Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Этот протокол описывает методику анализа дыхательных суперкомплексов при наличии только небольшого количества образцов.
За последние десятилетия накопленные данные о существовании дыхательных суперкомплексов (СК) изменили наше представление об организации митохондриальной электронно-транспортной цепи, что привело к предложению «модели пластичности». Эта модель постулирует сосуществование различных пропорций СК и комплексов в зависимости от ткани или метаболического статуса клеток. Динамический характер сборки в СК позволит клеткам оптимизировать использование доступного топлива и эффективность переноса электронов, сводя к минимуму образование активных форм кислорода и способствуя способности клеток адаптироваться к изменениям окружающей среды.
В последнее время сообщалось об аномалиях сборки СК при различных заболеваниях, таких как нейродегенеративные расстройства (болезнь Альцгеймера и Паркинсона), синдром Барта, синдром Ли или рак. Роль изменений сборки СК в прогрессировании заболевания все еще нуждается в подтверждении. Тем не менее, наличие достаточного количества образцов для определения состояния сборки SC часто является проблемой. Это происходит с биопсией или образцами тканей, которые малы или должны быть разделены для нескольких анализов, с культурами клеток, которые имеют медленный рост или получены из микрофлюидных устройств, с некоторыми первичными культурами или редкими клетками, или когда необходимо проанализировать эффект конкретных дорогостоящих методов лечения (с наночастицами, очень дорогими соединениями и т. д.). В этих случаях требуется эффективный и простой в применении метод. В данной работе представлен метод, адаптированный для получения обогащенных митохондриальных фракций из небольшого количества клеток или тканей для анализа структуры и функции митохондриальных СК с помощью нативного электрофореза с последующим анализом активности в геле или вестерн-блоттингом.
Суперкомплексы (СК) представляют собой супрамолекулярные ассоциации между отдельными комплексами дыхательной цепи 1,2. Поскольку первоначальная идентификация СК и описание их состава по группе Шеггера 2,3, в дальнейшем подтвержденные другими группами, было установлено, что они содержат дыхательные комплексы I, III и IV (CI, CIII и CIV соответственно) в разных стехиометриях. Можно выделить две основные популяции СК: содержащие ДИ (и либо только CIII, либо CIII и CIV) и с очень высокой молекулярной массой (MW, начиная с ~1,5 MDa для меньших SC: CI + CIII....
ПРИМЕЧАНИЕ: Состав всех питательных сред и буферов указан в таблице 1 , а подробности, относящиеся ко всем материалам и реагентам, используемым в этом протоколе, перечислены в таблице материалов.
1. Выделение митохондрий из клеточной культуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный объем анализируемых клеток составляет ~30-50 мкл упакованных клеток (шаг 1.4). Это может примерно соответствовать по меньшей мере двум или трем 100 мм клеточным культуральным планшетам или одному 150 мм планшету на 80-90% конфлюенса, в зависимости от типа клеток (от 5 × 106 до 107 ....
Выход митохондрий, полученных в соответствии с описанными выше протоколами, варьируется в зависимости от нескольких факторов, таких как клеточная линия или тип ткани, характер образцов (т.е. используются ли свежие или замороженные ткани) или эффективность процесса гомогенизации. Ожида.......
Методологические адаптации, внесенные в описанные здесь протоколы, призваны избежать потерь и увеличить выход при сохранении активности митохондриального комплекса (что имеет решающее значение при ограничении доступности достаточного количества образцов) и воспроизвести ожидаемый.......
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта работа была поддержана грантом No "PGC2018-095795-B-I00" от Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) и грантами "Grupo de Referencia: E35_17R" и грантом No "LMP220_21" от Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) для PF-S и RM-L.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetic acid | PanReac | 131008 | |
Aminocaproic acid | Fluka Analytical | 7260 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Bis Tris | Acrons Organics | 327721000 | |
Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
Coomassie Blue G-250 | Serva | 17524 | |
Coomassie Blue R-250 | Merck | 1125530025 | |
Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | |
Diamino benzidine (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
EDTA | PanReac | 131669 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Fatty acids free BSA | Roche | 10775835001 | |
Glycine | PanReac | A1067 | |
Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
K2HPO4 | PanReac | 121512 | |
KH2PO4 | PanReac | 121509 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
Methanol | Labkem | MTOL-P0P | |
MgSO4 | PanReac | 131404 | |
Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
MTCO1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459600 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NADH | Roche | 10107735001 | |
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels | Invitrogen | BN1001BOX | |
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x) | Invitrogen | BN2002 | |
NativePAGE Running Buffer (20x) | Invitrogen | BN2001 | |
NDUFA9 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459100 | |
Nitroblue tetrazolium salt (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 | |
Pb(NO3)2 | Sigma-Aldrich | 228621 | |
PDVF Membrane | Amersham | 10600023 | |
Phenazine methasulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
Pierce ECL Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
PMSF | Merck | PMSF-RO | |
SDHA Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459200 | |
Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
Tris | PanReac | A2264 | |
UQCRC1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459140 | |
XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены