Spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione per lo studio dei costituenti chimici della ginenura bicolore DC

Riepilogo

Descriviamo un protocollo generale che integra l'analisi della spettrometria di massa ad alta risoluzione e il docking molecolare nella ricerca sulla medicina tradizionale cinese.

Abstract

La separazione e l'analisi dei componenti chimici desiderati sono argomenti importanti per la ricerca fondamentale della medicina tradizionale cinese (MTC). La cromatografia liquida ad altissime prestazioni con spettrometria di massa tandem a tempo di volo a quadrupolo (UPLC-Q-TOF-MS/MS) è diventata gradualmente una tecnologia leader per l'identificazione degli ingredienti della MTC. Gynura bicolor DC. (BFH), un'erba perenne senza stelo utilizzata per la medicina e il cibo in Cina, ha effetti medicinali come eliminare il calore, inumidire i polmoni, alleviare la tosse, disperdere la stasi e alleviare il gonfiore. I polifenoli e i flavonoidi contengono numerosi isomeri, che ostacolano l'identificazione dei composti complessi nel BFH. Questo articolo presenta un protocollo sistematico per lo studio dei costituenti chimici del BFH basato sull'estrazione con solvente e su dati integrati tramite UPLC-Q-TOF-MS.

Il metodo qui descritto include protocolli sistematici per il pretrattamento dei campioni, la calibrazione MS, l'acquisizione MS, l'elaborazione dei dati e l'analisi dei risultati. Il pretrattamento del campione comprende la raccolta, la pulizia, l'essiccazione, la frantumazione e l'estrazione. La calibrazione MS consiste nella correzione multipunto e a punto singolo. L'elaborazione dei dati include l'importazione dei dati, la definizione del metodo, l'elaborazione dell'analisi e la presentazione dei risultati. In questo articolo vengono presentati i risultati rappresentativi del tipico modello di frammentazione degli acidi fenolici, degli esteri e dei glicosidi nella Gynura bicolor DC. (BFH). Inoltre, vengono discussi in dettaglio la selezione dei solventi organici, l'estrazione, l'integrazione dei dati, la selezione dell'energia di collisione e il miglioramento del metodo. Questo protocollo universale può essere ampiamente utilizzato per identificare composti complessi nella MTC.

Introduzione

La medicina tradizionale cinese (MTC) è stata praticata clinicamente in Cina per migliaia di anni e svolge un ruolo vitale nel mantenimento della salute del popolo cinese¹. La composizione della MTC è varia e complessa e la MTC è stata ampiamente riportata in molti studi qualitativi incentrati sulla composizione chimica². I componenti chimici della MTC possono essere approssimativamente suddivisi nelle seguenti categorie come alcaloidi, acidi organici, fenilpropanoidi, cumarine, lignani, chinoni, flavonoidi, terpenoidi, saponine triterpenoidi, saponine steroidee, glicosidi cardiaci e tannini³. Dato il gran numero di componenti sconosciuti e isomeri indistinguibili nella MTC, la separazione e l'analisi dei componenti chimici desiderati sono argomenti importanti per la ricerca fondamentale della MTC⁴.

La cromatografia liquida ad altissime prestazioni con spettrometria di massa a tempo di volo a quadrupolo (UPLC-Q-TOF-MS) è stata applicata per analizzare sostanze nella medicina tradizionale cinese (MTC), che possono essere separate mediante cromatografia liquida ad altissima prestazione ^5,6. L'alta risoluzione della MS può fornire ampie informazioni sugli ioni, che vengono utilizzate per l'analisi del database con errore inferiore a 5 ppm⁷. Dopo aver attivato l'energia di collisione, la modalità MS secondaria può ottenere ioni frammento secondario, la cui intensità e numero sono influenzati dalla grandezza dell'energia⁸.

Gynura bicolor DC. (BFH), un'erba perenne senza stelo ampiamente utilizzata per la medicina e l'alimentazione (Figura 1A), è una pianta rara e in via di estinzione unica in Cina⁹. BFH ha abbondanti antociani, polifenoli, flavonoidi e una forte capacità antiossidante¹⁰. Il BFH ha effetti medicinali tra cui eliminare il calore, raffreddare il sangue, inumidire i polmoni, alleviare la tosse, disperdere la stasi, alleviare il gonfiore, alleviare il caldo estivo ed eliminare il calore. Pochi studi si sono concentrati sulla composizione chimica del BFH¹¹. I polifenoli e i flavonoidi contengono numerosi isomeri, che rendono difficile l'identificazione dei composti complessi nel BFH. È necessario sviluppare un metodo universale per l'identificazione dei componenti chimici, che possa essere applicato a tutti i tipi di MTC. Questo studio mirava a riportare un protocollo sistematico per lo studio dei costituenti chimici del BFH basato sull'estrazione con solvente e dati integrati tramite UPLC-Q-TOF-MS.

Protocollo

1. Pretrattamento del campione

1. Lavare l'intera erba di BFH in acqua pura fino a quando non ci sono depositi visibili e impurità. Mettere il BFH pulito in una pirofila e poi metterlo in forno (Figura 1B). Impostare il forno a 50 °C per 24 ore.
   NOTA: L'intera pianta di BFH è stata raccolta nella provincia del Sichuan, in Cina.
2. Frantumare il BFH essiccato in un frantoio multifunzionale ad alta velocità. Trasferire la polvere grossolana in un setaccio da 50 maglie (Figura 1C). Raccogli la polvere fine in un sacchetto ermetico e conservala in una torre di essiccazione.
3. Pesare con precisione sei campioni di BFH da 0,25 g ciascuno e metterli in sei matracci conici. Aggiungere 30 ml di solvente organico (50% etanolo-acqua, 70% etanolo-acqua, cloroformio, etere di petrolio, acetato di etile e alcool n-butilico) a ciascun flacone conico (Figura 1D).
4. Trasferire la miscela in un sonicatore da bagno ad ultrasuoni per 30 minuti di estrazione a 25 °C. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 5 minuti. Preparare una siringa per iniezione e un filtro a membrana microporosa organica da 0,22 μm. Filtrare tutti i surnatanti in flaconi da 2 mL.

2. Calibrazione MS

1. Utilizzando una pipetta da 1.000 μl, trasferire 500 μl di soluzione di idrossido di sodio 0,1 M in un matraccio tarato da 100 mL e quindi trasferire 450 μl di acqua deionizzata o ultrapura nel pallone tarato da 100 mL (Figura 2).
2. Utilizzando una pipetta da 200 μl, aggiungere 50 μl di acido formico al matraccio tarato da 100 ml. Produrre un volume totale di 100 ml con 90:10 2-propanolo:acqua e sonicare la soluzione per 5 minuti. Etichettare il matraccio come soluzione di formiato di sodio 0,5 mM in acqua 90:10 2-propanolo e conservarlo in frigorifero.
   NOTA: La soluzione di formiato di sodio scade dopo 1 settimana a temperatura ambiente.
3. Avviare il software di controllo UPLC-Q-TOF-MS e quindi aprire la finestra MS tune . Nel pannello di controllo del flusso del campione , impostare 25 μl/min nell'opzione Portata di infusione e selezionare C nell'opzione Serbatoio . Attendere circa 1 minuto per lo spurgo automatico fino alla fine.
4. Fare clic sul pulsante Flusso per iniziare a erogare la soluzione di formiato di sodio. Fare clic sul pulsante Positivo per passare alla modalità ioni positivi e fare clic sul pulsante Sensibilità per passare alla modalità di sensibilità.
   NOTA: Procedere al passaggio successivo fino a quando i picchi caratteristici del formiato di sodio non vengono visualizzati nella finestra dello spettro in tempo reale.
5. Nel software di controllo UPLC-Q-TOF-MS, aprire la finestra MS Console . Nella posizione sinistra, selezionare le opzioni SYNAPT XS e Intellistart in sequenza.
6. Spuntare Crea calibrazione e fare clic sul pulsante Start . Fare clic sul pulsante Avanti e selezionare Profilo di calibrazione nel menu a discesa. Fare clic sul pulsante Avanti e selezionare la modalità Sensibilità in Polarità positiva . Fare clic sui pulsanti Avanti, Sintonizza pagina, Avanti e Avvia a turno.
7. Passa alla finestra MS tune e fai clic sul pulsante Negativo per passare alla modalità ioni negativi. Torna alla finestra di MS Console .
8. Spuntare Crea calibrazione e fare clic sul pulsante Start . Fare clic sul pulsante Avanti e selezionare Profilo di calibrazione nel menu a discesa. Fare clic sul pulsante Avanti e selezionare la modalità Sensibilità in polarità negativa . Fare clic sui pulsanti Avanti, Sintonizza pagina, Avanti e Avvia a turno.
9. Nel pannello di controllo del flusso LockSpray , impostare una portata di 50 μl/min e fare clic sul pulsante Flusso per consentire alla soluzione LE di entrare nello spettrometro di massa. Passa alla finestra MS tune , seleziona LockSpray Source Setup e fai clic sul pulsante Avvia per iniziare la calibrazione.

3. Acquisizione di MS

1. Passa all'interfaccia principale e fai clic con il pulsante destro del mouse sulla colonna File di ingresso per aprire il metodo di cromatografia liquida.
2. Fare clic sul pulsante Ingresso e quindi impostare i parametri tra cui il tempo di esecuzione e il gradiente. Fare clic sul pulsante Autocampionatore e quindi impostare i parametri tra cui Tempo di esecuzione, Colonna e Campione. Fare clic sul pulsante Salva .
3. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla colonna Metodo MS per aprire il metodo di spettrometria di massa.
4. Fare clic sul pulsante Informazioni e quindi impostare i parametri tra cui l'ora di fine, la polarità, la modalità analizzatore, la massa bassa, la massa elevata e l'energia di collisione del trasferimento della rampa. Fare clic sul pulsante OK e quindi sul pulsante Salva .
5. Compila la tabella delle sequenze, incluso il nome del file, la fiala e il volume. Fare clic sul pulsante Salva .
6. Selezionare la riga nella tabella di sequenza per l'esempio che si desidera eseguire. Fare clic sul pulsante Esegui e fare clic sul pulsante OK nella finestra che si apre.

4. Trattamento dei dati

1. Avvia il software di analisi dei dati. Nella colonna Il mio lavoro , fare clic sul pulsante Importa dati MassLynx per aprire una nuova finestra.
2. Fare clic sul pulsante con il segno più e controllare tutti e cinque i file raw dalla modalità positiva. Immettere un nome per il gruppo e fare clic sul pulsante Crea set di campioni UNIFI per avviare l'importazione dei dati (Figura 3A).
3. Fare doppio clic sul file del metodo di analisi in modalità positiva. Fare clic sull'etichetta Elaborazione e fare clic sul pulsante Target per massa . Immettere il numero di 5 ppm nella casella di input dopo Tolleranza corrispondenza target e Tolleranza corrispondenza frammento.
4. Fare clic sul pulsante Home e fare clic sul pulsante Addotti . Seleziona le righe di +H e +Na e fai clic sul pulsante destro a forma di freccia . Fare clic sul pulsante Salva (Figura 3B).
5. Fare doppio clic sul file del metodo di analisi in modalità negativa. Fare clic sull'etichetta Elaborazione e fare clic sul pulsante Target per massa . Immettere il numero di 5 ppm nella casella di input dopo Tolleranza corrispondenza target e Tolleranza corrispondenza frammento.
6. Fare clic sul pulsante Home e quindi fare clic sul pulsante Addotti . Seleziona le righe -H e +HCOO e fai clic sul pulsante a forma di freccia destra . Fare clic sul pulsante Salva .
7. Nella colonna Il mio lavoro, fare clic sul pulsante Analisi per aprire una nuova finestra. Scegli i dati appena importati e il metodo appena creato, quindi fai clic sul pulsante Avanti. Inserisci il nome del file. Selezionare la cartella in cui sono memorizzati i dati dell'analisi e quindi fare clic sul pulsante Fine
8. Fare clic sul pulsante Elabora e attendere alcuni minuti fino a quando non vengono visualizzati i risultati (Figura 3C).
9. Copiare la tabella dei risultati in un modulo vuoto (Figura 3D).

5. Analisi dei risultati

1. Selezionare un composto nella tabella dei risultati. Lo spettro di massa secondario corrispondente verrà visualizzato nell'angolo in basso a destra (Figura 4A).
2. Fare clic sul pulsante a forma di tabella e selezionare l'opzione Frammenti ad alta energia per visualizzare la tabella degli ioni frammento secondario (Figura 4B).
3. Selezionare uno ione frammento secondario nella tabella. Sposta il mouse sul picco ionico corrispondente allo spettro di massa secondario e la frattura strutturale corrispondente verrà visualizzata sullo schermo (Figura 4C).
   NOTA: Valutare manualmente la ragionevolezza della fessurazione fornita dal software e distinguere gli isomeri in base agli ioni del frammento secondario.
4. Disegna manualmente il modello di frammentazione nel software di disegno.
   NOTA: Esempi di modelli di frammentazione sono descritti in dettaglio nella sezione dei risultati rappresentativi.

Risultati

L'identificazione della composizione chimica del BFH è stata utilizzata come modello per visualizzare i risultati rappresentativi. Cromatogrammi di picco di base di Gynura bicolor DC estratta con solvente. sono mostrati nel file supplementare 1-Figura supplementare S1-S6 e il tempo di ritenzione osservato (RT), il nome del componente, la formula, il rapporto massa/carica (m/z) e l'errore di massa sono elencati nelle tabelle S1-S6. Nello ZBTK, tutti i 35 tipi di...

Discussione

Oltre al decotto d'acqua¹², l'estrazione con solvente organico è un altro metodo comune di pretrattamento della MTC¹³. Secondo il principio della dissoluzione di fase simile, numerosi componenti sono stati estratti dalla combinazione di vari solventi organici¹⁴. L'estrazione assistita da ultrasuoni è uno dei principali metodi utilizzati per ottenere componenti in TCM¹⁵. L'estrazione con anid...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
chloroform	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	CAS 67-66-3
ethanol	ChuandongChemical	CAS 64-17-5
ethyl acetate	ChuandongChemical	CAS 141-78-6
liquid chromatograph	Waters	ACQUITY Class 1 plus
MassLynx	Waters	V4.2	MS control software
n-butyl alcohol	ChuandongChemical	CAS 71-36-3
petroleum ether	ChuandongChemical	CAS 8032-32-4
Quadrupole time-of-flight mass spectrometry	Waters	SYNAPT XS
UNIFI	Waters		Data analysis software