Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

Abstract

במהלך העשורים האחרונים, הראיות שהצטברו על קיומם של סופרקומפלקסים נשימתיים (SCs) שינו את הבנתנו את ארגון שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה, והולידו את הצעת "מודל הפלסטיות". מודל זה מניח את הדו-קיום של פרופורציות שונות של SCs וקומפלקסים בהתאם לרקמה או למצב חילוף החומרים הסלולרי. האופי הדינמי של ההרכבה ב-SCs יאפשר לתאים לייעל את השימוש בדלקים זמינים ואת יעילות העברת האלקטרונים, למזער את ייצור מיני החמצן הריאקטיביים ולהעדיף את יכולתם של התאים להסתגל לשינויים סביבתיים.

לאחרונה דווח על חריגות בהרכבת SC במחלות שונות כגון הפרעות נוירודגנרטיביות (אלצהיימר ופרקינסון), תסמונת בארת', תסמונת לי או סרטן. התפקיד של שינויים הרכבה SC בהתקדמות המחלה עדיין צריך להיות מאושר. עם זאת, הזמינות של כמויות מספיקות של דגימות כדי לקבוע את מצב הרכבה SC הוא לעתים קרובות אתגר. זה קורה עם ביופסיה או דגימות רקמה קטנות או שיש לחלק אותן לניתוחים מרובים, עם תרביות תאים שיש להם צמיחה איטית או מגיעים מהתקנים מיקרופלואידים, עם כמה תרביות ראשוניות או תאים נדירים, או כאשר יש לנתח את ההשפעה של טיפולים יקרים מסוימים (עם ננו-חלקיקים, תרכובות יקרות מאוד וכו '). במקרים אלה נדרשת שיטה יעילה וקלה ליישום. מאמר זה מציג שיטה המותאמת להשגת שברים מיטוכונדריאליים מועשרים מכמויות קטנות של תאים או רקמות כדי לנתח את המבנה והתפקוד של SCs מיטוכונדריאליים על ידי אלקטרופורזה טבעית ואחריה בדיקות פעילות בג'ל או כתם מערבי.

Introduction

סופרקומפלקסים (SCs) הם קשרים על-מולקולריים בין קומפלקסים בודדים של שרשרת הנשימה 1,2. מאז הזיהוי הראשוני של SCs ותיאור הרכבם על ידי קבוצת Schägger 2,3, שאושר מאוחר יותר על ידי קבוצות אחרות, נקבע כי הם מכילים מתחמי נשימה I, III ו- IV (CI, CIII ו- CIV, בהתאמה) בסטואיכיומטריות שונות. ניתן להגדיר שתי אוכלוסיות עיקריות של SCs, אלה המכילות CI (ו- CIII בלבד או CIII ו- CIV) ובעלות משקל מולקולרי גבוה מאוד (MW, החל ~ 1.5 MDa עבור SC הקטן יותר: CI + CIII2) ואלה המכילות CIII ו- CIV אך לא CIV, עם גודל קטן בהרבה (כגון CIII2 + CIV עם ~ 680 kDa). SCs אלה מתקיימים יחד בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי עם קומפלקסים חופשיים, גם בפרופורציות שונות. לכן, בעוד CI נמצא בעיקר בצורותיו הקשורות (כלומר, ב- SCs: ~ 80% בלב בקר ויותר מ -90% בסוגי תאים אנושיים רבים)3, CIV שופע מאוד בצורתו החופשית (יותר מ -80% בלב בקר), כאשר CIII מראה התפלגות מאוזנת יותר (~ 40% בצורתו החופשית השופעת יותר, כעמום, בלב בקר).

בעוד קיומם מקובל כיום, תפקידם המדויק עדיין נתון לוויכוח 4,5,6,7,8,9,10. על פי מודל הפלסטיות, פרופורציות שונות של SCs וקומפלקסים בודדים יכולים להתקיים בהתאם לסוג התא או למצב המטבולי 1,7,11. אופי דינמי זה של ההרכבה יאפשר לתאים לווסת את השימוש בדלקים זמינים ואת היעילות של מערכת הזרחן החמצוני (OXPHOS) בתגובה לשינויים סביבתיים 4,5,7. SCs יכולים גם לתרום לשליטה בקצב ייצור מיני חמצן תגובתי ולהשתתף בייצוב ותחלופה של קומפלקסים בודדים 4,12,13,14. שינויים בסטטוס ההרכבה של SC תוארו בהקשר של מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים15,16 ועם תהליך ההזדקנות17.

לפיכך, שינויים בדפוסי SC תוארו בשמרים בהתאם למקור הפחמן המשמש לצמיחה2 ובתאי יונקים בתרבית כאשר גלוקוז מוחלף בגלקטוז4. שינויים דווחו גם בכבד עכברים לאחר צום8 ובאסטרוציטים כאשר חמצון חומצות השומן המיטוכונדריאלי נחסם18. בנוסף, ירידה או שינויים ב- SCs ו- OXPHOS נמצאו בתסמונת בארת19, אי ספיקת לב20, מספר הפרעות מטבוליות21 ונוירולוגיות 22,23,24, וגידולים שונים 25,26,27,28 . השאלה אם שינויים אלה בהרכבה וברמות SC הם הגורם העיקרי או מייצגים השפעות משניות במצבים פתולוגיים אלה עדיין נחקרת15,16. מתודולוגיות שונות יכולות לתת מידע על הרכבה ותפקוד של SCs; אלה כוללים מדידות פעילות 8,29, ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי30,31 ופרוטאומיקה32,33. חלופה שימושית שנמצאת בשימוש הולך וגובר ומהווה את נקודת המוצא לחלק מהמתודולוגיות שהוזכרו לעיל היא הקביעה הישירה של מצב הרכבה SC על ידי אלקטרופורזה מקורית כחולה (BN) שפותחה למטרה זו על ידי קבוצתו של Schägger34,35.

גישה זו דורשת פרוצדורות ניתנות לשחזור ויעילות כדי להשיג ולהמיס קרומי מיטוכונדריה וניתן להשלים אותה על ידי טכניקות אחרות כגון ניתוח פעילות בג'ל (IGA), אלקטרופורזה מממד שני וכתם מערבי (WB). מגבלה במחקרים על דינמיקת SC על ידי אלקטרופורזה BN יכולה להיות כמות התאים ההתחלתיים או דגימות רקמות. אנו מציגים סדרה של פרוטוקולים לניתוח הרכבה ותפקוד SC, המותאמים לשיטות הקבוצה של Schägger, שניתן ליישם על דגימות תאים או רקמות טריות או קפואות החל מ -20 מ"ג רקמה בלבד.

Protocol

הערה: ההרכב של כל אמצעי התרבות והמאגרים מצוין בטבלה 1 ופרטים הקשורים לכל החומרים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד מיטוכונדריה מתרבית תאים

הערה: נפח התאים המינימלי שנבחן היה ~30-50 μL של תאים ארוזים (שלב 1.4). זה יכול להתאים בערך לשניים או שלושה לוחות תרבית תאים בקוטר 100 מ"מ או לצלחת אחת בקוטר 150 מ"מ ב-80-90% מהמפגש, תלוי בסוג התא (בין 5 × 10,6 ו-10,7 תאים בתאים שמקורם ב-L929 או MDA-MB-468). שבירת תאים יעילה היא שלב קריטי.

  1. לגדל תאים נצמדים לכ-80% מפגש או תאים מרחפים לצפיפות נאותה.
  2. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות (ישירות מתרחיף התא במקרה של תאים שאינם דבקים או לאחר טריפסיניזציה סטנדרטית עם תמיסת טריפסין-EDTA של 0.05% טריפסין ו 0.02% EDTA ב 1x PBS, במקרה של תאים דבקים).
  3. לשטוף תאים 2x עם קר 1x PBS ולשקוע אותם על ידי צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות.
    הערה: מנקודה זו, יש לבצע את כל השלבים ב- 4 °C. לכן, כל הריאגנטים חייבים להיות קרים והצינורות המכילים תאים או מיטוכונדריה חייבים להישמר על קרח.
  4. לאחר הצנטריפוגה השנייה, השליכו את הסופרנטנט, העריכו את נפח כדורי התא (cpv), והקפיאו את התאים בטמפרטורה של -80°C למשך 15 דקות לפחות כדי להקל על שבירת הממברנה בשלב 1.8.
    הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול בשלב זה ולאחסן את התאים בטמפרטורה של -80°C למשך שבועות. בדרך כלל, 10 או 15 מ"ל צינורות מדורגים עם תחתיות חרוטיות מתאימים.
  5. תנו לתאים להפשיר לאט על קרח.
  6. השהה מחדש את גלולת התא הארוזה בנפח של חיץ היפוטוני השווה ל- 7x cpv (10 mM MOPS, 83 mM סוכרוז, pH 7.2) (למשל, 100 μL של תאים ארוזים ב- 700 μL של חיץ).
    הערה: עוצמת הקול חייבת להספיק כדי להשיג פופים יעילים (ראה הערה בשלב 1.8).
  7. מעבירים את תרחיף התא לתוך הומוגנייזר Potter-Dounce בגודל המתאים ונותנים לתאים להתנפח על ידי דגירה עליהם בקרח למשך 2 דקות. לדוגמה, עבור נפח של 700-800 μL של השעיית התא, הומוגנייזר קיבולת 1 מ"ל מספיק.
  8. שברו את קרומי התא על ידי ביצוע שמונה עד עשר פעימות בהומוגנייזר המחובר למזיק טפלון מונע מנוע המסתובב ב-600 סל"ד.
    הערה: בעת ביצוע השבץ, חשוב ליצור ואקום שיגביר את יעילות שבירת התאים יחד עם פעולות היפוטוניות והקפאה לנפיחות ושבריריות הממברנות, בהתאמה. אם זה נעשה היטב, צליל "פופ" יישמע בעת משיכת הומוגנייזר עם תנועה מהירה בכל שבץ.
  9. הוסף את אותו נפח של חיץ היפרטוני לתרחיף התא (פי 7 מה-cpv) (MOPS של 30 mM, סוכרוז של 250 mM, pH 7.2) כדי ליצור סביבה איזוטונית.
  10. מעבירים את ההומוגנאט לצינור 10-15 מ"ל וצנטריפוגה ברוטור קבוע ב 1,000 × גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
    הערה: הצינור המקורי המכיל את התאים שלא נשברו יכול לשמש למטרה זו.
  11. מעבירים את הסופרנטנט, המכיל את החלק המיטוכונדריאלי, לצינורות פוליפרופילן בנפח 1.5 מ"ל.
  12. אופציונלי: כדי להגדיל את תפוקת המיטוכונדריה, השהה מחדש את הגלולה משלב 1.10 בפי 7 מנפח כדורי התא של חיץ A (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M סוכרוז, pH 7.4) על ידי צנרת למעלה ולמטה וצנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C. שלב את הסופרנאטנט החדש עם הקודם לפני שתמשיך לשלב 1.13.
  13. צנטריפוגה במיקרופוגה ב 16,000 × גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את החלק הגולמי המיטוכונדריאלי.
  14. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש כל גלולה מועשרת במיטוכונדריה עם 0.5 מ"ל של חיץ A המשלב את התוכן של שני צינורות לאחד וצנטריפוגה באותם תנאים כמתואר בשלב 1.13. חזור על אותו תהליך עד שכל החומר נמצא בצינור אחד בלבד.
  15. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה הסופית עם 300 מיקרוליטר של חיץ A, וכמתו את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות מבחן ברדפורד. צנטריפוגה שוב כמו קודם ולהמשיך לסעיף 3.

2. בידוד מיטוכונדריה מכמויות קטנות של רקמות בעלי חיים

הערה: כמות הרקמה המינימלית ליישום פרוטוקול זה בביטחון מסוים תלויה בסוג התא ובשפע המיטוכונדריאלי שלו, אך יכולה להיות ~ 20-30 מ"ג רקמה ברוב המקרים. דגימות הרקמה יכולות להיות חומר טרי או דגימות קפואות. במקרה האחרון, לאפשר את הדגימות להפשיר חיץ הומוגניזציה להציב על קרח לפני תחילת ההליך.

  1. לשקול או להעריך קרוב ככל האפשר את כמות (מ"ג) של רקמה.
  2. חותכים את הרקמה עם זוג מספריים ולעשות 3-4 שטיפות בחיץ הומוגניזציה בעזרת מסננת דואג למנוע לאבד את החתיכות הקטנות יותר.
    הערה: שלב זה חשוב יותר ברקמות כמו שרירי השלד או הלב מאשר במוח או ברקמות רכות יותר שהתאים שלהן יכולים להתפרק בקלות ישירות על ידי שלב ההומוגניזציה.
  3. הוסף מדיום הומוגניזציה טרי (4 מ"ל לגרם כבד, 10 מ"ל לגרם לב, רקמת שומן חומה (BAT) או שריר, ו-5 מ"ל לגרם מוח או כליה; ראה הרכב חיץ ספציפי לכל מקרה בטבלה 1).
  4. העבירו את פיסות הרקמה עם חיץ להומוגנייזר ועקבו אחר פרוטוקול ההומוגניזציה ובידוד המיטוכונדריה האופטימלי בהתאם לרקמה שנבחרה.
  5. בידוד מיטוכונדריה מהכבד, הטחול והכליות
    1. הומוגניזציה עם ארבע עד שש משיכות מעלה ומטה באלווג'ם-פוטר עם טפלון מונע מנוע ב-600 סל"ד.
    2. מעבירים את הרקמה ההומוגנית לצינור צנטריפוגה סטרילי. צנטריפוגה ברוטור מתנדנד ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. מלא 1.5 מ"ל צינורות פוליפרופילן עם supernatant שהושג בשלב הקודם. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-16,000 × גרם במיקרופוגה ב-4°C והמשך לאחר מכן כמתואר קודם (שלבים 1.13 עד 1.15)
  6. בידוד מיטוכונדריה מדגימות לב ושרירים
    1. הומוגניזציה עם שש עד שמונה פעימות באלווג'ם-פוטר עם טפלון מונע מנוע ב-600 סל"ד. מעבירים את הרקמה ההומוגנית לצינור צנטריפוגה סטרילי.
    2. צנטריפוגה ברוטור מתנדנד ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. יוצקים את supernatant לתוך נקי 1.5 מ"ל צינורות פוליפרופילן.
      הערה: הומוגניזציה שנייה של הגלולה המתקבלת בשלב 2.6.2 יכולה להתבצע עם 4-5 פעימות נוספות ו-1/2 נפח של חיץ הומוגניזציה כדי להגדיל את התפוקה המיטוכונדריאלית. ניתן לשלב את הסופרנאטנט החדש (לאחר צנטריפוגה שוב ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C) עם הקודם לפני שממשיכים לשלב 2.6.3. חלופה להגדלת תפוקת המיטוכונדריה הגולמי היא לנתק דגימות רקמת לב ושריר בתמיסת טריפסין לפני הומוגניזציה36,37. במקרה זה, יש להשבית / להסיר את הטריפסין ביעילות לפני שהקרומים המיטוכונדריאליים מסיסים בדיגיטונין (שלב 3.2).
    3. צנטריפוגה ב 16,000 × גרם במיקרופוגה במשך 2 דקות ב 4 ° C כדי לקבל את החלק המיטוכונדריאלי הגולמי.
    4. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש כל גלולה מועשרת במיטוכונדריה עם 0.5 מ"ל של חיץ AT המשלב את התוכן של שני צינורות לאחד וצנטריפוגה באותם תנאים כמתואר בשלב 2.6.3. חזור על אותו תהליך עד שכל החומר נמצא בצינור אחד בלבד.
    5. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה הסופית עם 300 מיקרוליטר של חיץ A (ללא BSA), וכמתו את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות מבחן ברדפורד. צנטריפוגה שוב כמו קודם ולהמשיך לסעיף 3.
  7. בידוד מיטוכונדריה מהמוח
    1. הומוגניזציה של חתיכות המוח עם 10-15 שבץ באמצעות הומוגנייזר זכוכית מסוג Dounce עם מזיק זכוכית מונע ידנית. מעבירים את הרקמה ההומוגנית לצינור צנטריפוגה סטרילי.
    2. צנטריפוגה ברוטור מתנדנד ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. אספו את הסופרנאטנט לתוך צינור צנטריפוגה נקי.
    4. להשהות מחדש את הגלולה שהושגה בשלב הצנטריפוגה הקודם באותו נפח של AT בינוני המשמש הומוגניזציה הראשונה. הומוגניזציה מחדש של הגלולה על ידי חזרה על התהליך המתואר בשלב 2.7.1 באמצעות 5-10 מעברים וצנטריפוגה את המתלה ברוטור מתנדנד ב 1,000 × גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
    5. הסר את supernatant ולהוסיף אותו לתוך הצינור מוכן בשלב 2.7.3. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם ברוטור זווית קבועה במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי לקבל את החלק המיטוכונדריאלי הגולמי.
    6. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ל-1/2 מנפח ההומוגניזציה הראשוני (שלב 2.7.1) של AT. פזרו את המתלה המיטוכונדריאלי לצינורות פוליפרופילן נקיים בנפח 1.5 מ"ל ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 16,000 × גרם במיקרופוגה למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4°C.
    7. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש כל גלולה מועשרת במיטוכונדריה עם 0.5 מ"ל של חיץ AT המשלב את התוכן של שני צינורות לאחד וצנטריפוגה באותם תנאים כמתואר בשלב 2.7.6. חזור על אותו תהליך עד שכל החומר נמצא בצינור אחד בלבד.
    8. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה הסופית עם 300 מיקרוליטר של חיץ A (ללא BSA), וכמתו את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות מבחן ברדפורד. צנטריפוגה שוב כמו קודם ולהמשיך לסעיף 3.
  8. בידוד מיטוכונדריה מ-BAT
    1. הומוגניזציה עם שמונה עד עשר משיכות מעלה ומטה באלווג'ם-פוטר עם טפלון מונע מנוע ב-600 סל"ד. מעבירים את הרקמה ההומוגנית לצינור צנטריפוגה סטרילי.
    2. צנטריפוגה ברוטור מתנדנד ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. מלאו 1.5 מ"ל צינורות פוליפרופילן עם supernatant שהושג בשלב הקודם הימנעות שכבת השומן העליונה.
      הערה: הומוגניזציה שנייה של הגלולה המתקבלת בשלב 2.8.2 יכולה להתבצע כדי להגדיל את התשואה המיטוכונדריאלית. ניתן לשלב את הסופרנאטנט החדש (לאחר צנטריפוגה שוב ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס) עם הקודם לפני שממשיכים לשלב 2.8.4.
    4. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-16,000 × גרם למשך 2 דקות במיקרופוגה ב-4°C.
    5. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש כל גלולה מועשרת במיטוכונדריה עם 0.5 מ"ל של חיץ AT2 המשלב את התוכן של שני צינורות לאחד וצנטריפוגה באותם תנאים כמתואר בשלב 2.8.4. חזור על אותו תהליך עד שכל החומר נמצא בצינור אחד בלבד.
    6. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה הסופית עם 300 מיקרוליטר של חיץ A (ללא BSA), וכמתו את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות מבחן ברדפורד. צנטריפוגה שוב כמו קודם ולהמשיך לסעיף 3.

3. הכנת דגימות לניתוח Blue Native

  1. יש להשהות מחדש את השברים המיטוכונדריאליים (המתקבלים מתרביות תאים או רקמות של יונקים) במאגר דגימת BN (50 mM NaCl, 50 mM Imidazole, 5 mM חומצה אמינוקפרואית, 4 mM PMSF) כדי לקבל ריכוז חלבון של כ -10 מ"ג / מ"ל. ראו טבלה 2 לתפוקות צפויות עבור סוגי הדגימות השונים.
  2. מסיסים את קרומי המיטוכונדריה על ידי הוספת דיגיטונין (10% תמיסת מלאי) לקבלת יחס של 4 גרם דיגיטונין/גרם של חלבון מיטוכונדריאלי (4 מיקרוליטר של דיגיטונין, 10% מלאי עבור 10 מיקרוליטר של התרחיף המיטוכונדריאלי שהוכן בשלב 3.1).
    הערה: יש למטב את יחס הדטרגנט לחלבון (g/g) עבור כל סוג דגימה כדי לקבל תוצאות הניתנות לשחזור; 2-8 גרם של digitonin/g של חלבון מיטוכונדריאלי נמצא אופטימלי עבור רוב הרקמות34,35.
  3. מערבבים בעדינות למעלה ולמטה. דגרו דגימות על קרח במשך 5 דקות.
    הערה: לאחר שלב זה, המתלה המיטוכונדריאלי אמור להיות ברור יותר (לעבור מאטום לשקוף); אחרת, זה יכול להצביע על כך שכמות חומר הניקוי אינה מספיקה למסיסות נכונה של הממברנה.
  4. צנטריפוגה במלוא המהירות במיקרופוגה (20,000 × גרם בערך) למשך 25 דקות ב-4°C להסרת חומר בלתי מסיס.
  5. אספו את הסופרנאטנט בצינור טרי. הוסף לסופרנאטנט נפח של 5% G-250 (Coomassie Blue G-250 5% בחומצה אמינוקפרואית 0.75 M) שווה ערך ל-1/3 מנפח התרחיף הראשוני (שלב 3.1, זה יתאים ליחס סופי של 1.6 גרם קומאסי/גרם חלבון) וערבב על ידי פיפטינג.
  6. יש לשמור על קרח לפני העמסה על הג'ל או להקפיא aliquots ב -80 ° C.

4. אלקטרופורזה ג'ל מקורית כחולה

הערה: האלקטרופורזה מבוצעת בחדר הקר (4-8 מעלות צלזיוס). אם אין מתקן חדר קר, ניתן להכניס בלוק קירור במיכל האלקטרופורזה. מסחרי 3-13% ג'ל פוליאקרילאמיד טבעי29 משמשים, אבל ג'לים תוצרת בית של ריכוזי שיפוע הרצוי ניתן להשתמש גם38,39.

  1. טען את החדרים העליונים והתחתונים עם קתודה קרה A ומאגרי אנודה, בהתאמה. לחלופין, טען את הדגימות בבארות לפני מילוי זהיר של החדר העליון בחיץ קתודה A.
    הערה: מאגרי אלקטרופורזה מסחריים משמשים במעבדה שלנו, אך ניתן להכין אותם כפי שמצוין בטבלה 1.
  2. יש להעמיס בין 30 ל-100 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי.
    הערה: בדרך כלל, 30-50 מיקרוגרם חלבון (עבור WB), או 40-100 מיקרוגרם חלבון (עבור IGA) נטענים לכל באר בג'ל 10 נתיבים (0.5 x 0.15 ס"מ בארות). חיץ קתודה מכיל Coomassie Blue G-250 ובעל צבע כחול עז המקשה לראות את בארות הג'ל להעמסת דגימה. זה נוח לסמן את המרכז של כל באר, עם סמן אדום, למשל, כדי לעזור בהצבת קצה פיפטה במהלך שלב זה. סמני משקל מולקולריים מקוריים יכולים להיות שימושיים בעת הגדרת טכניקת BN-PAGE כדי לאשר כי ג'ל שיפוע נוצרו כראוי וכי קומפלקסים ודפוס SCs הוא הנכון.
  3. הפעל ב 80-100 V במשך 25-30 דקות ולאחר מכן ב 160-180 V, הגבלת הזרם ל 12 mA / ג'ל, עד הצבע מגיע לתחתית הג'ל (~ 125-165 דקות בסך הכל).
  4. אם יש לבצע בדיקות פעילות בג'ל (IGAs), יש להחליף את החיץ הקתודה A בחיץ קתודה B כאשר חזית הצבע נמצאת באמצע הג'ל (~1 שעה לאחר תחילת הריצה).
    הערה: למרות שניתן לתעד את הג'לים ללא כל הכתמה מיד לאחר הריצה מכיוון שחלק מהרצועות נראות לעין (בעיקר V מורכב, שיכול להיחשב כיצרן "פנימי" עם MW של ~ 600 kDa) בשל קשירתם לצבע G-250, בדרך כלל, SCs וקומפלקסים בודדים לא יהיו גלויים ללא כתמים או בדיקות IGA. אין להכתים או לתקן את הג'לים לשימוש במבחני IGA או עבור WB.
  5. יש לפרק את הג'ל מהקלטת ולהמשיך עם צביעה כחולה של קומאסי (סעיף 5), ניתוח IGA (סעיף 6) או זיהוי חיסוני WB (סעיף 7).

5. צביעת ג'ל

  1. צבעו את הג'ל למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) באמצעות תמיסות צבע כחול של קומאסי (צבע קומאסי R-250 ב-0.25% ב-40% מתנול, 10% חומצה אצטית; כתם למשך 10-15 דקות).
  2. יש להכתים במספר שטיפות (בדרך כלל 4-5 x 15 דקות) ב-40% מתנול בתוספת 10% חומצה אצטית ב-RT.
  3. תעדו את הג'ל.

6. במבחני פעילות ג'ל (IGA)

  1. הכינו פתרונות IGA לניתוח מתחמי הנשימה השונים לפני סוף האלקטרופורזה ותשמרו עליהם בחושך (באמצעות קופסאות פלסטיק בצבע כהה או כיסויים ברדיד אלומיניום, למשל). הרכבו של כל חיץ מפורט בטבלה 1.
  2. הניחו את הג'ל או את הנתיבים לשימוש בקופסת פלסטיק קטנה ככל האפשר כדי להכיל אותה.
  3. הוסף נפח מספיק של התמיסה המתאימה כדי לכסות את הג'ל (בדרך כלל 5 או 10 מ"ל עבור 5 או 10 נתיבי ג'ל, בהתאמה) ודגור ב- RT עם ניעור עדין (60-80 סל"ד) והרחק מאור.
    הערה: זמן הדגירה תלוי במתחם שיש לנתח ובאופי וכמות הדגימה שהועמסה; CI ו- CIV הם הקלים והמהירים ביותר לתת תוצאות. לכן, פעילות CI בדרך כלל תתחיל להיות גלויה לאחר מספר דקות, בעוד CII ו CIV צריך ~ 30 דקות כדי להיות נצפה CV ~ 1.5-2 שעות. התגובה יכולה להימשך שעות בכל המקרים וניתן להפחית את קצב הגברת האות על ידי העברת הדגירה לחדר קר (4-6 מעלות צלזיוס), למשל, לדגירת לילה (ON). פעילות CIII פועלת רק עבור אלקטרופורזה מקומית ברורה (CN), לא עבור BN34.
  4. כאשר התפתחו הפסים המתאימים, הפסיקו את התגובות על ידי הסרת תמיסות הבדיקה, שטיפה 2x במים מזוקקים, וקיבוע הג'ל עם 40% מתנול בתוספת 10% חומצה אצטית (למעט CV אשר קבוע רק עם מתנול) למשך 30 דקות.
    1. כדי לנתח את פעילות ה-CIV לאחר זיהוי CI על ידי IGA, שטפו את הג'ל 2x במים מזוקקים, תיעדו את פעילות ה-CI, דגרו על הג'ל (מבלי לתקן אותו!) עם חיץ אשלגן פוספט של 50 מילימטר (pH 7.2) 2x למשך 30 דקות, ולאחר מכן עם מאגר התגובה המלא של CIV עד להופעת רצועות IV מורכבות (בדרך כלל על ידי דגירה ON ב-RT או 4°C).
  5. תעדו את הג'לים.
    הערה: עבור פעילות ATPase, מכיוון שהרצועות המפותחות הן לבנות, בעת תיעוד הג'ל, הניחו אותו על רקע כהה כך שהרצועות השקופות יהיו גלויות.

7. ניתוח כתמים מערביים

  1. הכינו את חיץ ההעברה לפי טבלה 1 ושמרו על טמפרטורה של 4°C עד סוף האלקטרופורזה.
  2. מניחים את הג'ל במגש ומוסיפים מאגר העברה. יש לדגור ב-RT למשך 10-15 דקות.
  3. חותכים חתיכת קרום PVDF באותו גודל כמו הג'ל ומפעילים אותו מתנול במשך 10 שניות תחת תסיסה. שטפו מספר פעמים במים מזוקקים והוסיפו מאגר העברה. יש לדגור ב-RT במשך 10-15 דקות עם רעידות עדינות.
  4. מכינים את כריך ההעברה, מלמטה למעלה, ונמנעים מבועות בין הג'ל לממברנה, בסדר הבא: צד שחור של קסטה-ספוג-נייר כתמים-ג'ל-ממברנה-נייר כתמים- צד ספוג-שקוף של קלטת.
  5. סוגרים ונועלים את הקלטת ומכניסים את הכריך למיכל ההעברה בכיוון הנכון להעברה (צד שחור לכיוון הקוטב השלילי).
  6. מלא את מיכל ההעברה במאגר העברה, הוסף מערבל מגנטי כדי לעורר את המאגר, וחבר את ספק הכוח ב- 80 V למשך שעתיים או ב- 100 V למשך שעה אחת. בצע את ההעברה בין 4 ל 8 ° C (למשל בחדר קר) ועם בלוק קירור במערכת ההעברה.
  7. יש לאחזר את הממברנה ולהמשיך בפרוטוקול כתם מערבי סטנדרטי, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים לזיהוי מתחמי הנשימה השונים29.

תוצאות

תפוקת המיטוכונדריה המתקבלת בעקבות הפרוטוקולים המתוארים לעיל משתנה בהתאם למספר גורמים כגון קו התא או סוג הרקמה, אופי הדגימות (כלומר, אם נעשה שימוש ברקמות טריות או קפואות), או יעילות תהליך ההומוגניזציה. יבולים צפויים של מיטוכונדריה מקווי תאים ורקמות שונים נאספים בטבלה 2. לאחר קבלת ?...

Discussion

ההתאמות המתודולוגיות שהוכנסו בפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו למנוע הפסדים ולהגדיל את התשואה תוך שמירה על פעילויות מורכבות במיטוכונדריה (שהיא חיונית כאשר הזמינות של כמויות מספיקות של דגימות נפגעת) ולשחזר את התבנית הצפויה של SCs ברקמה או בקו התא (ראו איור 2C). למטרה זו ומכיוון ...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מספר "PGC2018-095795-B-I00" מ- Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) ועל ידי מענקים "Grupo de Referencia: E35_17R" ומענק מספר "LMP220_21" מ- Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) ל- PF-S ו- RM-L.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidPanReac131008
Aminocaproic acidFluka Analytical7260
ATPSigma-AldrichA2383
Bis TrisAcrons Organics327721000
Bradford assayBiorad5000002
Coomassie Blue G-250Serva17524
Coomassie Blue R-250Merck1125530025
Cytochrome cSigma-AldrichC2506
Diamino  benzidine (DAB)Sigma-AldrichD5637
DigitoninSigma-AldrichD5628
EDTAPanReac131669
EGTASigma-AldrichE3889
Fatty acids free BSARoche10775835001
GlycinePanReacA1067
Homogenizer Teflon pestleDeltalab196102
ImidazoleSigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
MannitolSigma-AldrichM4125
MethanolLabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
Mini Trans-Blot CellBioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1 Monoclonal AntibodyInvitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein GelsInvitrogenBN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE Running Buffer (20x) InvitrogenBN2001
NDUFA9 Monoclonal AntibodyInvitrogen459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)Sigma-AldrichN6876
Pb(NO3)2Sigma-Aldrich228621
PDVF MembraneAmersham10600023
Phenazine methasulfate (PMS)Sigma-AldrichP9625
Pierce ECL SubstrateThermo Scientific32106
PMSFMerckPMSF-RO
SDHA Monoclonal AntibodyInvitrogen459200
Sodium succinateSigma-AldrichS2378
Streptomycin/penicillinPAN biotechP06-07100
SucroseSigma-AldrichS3089
TrisPanReacA2264
UQCRC1 Monoclonal AntibodyInvitrogen459140
XCell SureLock Mini-CellInvitrogen EI0001

References

  1. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  2. Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  3. Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).
  4. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  5. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  6. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  7. Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes. EMBO Rep. 24 (11), e57092 (2023).
  8. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  9. Milenkovic, D., et al. Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes. Cell Metab. 35 (10), 1799-1813 (2023).
  10. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  11. Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P., Ostojic, S. . Clinical Bioenergetics. , 3-60 (2021).
  12. Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain. Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).
  13. Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role. Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).
  14. Lopez-Fabuel, I., et al. Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).
  15. Mukherjee, S., Ghosh, A. Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases. Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).
  16. Nesci, S., et al. Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology. Life (Basel). 11 (3), 242 (2021).
  17. Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).
  18. Morant-Ferrando, B., et al. Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition. Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).
  19. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients. J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).
  20. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  21. Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935 (2020).
  22. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  23. Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600 (2020).
  24. Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging. Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).
  25. Hollinshead, K. E. R., et al. Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer. Cell Rep. 33 (1), 108231 (2020).
  26. Ikeda, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance. Nat Commun. 10 (1), 4108 (2019).
  27. Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer. Front Cell Dev Biol. 10, 717881 (2022).
  28. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers (Basel). 11 (7), 1027 (2019).
  29. Moreno-Loshuertos, R., et al. How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria. Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).
  30. Vonck, J., Schafer, E. Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).
  31. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  32. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  33. Gonzalez-Franquesa, A., et al. Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity. Cell Rep. 35 (8), 109180 (2021).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).
  35. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  36. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. J Vis Exp. (49), e2452 (2011).
  37. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182 (2019).
  38. Schagger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).
  39. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  40. Chomyn, A., et al. Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers. Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).
  41. Moreno-Loshuertos, R., et al. Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants. Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).
  42. Fernández-Vizarra, E., Fernández-Silva, P., Enríquez, J. A., Celis, J. E. . Cell Biology (Third Edition). , 69-77 (2006).
  43. Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved