ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples)

要約

このプロトコルは、少量のサンプルしか利用できない場合の呼吸スーパーコンプレックスの分析技術について説明しています。

要約

過去数十年にわたって、呼吸超複合体(SC)の存在に関する証拠が蓄積され、ミトコンドリアの電子伝達鎖組織に対する私たちの理解が変わり、「可塑性モデル」の提案が生まれました。このモデルは、組織または細胞の代謝状態に応じて、SCと複合体の異なる比率の共存を仮定しています。SCにおけるアセンブリの動的な性質により、細胞は利用可能な燃料の使用と電子移動の効率を最適化し、活性酸素種の生成を最小限に抑え、環境変化に適応する細胞の能力を促進することができます。

最近では、神経変性疾患(アルツハイマー病およびパーキンソン病)、バース症候群、リー症候群、癌などのさまざまな疾患でSCアセンブリの異常が報告されています。疾患の進行におけるSCアセンブリの変化の役割は、まだ確認する必要があります。それにもかかわらず、SCアセンブリの状態を判断するのに十分な量のサンプルが入手可能であることは、しばしば課題となります。これは、生検や組織サンプルが小さい、または複数の分析のために分割する必要がある、成長が遅い細胞培養やマイクロ流体デバイスに由来する細胞培養、一部の一次培養物や希少細胞、または特定の高価な治療の影響を分析する必要がある場合(ナノ粒子、非常に高価な化合物など)に発生します。このような場合には、効率的で適用しやすい方法が求められます。この論文では、少量の細胞または組織から濃縮されたミトコンドリア画分を取得し、天然電気泳動とそれに続くゲル内活性アッセイまたはウェスタンブロットによるミトコンドリアSCの構造と機能を分析するための適応法を示します。

概要

スーパーコンプレックス(SC)は、個々の呼吸鎖複合体^1,2間の超分子的会合である。Schägger ^2,3のグループによるSCの最初の同定とその組成の説明以来、SCは異なる化学量論で呼吸複合体I、III、およびIV(CI、CIII、およびCIV)を含むことが確立されました。SCの2つの主要な集団、CIを含むもの(およびCIII単独またはCIIIとCIV)で、非常に高分子量(MW、小さいSCで~1.5MDaから開始:CI + CIII₂)と、CIIIとCIVを含み、CIVを含まないもの、はるかに小さいサイズ(~680kDaのCIII₂ + CIVなど)の2つの主要な集団を定義することができます。これらのSCは、ミトコンドリア内膜に遊離複合体と共存し、これも異なる割合で存在します。したがって、CIは主にその関連型(つまり、SCで:ウシの心臓で~80%、多くのヒト細胞タイプで90%以上)³で見られますが、CIVは遊離型で非常に豊富(ウシの心臓で80%以上)であり、CIIIはよりバランスの取れた分布を示しています(より豊富な遊離型で~40%、 二量体として、ウシの心臓で)。

プロトコル

注:すべての培地および緩衝液の組成は 表1 に規定されており、このプロトコルで使用されるすべての材料および試薬に関連する詳細は 、材料の表に記載されています。

1. 細胞培養からのミトコンドリアの単離

注:アッセイされた細胞の最小量は、パックされた細胞の~30-50μLです(ステップ1.4)。これは、細胞タイプ(L929由来細胞またはMDA-MB-468の5×10⁶ および10⁷ 細胞)に応じて、少なくとも2つまたは3つの100 mm細胞培養プレート、または80〜90%のコンフルエンスで1つの150 mmプレートに約1つ対応できます。効率的なセル破損は重要なステップです。

1. 接着細胞を約80%のコンフルエントまで増殖させるか、懸濁細胞を適切な密度まで増殖させます。
2. 500 × g で5分間遠心分離することにより細胞を回収します(非接着性細胞の場合は細胞懸濁液から直接、または接着細胞の場合は1x PBS中の0.05%トリプシンおよび0.02%EDTAのトリプシン-EDTA溶液による標準トリプシン化後)。
3. 細胞を冷冷PBS1倍で2回洗浄し、500 × g で5分間遠心分離して沈殿させます。....

ディスカッション

ここで説明するプロトコルで導入された方法論的適応は、ミトコンドリアの複雑な活性を維持しながら損失を回避し、収量を増加させることを目的としています(これは、十分な量のサンプルの利用可能性が損なわれた場合に重要です)そして、組織または細胞株の予想されるSCのパターンを再現することを目的としています( 図2Cを参照)).この目的により、SCを適切に検出.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	PanReac	131008
Aminocaproic acid	Fluka Analytical	7260
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Bis Tris	Acrons Organics	327721000
Bradford assay	Biorad	5000002
Coomassie Blue G-250	Serva	17524
Coomassie Blue R-250	Merck	1125530025
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506
Diamino  benzidine (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
EDTA	PanReac	131669
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fatty acids free BSA	Roche	10775835001
Glycine	PanReac	A1067
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
K2HPO4	PanReac	121512
KH2PO4	PanReac	121509
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Methanol	Labkem	MTOL-P0P
MgSO4	PanReac	131404
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MTCO1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459600
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels	Invitrogen	BN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)	Invitrogen	BN2002
NativePAGE Running Buffer (20x)	Invitrogen	BN2001
NDUFA9 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876
Pb(NO3)2	Sigma-Aldrich	228621
PDVF Membrane	Amersham	10600023
Phenazine methasulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
Pierce ECL Substrate	Thermo Scientific	32106
PMSF	Merck	PMSF-RO
SDHA Monoclonal Antibody	Invitrogen	459200
Sodium succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
Tris	PanReac	A2264
UQCRC1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459140
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001