Выделение митохондрий для анализа митохондриального сверхкомплекса из образцов мелких тканей и клеточных культур

Резюме

Этот протокол описывает методику анализа дыхательных суперкомплексов при наличии только небольшого количества образцов.

Аннотация

За последние десятилетия накопленные данные о существовании дыхательных суперкомплексов (СК) изменили наше представление об организации митохондриальной электронно-транспортной цепи, что привело к предложению «модели пластичности». Эта модель постулирует сосуществование различных пропорций СК и комплексов в зависимости от ткани или метаболического статуса клеток. Динамический характер сборки в СК позволит клеткам оптимизировать использование доступного топлива и эффективность переноса электронов, сводя к минимуму образование активных форм кислорода и способствуя способности клеток адаптироваться к изменениям окружающей среды.

В последнее время сообщалось об аномалиях сборки СК при различных заболеваниях, таких как нейродегенеративные расстройства (болезнь Альцгеймера и Паркинсона), синдром Барта, синдром Ли или рак. Роль изменений сборки СК в прогрессировании заболевания все еще нуждается в подтверждении. Тем не менее, наличие достаточного количества образцов для определения состояния сборки SC часто является проблемой. Это происходит с биопсией или образцами тканей, которые малы или должны быть разделены для нескольких анализов, с культурами клеток, которые имеют медленный рост или получены из микрофлюидных устройств, с некоторыми первичными культурами или редкими клетками, или когда необходимо проанализировать эффект конкретных дорогостоящих методов лечения (с наночастицами, очень дорогими соединениями и т. д.). В этих случаях требуется эффективный и простой в применении метод. В данной работе представлен метод, адаптированный для получения обогащенных митохондриальных фракций из небольшого количества клеток или тканей для анализа структуры и функции митохондриальных СК с помощью нативного электрофореза с последующим анализом активности в геле или вестерн-блоттингом.

Введение

Суперкомплексы (СК) представляют собой супрамолекулярные ассоциации между отдельными комплексами дыхательной цепи ^1,2. Поскольку первоначальная идентификация СК и описание их состава по группе Шеггера ^2,3, в дальнейшем подтвержденные другими группами, было установлено, что они содержат дыхательные комплексы I, III и IV (CI, CIII и CIV соответственно) в разных стехиометриях. Можно выделить две основные популяции СК: содержащие ДИ (и либо только CIII, либо CIII и CIV) и с очень высокой молекулярной массой (MW, начиная с ~1,5 MDa для меньших SC: CI + CIII....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Состав всех питательных сред и буферов указан в таблице 1 , а подробности, относящиеся ко всем материалам и реагентам, используемым в этом протоколе, перечислены в таблице материалов.

1. Выделение митохондрий из клеточной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный объем анализируемых клеток составляет ~30-50 мкл упакованных клеток (шаг 1.4). Это может примерно соответствовать по меньшей мере двум или трем 100 мм клеточным культуральным планшетам или одному 150 мм планшету на 80-90% конфлюенса, в зависимости от типа клеток (от 5 × 10⁶ до 10⁷ ....

Результаты

Выход митохондрий, полученных в соответствии с описанными выше протоколами, варьируется в зависимости от нескольких факторов, таких как клеточная линия или тип ткани, характер образцов (т.е. используются ли свежие или замороженные ткани) или эффективность процесса гомогенизации. Ожида.......

Обсуждение

Методологические адаптации, внесенные в описанные здесь протоколы, призваны избежать потерь и увеличить выход при сохранении активности митохондриального комплекса (что имеет решающее значение при ограничении доступности достаточного количества образцов) и воспроизвести ожидаемый.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	PanReac	131008
Aminocaproic acid	Fluka Analytical	7260
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Bis Tris	Acrons Organics	327721000
Bradford assay	Biorad	5000002
Coomassie Blue G-250	Serva	17524
Coomassie Blue R-250	Merck	1125530025
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506
Diamino  benzidine (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
EDTA	PanReac	131669
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fatty acids free BSA	Roche	10775835001
Glycine	PanReac	A1067
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
K2HPO4	PanReac	121512
KH2PO4	PanReac	121509
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Methanol	Labkem	MTOL-P0P
MgSO4	PanReac	131404
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MTCO1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459600
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels	Invitrogen	BN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)	Invitrogen	BN2002
NativePAGE Running Buffer (20x)	Invitrogen	BN2001
NDUFA9 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876
Pb(NO3)2	Sigma-Aldrich	228621
PDVF Membrane	Amersham	10600023
Phenazine methasulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
Pierce ECL Substrate	Thermo Scientific	32106
PMSF	Merck	PMSF-RO
SDHA Monoclonal Antibody	Invitrogen	459200
Sodium succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
Tris	PanReac	A2264
UQCRC1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459140
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001