method в положительном режиме. Нажмите на метку Processing и нажмите на кнопку Target by Mass . Введите число 5 ppm в поле ввода после Допуск целевого совпадения и Допуск совпадения фрагментов.
  4. Нажмите на кнопку « Домой » и нажмите на кнопку « Аддукты ». Выделите строки +H и +Na, и нажмите на правую кнопку в форме стрелки . Нажмите на кнопку «Сохранить » (рисунок 3B).
  5. Дважды кликните по файлу Метода анализа в негативном режиме. Нажмите на метку Processing и нажмите на кнопку Target by Mass . Введите число 5 ppm в поле ввода после Допуск целевого совпадения и Допуск совпадения фрагментов.
  6. Нажмите на кнопку «Домой», а затем нажмите на кнопку « Аддукты ». Выделите строки -H и +HCOO и нажмите на правую кнопку в форме стрелки . Нажмите на кнопку «Сохранить ».
  7. В столбце «Моя работа» нажмите на кнопку «Анализ», чтобы открыть новое окно. Выберите только что импортированные данные и только что созданный метод, а затем нажмите кнопку «Далее». Введите имя файла. Выберите папку, в которой хранятся данные анализа, а затем нажмите на кнопку «Готово»
  8. Нажмите кнопку «Обработать» и подождите несколько минут, пока не появятся результаты (Рисунок 3C).
  9. Скопируйте таблицу результатов в пустую форму (рисунок 3D).

5. Анализ результатов

  1. Выберите соединение в таблице результатов. Соответствующий вторичный масс-спектр будет отображаться в правом нижнем углу (рисунок 4А).
  2. Нажмите на кнопку в форме таблицы и выберите опцию High Energy Fragments , чтобы отобразить таблицу ионов вторичных фрагментов (рисунок 4B).
  3. Выберите ион вторичного фрагмента в таблице. Наведите мышь на ионный пик, соответствующий вторичному масс-спектру, и соответствующий структурный разрыв отобразится на экране (рис. 4C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вручную оцените обоснованность растрескивания, заданного программным обеспечением, и выделите изомеры на основе ионов вторичных фрагментов.
  4. Вручную нарисуйте шаблон фрагментации в программе для рисования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры шаблонов фрагментации подробно описаны в разделе репрезентативных результатов.

Результаты

Идентификация химического состава BFH была использована в качестве модели для отображения репрезентативных результатов. Базовые пиковые хроматограммы экстрагированной растворителем Gynura bicolor DC. показаны в Дополнительном файле 1-Дополнительный рисунок S1-S6

Обсуждение

Помимо водного отвара12, еще одним распространенным методомпредварительной обработки ТКМ является экстракция органическим растворителем. В соответствии с принципом растворения в аналогичной фазе путем комбинации различных органических р?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (82104881), Группой по наследованию и инновациям ТКМ по лечению иммунных заболеваний, Медицинским научно-исследовательским проектом Чунцина (совместный проект Комиссии по здравоохранению Чунцина и Бюро по науке и технике) (2022DBXM007), Специальным проектом по стимулированию и руководству производительностью Чунцинского научно-исследовательского института (cstc2022jxjl120005), Специальным проектом для Фонда постдокторантуры Чунцина (2022CQBSHTB3035), Программа старших медицинских талантов Чунцина для молодых людей и людей среднего возраста, Программа для научных учреждений Чунцина (независимый исследовательский проект No2022GDRC015).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
chloroformSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
ethanolChuandongChemicalCAS 64-17-5
ethyl acetateChuandongChemicalCAS 141-78-6
liquid chromatographWatersACQUITY Class 1 plus
MassLynxWatersV4.2MS control software
n-butyl alcoholChuandongChemicalCAS 71-36-3
petroleum etherChuandongChemicalCAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometryWatersSYNAPT XS
UNIFIWatersData analysis software

Ссылки

  1. Lin, P., et al. Qualitative and quantitative analysis of the chemical profile for gualou-xiebai-banxia decoction, a classical traditional chinese medicine formula for the treatment of coronary heart disease, by uplc-q/tof-ms combined with chemometric analysis. J Pharm Biomed Anal. 197, 113950 (2021).
  2. Hui, D., et al. Uplc-q-tof/ms-based metabolomic studies on the toxicity mechanisms of traditional chinese medicine chuanwu and the detoxification mechanisms of gancao, baishao, and ganjiang. Chinese J Nat Med. 13 (9), 687-698 (2015).
  3. Newman, D. J. Modern traditional chinese medicine: Identifying, defining and usage of tcm components. Adv Pharmacol. 87, 113-158 (2020).
  4. Liu, S., Yi, L. Z., Liang, Y. Z. Traditional chinese medicine and separation science. J Sep Sci. 31 (11), 2113-2137 (2008).
  5. Yuan, L., et al. Rapid classification and identification of complex chemical compositions in traditional chinese medicine based on uplc-q-tof/ms coupled with data processing techniques using the kudiezi injection as an example. Anal Methods. 7 (12), 5210-5217 (2015).
  6. Wang, F., et al. Hplc coupled with chemical fingerprinting for multi-pattern recognition for identifying the authenticity of clematidis armandii caulis. JoVE. (189), e64690 (2022).
  7. Gao, Y., et al. Ultra high-performance liquid chromatography-mass spectrometry and self-established database analysis of chinese herbal medicine components. JoVE. (201), e66091 (2023).
  8. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE. (193), e65054 (2023).
  9. Wang, Y., et al. Comparison of morphological and physiological characteristics in two phenotypes of a rare and endangered plant, begonia fimbristipula hance. Photosynthetica. 54, 381-389 (2016).
  10. Zhang, P., et al. Response of population canopy color gradation skewed distribution parameters of the rgb model to micrometeorology environment in begonia fimbristipula hance. Atmosphere. 13 (6), 890 (2022).
  11. Yu, L., Ning, L., Youzhen, D. Studies on microwave extraction of the pigment from begonia fimbristipula hance. Guangdong Trace Elements Science. 11 (10), 60-63 (2004).
  12. Xiao, Q., et al. Novel fusion protein consisting of metallothionein, cellulose binding module, and superfolder gfp for lead removal from the water decoction of traditional chinese medicine. ACS Omega. 5 (6), 2893-2898 (2020).
  13. Huang, H., et al. Using multiple light scattering to examine the stability of phyllanthus emblica l. Extracts obtained with different extraction methods. JoVE. (194), e65130 (2023).
  14. Miao, W. G., Tang, C., Ye, Y., Quinn, R. J., Feng, Y. Traditional chinese medicine extraction method by ethanol delivers drug-like molecules. Chin J Nat Med. 17 (9), 713-720 (2019).
  15. Olejar, K. J., et al. Ultrasonic-assisted extraction of cannabidiolic acid from cannabis biomass. JoVE. (183), e63076 (2022).
  16. Zhu, H. Y., et al. Sedative and hypnotic effects of supercritical carbon dioxide fluid extraction from schisandra chinensis in mice. J Food Drug Anal. 24 (4), 831-838 (2016).
  17. Lin, X., Wang, Y., Liu, X., Huang, S., Zeng, Q. Ils-based microwave-assisted extraction coupled with aqueous two-phase for the extraction of useful compounds from chinese medicine. Analyst. 137 (17), 4076-4085 (2012).
  18. Wu, T., Lv, H., Wang, F., Wang, Y. Characterization of polyphenols from lycium ruthenicum fruit by uplc-q-tof/mse and their antioxidant activity in caco-2 cells. J Agric Food Chem. 64 (11), 2280-2288 (2016).
  19. Distler, U., et al. Drift time-specific collision energies enable deep-coverage data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 11 (2), 167-170 (2014).
  20. Sawada, Y., et al. Widely targeted metabolomics based on large-scale ms/ms data for elucidating metabolite accumulation patterns in plants. Plant Cell Physiol. 50 (1), 37-47 (2009).
  21. Zhang, X. M., et al. Data-dependent acquisition based high-resolution mass spectrum for trace alternaria mycotoxin analysis and sulfated metabolites identification. Food Chem. 364, 130450 (2021).
  22. Downard, K. M. Indirect study of non-covalent protein complexes by maldi mass spectrometry: Origins, advantages, and applications of the "intensity-fading" approach. Mass Spectrom Rev. 35 (5), 559-573 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Gynura bicolor DCUPLC Q TOF MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены