АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает методику анализа дыхательных суперкомплексов при наличии только небольшого количества образцов.

Аннотация

За последние десятилетия накопленные данные о существовании дыхательных суперкомплексов (СК) изменили наше представление об организации митохондриальной электронно-транспортной цепи, что привело к предложению «модели пластичности». Эта модель постулирует сосуществование различных пропорций СК и комплексов в зависимости от ткани или метаболического статуса клеток. Динамический характер сборки в СК позволит клеткам оптимизировать использование доступного топлива и эффективность переноса электронов, сводя к минимуму образование активных форм кислорода и способствуя способности клеток адаптироваться к изменениям окружающей среды.

В последнее время сообщалось об аномалиях сборки СК при различных заболеваниях, таких как нейродегенеративные расстройства (болезнь Альцгеймера и Паркинсона), синдром Барта, синдром Ли или рак. Роль изменений сборки СК в прогрессировании заболевания все еще нуждается в подтверждении. Тем не менее, наличие достаточного количества образцов для определения состояния сборки SC часто является проблемой. Это происходит с биопсией или образцами тканей, которые малы или должны быть разделены для нескольких анализов, с культурами клеток, которые имеют медленный рост или получены из микрофлюидных устройств, с некоторыми первичными культурами или редкими клетками, или когда необходимо проанализировать эффект конкретных дорогостоящих методов лечения (с наночастицами, очень дорогими соединениями и т. д.). В этих случаях требуется эффективный и простой в применении метод. В данной работе представлен метод, адаптированный для получения обогащенных митохондриальных фракций из небольшого количества клеток или тканей для анализа структуры и функции митохондриальных СК с помощью нативного электрофореза с последующим анализом активности в геле или вестерн-блоттингом.

Введение

Суперкомплексы (СК) представляют собой супрамолекулярные ассоциации между отдельными комплексами дыхательной цепи 1,2. Поскольку первоначальная идентификация СК и описание их состава по группе Шеггера 2,3, в дальнейшем подтвержденные другими группами, было установлено, что они содержат дыхательные комплексы I, III и IV (CI, CIII и CIV соответственно) в разных стехиометриях. Можно выделить две основные популяции СК: содержащие ДИ (и либо только CIII, либо CIII и CIV) и с очень высокой молекулярной массой (MW, начиная с ~1,5 MDa для меньших SC: CI + CIII2), и содержащие CIII и CIV, но не CIV, с гораздо меньшим размером (например, CIII2 + CIV с ~680 кДа). Эти СК сосуществуют во внутренней митохондриальной мембране со свободными комплексами, также в разных пропорциях. Таким образом, в то время как CIV в основном встречается в ассоциированных с ним формах (то есть в SC: ~80% в сердце крупного рогатого скота и более 90% во многих типах клеток человека)3, CIV очень распространен в свободной форме (более 80% в сердце крупного рогатого скота), при этом CIII демонстрирует более сбалансированное распределение (~40% в более распространенной свободной форме, как димер, в бычьем сердце).

В то время как их существование в настоящее время общепризнано, их точная роль все еще обсуждается 4,5,6,7,8,9,10. Согласно модели пластичности, в зависимости от типа клеток или метаболического статуса могут существовать различные пропорции СК и отдельных комплексов 1,7,11. Такая динамическая природа сборки позволит элементам регулировать использование доступного топлива и эффективность системы окислительного фосфорилирования (OXPHOS) в ответ на изменения окружающей среды 4,5,7. СК также могут способствовать контролю скорости образования активных форм кислорода и участвовать в стабилизации и обороте отдельных комплексов 4,12,13,14. Описаны изменения статуса сборки СК в связи с различными физиологическими и патологическими ситуациями15,16 и с процессом старения17.

Таким образом, изменения в паттернах SC были описаны у дрожжей в зависимости от источника углерода, используемого для роста2, и в культивируемых клетках млекопитающих при замещении глюкозы галактозой4. Также сообщалось об изменениях в печени мышей после голодания8 и в астроцитах, когда окисление митохондриальных жирных кислот блокируется18. Кроме того, снижение или изменения СК и OXPHOS были обнаружены при синдроме Барта19, сердечной недостаточности20, нескольких метаболическихрасстройствах 21 и неврологическихрасстройствах 22,23,24, а также при различных опухолях 25,26,27,28. Являются ли эти изменения в сборке и уровнях СК первичной причиной или представляют собой вторичные эффекты в этих патологических ситуациях, все еще исследуется15,16. Различные методологии могут давать информацию о сборке и функционировании ПК; К ним относятся измерения активности 8,29, ультраструктурный анализ30,31 и протеомика32,33. Полезной альтернативой, которая все чаще используется и является отправной точкой для некоторых из ранее упомянутых методологий, является прямое определение статуса сборки SC с помощью электрофореза Blue native (BN), разработанного для этой цели группойШеггера 34,35.

Этот подход требует воспроизводимых и эффективных процедур для получения и солюбилизации митохондриальных мембран и может быть дополнен другими методами, такими как анализ активности в геле (IGA), электрофорез второго измерения и вестерн-блот (WB). Ограничением в исследованиях динамики СК с помощью электрофореза BN может быть количество исходных клеток или образцов тканей. Мы представляем серию протоколов для анализа сборки и функции СК, адаптированных на основе групповых методов Шеггера, которые могут быть применены к свежим или замороженным образцам клеток или тканей, начиная с 20 мг ткани.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Состав всех питательных сред и буферов указан в таблице 1 , а подробности, относящиеся ко всем материалам и реагентам, используемым в этом протоколе, перечислены в таблице материалов.

1. Выделение митохондрий из клеточной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный объем анализируемых клеток составляет ~30-50 мкл упакованных клеток (шаг 1.4). Это может примерно соответствовать по меньшей мере двум или трем 100 мм клеточным культуральным планшетам или одному 150 мм планшету на 80-90% конфлюенса, в зависимости от типа клеток (от 5 × 106 до 107 клеток в клетках, полученных из L929 или MDA-MB-468). Эффективная поломка клеток является критически важным этапом.

  1. Выращивайте адгезивные клетки примерно до 80% слияния или взвешенные клетки до адекватной плотности.
  2. Соберите клетки центрифугированием при 500 × г в течение 5 мин (непосредственно из клеточной суспензии в случае неадгезивных клеток или после стандартной трипсинизации раствором трипсина-ЭДТА, содержащим 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА в 1x PBS, в случае адгезивных клеток).
  3. Промойте ячейки 2x холодным 1x PBS и отварите их центрифугированием при 500 × г в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента все шаги должны выполняться при температуре 4 °C. Поэтому все реактивы должны быть холодными, а трубки, содержащие клетки или митохондрии, должны быть на льду.
  4. После второго центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, оцените объем клеточных гранул (cpv) и заморозьте клетки при температуре -80 °C в течение не менее 15 минут, чтобы облегчить разрыв мембраны на этапе 1.8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом протокол может быть остановлен, и клетки могут храниться при температуре -80 °C в течение нескольких недель. Обычно подходят градуированные пробирки объемом 10 или 15 мл с коническим дном.
  5. Дайте клеткам медленно оттаять на льду.
  6. Ресуспендировать упакованную клеточную гранулу в объеме гипотонического буфера, равном 7-кратному cpv (10 мМ MOPS, 83 мМ сахарозы, pH 7,2) (например, 100 мкл упакованных клеток в 700 мкл буфера).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем должен быть достаточным для получения эффективных хлопков (см. ПРИМЕЧАНИЕ на шаге 1.8).
  7. Перенесите клеточную суспензию в гомогенизатор Potter-Dounce соответствующего размера и дайте клеткам набухнуть, инкубируя их во льду в течение 2 минут. Например, для объема 700-800 мкл клеточной суспензии достаточно гомогенизатора емкостью 1 мл.
  8. Разорвите клеточные мембраны, выполнив от восьми до десяти ударов в гомогенизаторе, соединенном с тефлоновым пестиком с моторным приводом, вращающимся со скоростью 600 оборотов в минуту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении мазков важно создать вакуум, который повысит эффективность разрушения клеток, а также гипотоническое и замораживающее действия на набухание и ломкость мембран соответственно. Если все сделано правильно, то при опускании гомогенизатора вниз будет слышен «хлопок» с быстрым движением при каждом движении.
  9. Добавьте в клеточную суспензию такой же объем гипертонического буфера (в 7 раз больше cpv) (30 мМ MOPS, 250 мМ сахарозы, pH 7,2) для создания изотонической среды.
  10. Перелейте гомогенат в пробирку объемом 10-15 мл и центрифугируйте в неподвижном роторе при давлении 1 000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой цели можно использовать оригинальную трубку, содержащую неповрежденные клетки.
  11. Перенесите надосадочную жидкость, в состав которой входит митохондриальная фракция, в полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл.
  12. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Для увеличения выхода митохондрий повторно суспендируйте гранулу с этапа 1,10 в 7 раз больше объема клеточной гранулы буфера А (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, 0,32 М сахарозы, pH 7,4) путем пипетирования вверх и вниз и центрифугируйте при 1000 × г в течение 5 мин при 4 °C. Объедините новую надосадочную жидкость с предыдущей, прежде чем переходить к шагу 1.13.
  13. Центрифугируйте в микрофуге при 16 000 × г в течение 2 мин при 4 °C для сбора митохондриальной сырой фракции.
  14. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую обогащенную митохондриями гранулу с 0,5 мл буфера А, объединив содержимое двух пробирок в одну, и центрифугируйте в тех же условиях, которые описаны в шаге 1.13. Повторяйте тот же процесс, пока весь материал не окажется только в одной пробирке.
  15. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте конечную гранулу 300 мкл буфера А и количественно оцените концентрацию митохондриального белка с помощью анализа Брэдфорда. Снова центрифугируете, как и раньше, и приступайте к разделу 3.

2. Выделение митохондрий из небольшого количества тканей животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное количество ткани для применения этого протокола с определенной степенью уверенности зависит от типа клетки и ее митохондриального распространения, но в большинстве случаев может составлять ~20-30 мг ткани. Образцы тканей могут быть свежим материалом или замороженными образцами. В последнем случае перед началом процедуры дайте образцам оттаять в гомогенизационном буфере, помещенном на лед.

  1. Взвесьте или оцените как можно точнее количество (мг) ткани.
  2. Разрежьте ткань ножницами и сделайте 3-4 промывки в гомогенизационном буфере с помощью ситечка, стараясь не потерять более мелкие кусочки.
    Примечание: Этот этап более важен для таких тканей, как скелетные мышцы или сердце, чем для мозга или более мягких тканей, клетки которых могут быть легко дезагрегированы непосредственно на этапе гомогенизации.
  3. Добавьте свежую гомогенизирующую среду (4 мл на грамм печени, 10 мл на грамм сердца, бурой жировой ткани (БАТ) или мышц и 5 мл на грамм мозга или почек; см. конкретный состав буфера для каждого случая в таблице 1).
  4. Перенесите кусочки ткани с буфером в гомогенизатор и следуйте оптимальному протоколу гомогенизации и выделения митохондрий в зависимости от выбранной ткани.
  5. Выделение митохондрий из печени, селезенки и почек
    1. Гомогенизация с помощью четырех-шести движений вверх-вниз в Elvehjem-Potter с помощью тефлонового пестика с приводом от двигателя при 600 об/мин.
    2. Перенесите гомогенизированную ткань в стерильную центрифужную пробирку. Центрифугируйте в качающемся роторе при давлении 1 000 × g в течение 5 мин при 4 °C.
    3. Заполните полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл надосадочной жидкостью, полученной на предыдущем этапе. Центрифугируйте в течение 2 мин при 16 000 × г в микрофуге при 4 °C и действуйте в дальнейшем, как описано ранее (шаги 1.13 - 1.15)
  6. Выделение митохондрий из образцов сердца и мышц
    1. Гомогенизация с помощью шести-восьми ударов в Elvehjem-Potter с помощью тефлонового пестика с приводом от двигателя при 600 об/мин. Перенесите гомогенизированную ткань в стерильную центрифужную пробирку.
    2. Центрифугируйте в качающемся роторе при давлении 1 000 × g в течение 5 мин при 4 °C. Налейте надосадочную жидкость в чистые полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторая гомогенизация гранулы, полученной на стадии 2.6.2, может быть выполнена с 4-5 дополнительными ходами и 1/2 объема гомогенизационного буфера для увеличения митохондриального выхода. Новый надосадочная жидкость (после повторного центрифугирования при 1000 × г в течение 5 мин при 4°С) может быть объединен с предыдущей жидкостью перед переходом к этапу 2.6.3. Альтернативой увеличению выхода сырых митохондрий является диссоциация образцов сердечной и мышечной ткани в растворе трипсина перед гомогенизацией36,37. В этом случае трипсин должен быть эффективно инактивирован/удален до того, как митохондриальные мембраны будут растворены дигитонином (шаг 3.2).
    3. Центрифугируйте при 16 000 × г в микрофуге в течение 2 мин при 4 °C для получения сырой митохондриальной фракции.
    4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую обогащенную митохондриями гранулу с 0,5 мл буфера AT, объединив содержимое двух пробирок в одну, и центрифугируйте в тех же условиях, которые описаны в шаге 2.6.3. Повторяйте тот же процесс, пока весь материал не окажется только в одной пробирке.
    5. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте конечную гранулу 300 мкл буфера А (без БСА) и количественно оцените концентрацию митохондриального белка с помощью анализа Брэдфорда. Снова центрифугируете, как и раньше, и приступайте к разделу 3.
  7. Выделение митохондрий из мозга
    1. Гомогенизируйте кусочки мозга за 10-15 ударов с помощью стеклянного гомогенизатора типа Dounce с ручным управлением стеклянного пестика. Перенесите гомогенизированную ткань в стерильную центрифужную пробирку.
    2. Центрифугируйте в качающемся роторе при давлении 1 000 × g в течение 5 мин при 4 °C.
    3. Соберите надосадочную жидкость в чистую центрифужную пробирку.
    4. Повторно суспендируйте гранулы, полученные на предыдущей стадии центрифугирования, в том же объеме среды AT, которая использовалась при первой гомогенизации. Повторно гомогенизируйте гранулы, повторяя процесс, описанный на шаге 2.7.1, с использованием 5-10 проходов, и центрифугируйте суспензию в вращающемся роторе при давлении 1000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    5. Снимите надосадочную жидкость и добавьте ее в пробирку, подготовленную на шаге 2.7.3. Центрифугируйте при давлении 10 000 × g в роторе с фиксированным углом наклона в течение 10 мин при 4 °C для получения сырой митохондриальной фракции.
    6. Отбраковать надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулу на 1/2 от начального объема гомогенизации (шаг 2.7.1) среды АТ. Распределите митохондриальную суспензию по чистым полипропиленовым пробиркам объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 16 000 × г в микрофуге в течение 2 мин при 4 °C.
    7. Отбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую обогащенную митохондриями гранулу с 0,5 мл буфера AT, объединив содержимое двух пробирок в одну, и центрифугируйте в тех же условиях, которые описаны на шаге 2.7.6. Повторяйте тот же процесс, пока весь материал не окажется только в одной пробирке.
    8. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте конечную гранулу 300 мкл буфера А (без БСА) и количественно оцените концентрацию митохондриального белка с помощью анализа Брэдфорда. Снова центрифугируете, как и раньше, и приступайте к разделу 3.
  8. Выделение митохондрий из БАТ
    1. Гомогенизация с помощью восьми-десяти движений вверх и вниз в Elvehjem-Potter с помощью тефлонового пестика с приводом от двигателя при 600 об/мин. Перенесите гомогенизированную ткань в стерильную центрифужную пробирку.
    2. Центрифугируйте в качающемся роторе при давлении 1 000 × g в течение 5 мин при 4 °C.
    3. Заполните полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл надосадочной жидкостью, полученной на предыдущем этапе, избегая верхнего слоя жира.
      Примечание: Вторая гомогенизация гранулы, полученной на стадии 2.8.2, может быть выполнена для увеличения митохондриального выхода. Новый надосадочный жидкость (после центрифугирования при 1000 × г в течение 5 мин при 4 °С) можно комбинировать с предыдущей, прежде чем переходить к шагу 2.8.4.
    4. Центрифугировать в течение 2 мин при 16 000 × г в течение 2 мин в микрофуге при 4 °C.
    5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую обогащенную митохондриями гранулу 0,5 мл буфера AT2, объединив содержимое двух пробирок в одну, и центрифугируйте в тех же условиях, которые описаны на шаге 2.8.4. Повторяйте тот же процесс, пока весь материал не окажется только в одной пробирке.
    6. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте конечную гранулу 300 мкл буфера А (без БСА) и количественно оцените концентрацию митохондриального белка с помощью анализа Брэдфорда. Снова центрифугируете, как и раньше, и приступайте к разделу 3.

3. Подготовка образцов для анализа Blue Native

  1. Ресуспендируйте митохондриальные фракции (полученные из культур клеток или тканей млекопитающих) в буфере для проб BN (50 мМ NaCl, 50 мМ имидазола, 5 мМ аминокапроновой кислоты, 4 мМ PMSF) с получением концентрации белка около 10 мг/мл. В таблице 2 приведены ожидаемые выходы для различных типов образцов.
  2. Солюбилизируйте митохондриальные мембраны путем добавления дигитонина (10% исходного раствора) с получением соотношения 4 г дигитонина/г митохондриального белка (4 мкл 10% запаса дигитонина на 10 мкл митохондриальной суспензии, приготовленной на стадии 3.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение моющего средства к белку (г/г) должно быть оптимизировано для каждого типа образца для получения воспроизводимых результатов; Установлено, что оптимальным для большинства тканей является 2-8 г дигитонина/г митохондриального белка34,35.
  3. Перемешивайте, аккуратно пипетируя вверх и вниз. Инкубируйте образцы на льду в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага митохондриальная суспензия должна стать более прозрачной (перейти из непрозрачной в полупрозрачную); В противном случае это может указывать на то, что количество моющего средства недостаточно для правильной мембранной солюбилизации.
  4. Центрифуга на полной скорости в микрофуге (около 20 000 × г ) в течение 25 мин при 4 °C для удаления нерастворимого материала.
  5. Соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку. Добавьте к надосадочной жидкости объем 5% G-250 (Coomassie Blue G-250 5% в 0,75 М аминокапроновой кислоте), что эквивалентно 1/3 первоначального объема ресуспензии (шаг 3.1, это будет соответствовать конечной пропорции 1,6 г Coomassie/г белка) и перемешайте пипетированием.
  6. Перед загрузкой на гель держите на льду или заморозьте аликвоты при -80 °C.

4. Электрофорез в геле Blue Native

ПРИМЕЧАНИЕ: Электрофорез проводится в холодном помещении (4-8 °C). Если холодильная камера отсутствует, в резервуар для электрофореза может быть введен блок охлаждения. Используются коммерческие 3-13% нативные полиакриламидные гели29, но можно использовать и самодельные гели нужной градиентной концентрации38,39.

  1. Загрузите верхнюю и нижнюю камеры с холодным катодом А и анодными буферами соответственно. В качестве альтернативы загрузите образцы в лунки перед тщательным заполнением верхней камеры катодным буфером А.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории используются коммерческие буферы для электрофореза, но их можно приготовить, как указано в таблице 1.
  2. Загрузите от 30 до 100 мкг митохондриального белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно 30-50 мкг белка (для WB) или 40-100 мкг белка (для IGA) загружают в одну лунку в 10-полосный гель (лунки 0,5 х 0,15 см). Буфер катода А содержит Coomassie Blue G-250 и имеет интенсивный синий цвет, что затрудняет видимость гелевых лунок для загрузки образца. Центр каждой лунки удобно отмечать красным маркером, например, чтобы помочь в размещении наконечника пипетки на этом этапе. Нативные маркеры молекулярной массы могут быть полезны при настройке метода BN-PAGE для подтверждения правильности формирования градиентных гелей и правильности шаблона комплексов и СК.
  3. Работайте при напряжении 80-100 В в течение 25-30 минут, а затем при напряжении 160-180 В, ограничивая ток до 12 мА/гель, пока краситель не достигнет дна геля (~125-165 минут всего).
  4. Если необходимо провести анализ активности в геле (IGA), замените катодный буфер A на катодный буфер B, когда фронт красителя находится в середине геля (~1 ч после начала прогона).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя гели могут быть задокументированы без какого-либо окрашивания сразу после прогона, поскольку некоторые полосы видны (в основном комплекс V, который можно считать «внутренним» производителем с MW ~600 кДа) из-за их связывания с красителем G-250, обычно SC и отдельные комплексы не будут видны без окрашивания или анализа IGA. Гели, которые будут использоваться в анализах IGA или для WB, не должны быть окрашены или зафиксированы.
  5. Разберите гель из кассеты и продолжайте окрашивание синим цветом Кумасси (раздел 5), анализ IGA (раздел 6) или иммунодетектирование WB (раздел 7).

5. Окрашивание гелем

  1. Окрашивать гель в течение 10-15 мин при комнатной температуре (RT) с использованием растворов красителя Coomassie blue (краситель Coomassie R-250 в 0,25% в 40% метанола, 10% уксусной кислоты; окрашивать в течение 10-15 мин).
  2. Удаление пятен с помощью нескольких промывок (обычно 4-5 x 15 минут) в 40% метаноле плюс 10% уксусной кислоте при RT.
  3. Задокументируйте гель.

6. В анализах гелеактивности (IGA)

  1. Приготовьте растворы ИГА для анализа различных дыхательных комплексов до окончания электрофореза и храните их в темноте (например, используя пластиковые коробки темного цвета или накрывая их алюминиевой фольгой). Состав каждого буфера подробно описан в таблице 1.
  2. Поместите гель или дорожки, которые будут использоваться, в пластиковую коробку как можно меньшего размера, чтобы вместить их.
  3. Добавьте достаточный объем соответствующего раствора, чтобы покрыть гель (обычно 5 или 10 мл на 5 или 10 гелевых дорожек соответственно) и инкубируйте при РТ с легким встряхиванием (60-80 об/мин) и вдали от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от анализируемого комплекса, а также от характера и количества загружаемого образца; CI и CIV являются самыми простыми и быстрыми для получения результатов. Таким образом, активность CI обычно начинает становиться видимой через несколько минут, в то время как для наблюдения CII и CIV требуется ~30 минут, а CV ~1,5-2 часа. Во всех случаях реакция может продолжаться часами, а скорость интенсификации сигнала может быть снижена путем переноса инкубации в холодное помещение (4-6 °C), например, для ночной (ON) инкубации. Активность CIII работает только для прозрачного нативного электрофореза (ЦН), но не для BN34.
  4. Когда соответствующие полосы разовьются, остановите реакцию, удалив растворы для анализа, промыв 2 раза дистиллированной водой и закрепив гель 40% метанола плюс 10% уксусной кислоты (за исключением CV, который фиксируется только метанолом) на 30 минут.
    1. Чтобы проанализировать активность CIV после обнаружения CI с помощью IGA, промойте гель 2 раза дистиллированной водой, задокументируйте активность CI, инкубируйте гель (без фиксации!) с 50 мМ буфером фосфата калия (pH 7,2) 2 раза в течение 30 минут, а затем с полным реакционным буфером CIV до появления сложных полос IV (обычно путем инкубации при RT или 4 °C).
  5. Задокументируйте гели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для активности АТФазы, поскольку развитые полосы имеют белый цвет, при документировании геля поместите его на темный фон так, чтобы прозрачные полосы были видны.

7. Вестерн-блоттинг

  1. Приготовьте буфер для переноса в соответствии с таблицей 1 и поддерживайте при температуре 4 °C до окончания электрофореза.
  2. Поместите гель в лоток и добавьте буфер для переноса. Инкубировать при RT в течение 10-15 минут.
  3. Отрежьте кусок мембраны из ПВДФ того же размера, что и гель, и активируйте его в метаноле на 10 с при перемешивании. Промойте несколько раз дистиллированной водой и добавьте буфер для переноса. Выдерживать при RT в течение 10-15 мин с легким встряхиванием.
  4. Приготовьте бутерброд для переноса снизу вверх, избегая пузырей между гелем и мембраной, в следующем порядке: черная сторона кассеты - губка-промокательная бумага-гель-мембрана-промокательная бумага-губка-прозрачная сторона кассеты.
  5. Закройте и заблокируйте кассету и поместите сэндвич в передаточный бак в правильном положении для переноса (черной стороной по направлению к отрицательному полюсу).
  6. Заполните передаточный бак буфером для переноса, добавьте магнитную мешалку для перемешивания буфера и подключите источник питания от напряжения 80 В на 2 часа или от напряжения 100 В на 1 час. Выполняйте пересадку при температуре от 4 до 8 °C (например, в холодильной камере) и с помощью охлаждающего блока в системе передачи.
  7. Извлеките мембрану и продолжайте следовать стандартному протоколу вестерн-блоттинга, используя специфические антитела к различным респираторным комплексам, которые должны быть обнаружены29.

Результаты

Выход митохондрий, полученных в соответствии с описанными выше протоколами, варьируется в зависимости от нескольких факторов, таких как клеточная линия или тип ткани, характер образцов (т.е. используются ли свежие или замороженные ткани) или эффективность процесса гомогенизации. Ожида...

Обсуждение

Методологические адаптации, внесенные в описанные здесь протоколы, призваны избежать потерь и увеличить выход при сохранении активности митохондриального комплекса (что имеет решающее значение при ограничении доступности достаточного количества образцов) и воспроизвести ожидаемый...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом No "PGC2018-095795-B-I00" от Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) и грантами "Grupo de Referencia: E35_17R" и грантом No "LMP220_21" от Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) для PF-S и RM-L.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidPanReac131008
Aminocaproic acidFluka Analytical7260
ATPSigma-AldrichA2383
Bis TrisAcrons Organics327721000
Bradford assayBiorad5000002
Coomassie Blue G-250Serva17524
Coomassie Blue R-250Merck1125530025
Cytochrome cSigma-AldrichC2506
Diamino  benzidine (DAB)Sigma-AldrichD5637
DigitoninSigma-AldrichD5628
EDTAPanReac131669
EGTASigma-AldrichE3889
Fatty acids free BSARoche10775835001
GlycinePanReacA1067
Homogenizer Teflon pestleDeltalab196102
ImidazoleSigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
MannitolSigma-AldrichM4125
MethanolLabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
Mini Trans-Blot CellBioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1 Monoclonal AntibodyInvitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein GelsInvitrogenBN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE Running Buffer (20x) InvitrogenBN2001
NDUFA9 Monoclonal AntibodyInvitrogen459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)Sigma-AldrichN6876
Pb(NO3)2Sigma-Aldrich228621
PDVF MembraneAmersham10600023
Phenazine methasulfate (PMS)Sigma-AldrichP9625
Pierce ECL SubstrateThermo Scientific32106
PMSFMerckPMSF-RO
SDHA Monoclonal AntibodyInvitrogen459200
Sodium succinateSigma-AldrichS2378
Streptomycin/penicillinPAN biotechP06-07100
SucroseSigma-AldrichS3089
TrisPanReacA2264
UQCRC1 Monoclonal AntibodyInvitrogen459140
XCell SureLock Mini-CellInvitrogen EI0001

Ссылки

  1. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  2. Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  3. Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).
  4. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  5. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  6. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  7. Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes. EMBO Rep. 24 (11), e57092 (2023).
  8. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  9. Milenkovic, D., et al. Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes. Cell Metab. 35 (10), 1799-1813 (2023).
  10. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  11. Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P., Ostojic, S. . Clinical Bioenergetics. , 3-60 (2021).
  12. Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain. Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).
  13. Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role. Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).
  14. Lopez-Fabuel, I., et al. Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).
  15. Mukherjee, S., Ghosh, A. Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases. Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).
  16. Nesci, S., et al. Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology. Life (Basel). 11 (3), 242 (2021).
  17. Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).
  18. Morant-Ferrando, B., et al. Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition. Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).
  19. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients. J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).
  20. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  21. Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935 (2020).
  22. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  23. Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600 (2020).
  24. Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging. Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).
  25. Hollinshead, K. E. R., et al. Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer. Cell Rep. 33 (1), 108231 (2020).
  26. Ikeda, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance. Nat Commun. 10 (1), 4108 (2019).
  27. Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer. Front Cell Dev Biol. 10, 717881 (2022).
  28. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers (Basel). 11 (7), 1027 (2019).
  29. Moreno-Loshuertos, R., et al. How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria. Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).
  30. Vonck, J., Schafer, E. Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).
  31. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  32. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  33. Gonzalez-Franquesa, A., et al. Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity. Cell Rep. 35 (8), 109180 (2021).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).
  35. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  36. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. J Vis Exp. (49), e2452 (2011).
  37. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182 (2019).
  38. Schagger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).
  39. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  40. Chomyn, A., et al. Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers. Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).
  41. Moreno-Loshuertos, R., et al. Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants. Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).
  42. Fernández-Vizarra, E., Fernández-Silva, P., Enríquez, J. A., Celis, J. E. . Cell Biology (Third Edition). , 69-77 (2006).
  43. Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены