著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

このプロトコルは、少量のサンプルしか利用できない場合の呼吸スーパーコンプレックスの分析技術について説明しています。

要約

過去数十年にわたって、呼吸超複合体(SC)の存在に関する証拠が蓄積され、ミトコンドリアの電子伝達鎖組織に対する私たちの理解が変わり、「可塑性モデル」の提案が生まれました。このモデルは、組織または細胞の代謝状態に応じて、SCと複合体の異なる比率の共存を仮定しています。SCにおけるアセンブリの動的な性質により、細胞は利用可能な燃料の使用と電子移動の効率を最適化し、活性酸素種の生成を最小限に抑え、環境変化に適応する細胞の能力を促進することができます。

最近では、神経変性疾患(アルツハイマー病およびパーキンソン病)、バース症候群、リー症候群、癌などのさまざまな疾患でSCアセンブリの異常が報告されています。疾患の進行におけるSCアセンブリの変化の役割は、まだ確認する必要があります。それにもかかわらず、SCアセンブリの状態を判断するのに十分な量のサンプルが入手可能であることは、しばしば課題となります。これは、生検や組織サンプルが小さい、または複数の分析のために分割する必要がある、成長が遅い細胞培養やマイクロ流体デバイスに由来する細胞培養、一部の一次培養物や希少細胞、または特定の高価な治療の影響を分析する必要がある場合(ナノ粒子、非常に高価な化合物など)に発生します。このような場合には、効率的で適用しやすい方法が求められます。この論文では、少量の細胞または組織から濃縮されたミトコンドリア画分を取得し、天然電気泳動とそれに続くゲル内活性アッセイまたはウェスタンブロットによるミトコンドリアSCの構造と機能を分析するための適応法を示します。

概要

スーパーコンプレックス(SC)は、個々の呼吸鎖複合体1,2間の超分子的会合である。Schägger 2,3のグループによるSCの最初の同定とその組成の説明以来、SCは異なる化学量論で呼吸複合体I、III、およびIV(CI、CIII、およびCIV)を含むことが確立されました。SCの2つの主要な集団、CIを含むもの(およびCIII単独またはCIIIとCIV)で、非常に高分子量(MW、小さいSCで~1.5MDaから開始:CI + CIII2)と、CIIIとCIVを含み、CIVを含まないもの、はるかに小さいサイズ(~680kDaのCIII2 + CIVなど)の2つの主要な集団を定義することができます。これらのSCは、ミトコンドリア内膜に遊離複合体と共存し、これも異なる割合で存在します。したがって、CIは主にその関連型(つまり、SCで:ウシの心臓で~80%、多くのヒト細胞タイプで90%以上)3で見られますが、CIVは遊離型で非常に豊富(ウシの心臓で80%以上)であり、CIIIはよりバランスの取れた分布を示しています(より豊富な遊離型で~40%、 二量体として、ウシの心臓で)。

彼らの存在は現在一般的に受け入れられていますが、その正確な役割はまだ議論の余地があります4,5,6,7,8,9,10。可塑性モデルによれば、細胞タイプまたは代謝状態1,7,11に応じて、SCおよび個々の複合体の異なる比率が存在することができる。このアセンブリの動的な性質により、細胞は利用可能な燃料の使用と、環境変化に応答した酸化的リン酸化(OXPHOS)システムの効率を調節することができる4,5,7。SCはまた、活性酸素種の生成速度を制御し、個々の複合体4,12,13,14の安定化および代謝回転に関与することにも貢献できる。SCアセンブリ状態の変形は、異なる生理学的および病理学的状況15,16および老化プロセス17に関連して記載されている。

したがって、SCパターンの変化は、増殖に用いる炭素源に依存する酵母2およびグルコースがガラクトース4に置換されたときの培養哺乳動物細胞において記載されている。修飾は、絶食後のマウスの肝臓8およびミトコンドリア脂肪酸酸化がブロックされたときのアストロサイトでも報告されています18。さらに、SCおよびOXPHOSの減少または変化は、バルト症候群19、心不全20、いくつかの代謝21および神経学的22,23,24障害、および異なる腫瘍25,26,27,28で発見されています.SCアセンブリとレベルのこれらの変化が主要な原因であるか、またはこれらの病理学的状況における二次的な影響を表しているかどうかは、まだ調査中です15,16。さまざまな方法論により、SCの組み立てと機能に関する情報を得ることができます。これらには、活動測定8,29、超微細構造解析30,31、およびプロテオミクス32,33が含まれます。ますます採用されつつあり、前述のいくつかの方法論の出発点となっている有用な代替手段は、Schäggerのグループ34,35によってこの目的のために開発されたBlueネイティブ(BN)電気泳動によるSCアセンブリの状態の直接決定です。

このアプローチでは、ミトコンドリア膜を取得して可溶化するための再現性のある効率的な手順が必要であり、ゲル内活性分析(IGA)、2次元電気泳動、ウェスタンブロット(WB)などの他の手法で補完できます。BN電気泳動によるSCダイナミクスの研究における制限は、開始細胞または組織サンプルの量である可能性があります。Schäggerのグループ法から適応されたSCアセンブリと機能の分析のための一連のプロトコルを提示し、わずか20 mgの組織から始まる新鮮または凍結の細胞または組織サンプルに適用できます。

プロトコル

注:すべての培地および緩衝液の組成は 表1 に規定されており、このプロトコルで使用されるすべての材料および試薬に関連する詳細は 、材料の表に記載されています。

1. 細胞培養からのミトコンドリアの単離

注:アッセイされた細胞の最小量は、パックされた細胞の~30-50μLです(ステップ1.4)。これは、細胞タイプ(L929由来細胞またはMDA-MB-468の5×106 および107 細胞)に応じて、少なくとも2つまたは3つの100 mm細胞培養プレート、または80〜90%のコンフルエンスで1つの150 mmプレートに約1つ対応できます。効率的なセル破損は重要なステップです。

  1. 接着細胞を約80%のコンフルエントまで増殖させるか、懸濁細胞を適切な密度まで増殖させます。
  2. 500 × g で5分間遠心分離することにより細胞を回収します(非接着性細胞の場合は細胞懸濁液から直接、または接着細胞の場合は1x PBS中の0.05%トリプシンおよび0.02%EDTAのトリプシン-EDTA溶液による標準トリプシン化後)。
  3. 細胞を冷冷PBS1倍で2回洗浄し、500 × g で5分間遠心分離して沈殿させます。
    注:この時点から、すべてのステップを4°Cで実行する必要があります。 したがって、すべての試薬は冷たくなければならず、細胞またはミトコンドリアを含むチューブは氷の上に置いておく必要があります。
  4. 2回目の遠心分離後、上清を廃棄し、細胞ペレット量(cpv)を推定し、ステップ1.8で膜の破壊を促進するために、細胞を-80°Cで少なくとも15分間凍結します。
    注:この時点でプロトコールを停止することができ、細胞は-80°Cで数週間保存できます。通常、円錐形の底部を持つ10または15mLの目盛り付きチューブが適切です。
  5. 細胞を氷の上でゆっくりと解凍します。
  6. パックされた細胞ペレットを、cpvの7倍(10 mM MOPS、83 mMスクロース、pH 7.2)に等しい容量の低張バッファーに再懸濁します(例:700 μLのバッファーに100 μLのパックされた細胞)。
    注意: 効率的な ポップスを得るには、音量が十分である必要があります(手順1.8のメモを参照)。
  7. 細胞懸濁液を適切なサイズのPotter-Dounceホモジナイザーに移し、細胞を氷中で2分間インキュベートして膨潤させます。例えば、700〜800μLの細胞懸濁液の場合、1mLの容量のホモジナイザーで十分です。
  8. 600rpmで回転するモーター駆動のテフロン乳棒に結合されたホモジナイザーで8〜10回のストロークを行うことにより、細胞膜を破砕します。
    注:ストロークを行うときは、細胞の破損効率を高める真空を作り出すことが重要です。また、膜の膨潤と骨折のための低張作用と凍結作用がそれぞれ行われます。うまくいけば、ホモジナイザーを一筆一筆に素早い動きで引き下げるときに「ポン」という音がします。
  9. 細胞懸濁液(cpvの7倍)に同量の高張緩衝液(30 mM MOPS、250 mMスクロース、pH 7.2)を添加して、等張性環境を作り出します。
  10. ホモジネートを10〜15 mLのチューブに移し、固定ローターで1,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。
    注:この目的には、壊れていない細胞を含む元のチューブを使用できます。
  11. ミトコンドリア画分を含む上清を1.5mLのポリプロピレンチューブに移します。
  12. オプション:ミトコンドリアの収量を増やすには、ステップ1.10から緩衝液A(10 mM Tris、1 mM EDTA、0.32 Mスクロース、pH 7.4)の細胞ペレット容量の7倍にペレットを再懸濁し、ピペッティングを上下させ、1,000 ×gで4°Cで5分間遠心分離します。 新しい上清を前の上清と結合してから、手順 1.13 に進みます。
  13. 16,000 × g のマイクロフュージで4°Cで2分間遠心分離し、ミトコンドリア粗画分を回収します。
  14. 上清を捨て、ミトコンドリアが豊富な各ペレットを0.5 mLのバッファーAで再懸濁し、2つのチューブの内容物を1つに結合し、ステップ1.13で説明したのと同じ条件下で遠心分離します。すべての材料が1本のチューブだけに収まるまで、同じプロセスを繰り返します。
  15. 上清を捨て、最終ペレットを300 μLのバッファーAで再懸濁し、Bradfordアッセイを使用してミトコンドリアタンパク質濃度を定量します。前回と同様に再度遠心分離を行い、セクション3に進みます。

2. 微量の動物組織からのミトコンドリアの単離

注:このプロトコルを一定の信頼性で適用するための組織の最小量は、細胞の種類とそのミトコンドリアの存在量によって異なりますが、ほとんどの場合、組織の20~30mgになる可能性があります。組織サンプルは、新鮮な材料または凍結サンプルにすることができます。後者の場合、手順を開始する前に、氷上に置かれた均質化バッファーでサンプルを解凍します。

  1. 組織の量(mg)をできるだけ近くに計量または推定します。
  2. ハサミで組織を切断し、小さな断片を失わないように注意しながら、ストレーナーの助けを借りて均質化バッファーで3〜4回の洗浄を行います。
    注:このステップは、脳やホモジナイゼーションステップによって細胞が直接容易に分解できる柔らかい組織よりも、骨格筋や心臓などの組織でより重要です。
  3. 新鮮な均質化培地(肝臓1グラムあたり4 mL、心臓、褐色脂肪組織(BAT)または筋肉1グラムあたり10 mL、脳または腎臓1グラムあたり5 mL; 表1の各ケースの特定の緩衝液組成を参照)を添加します。
  4. バッファーを含む組織片をホモジナイザーに移し、選択した組織に応じて最適なホモジナイズおよびミトコンドリア分離プロトコルに従います。
  5. 肝臓、脾臓、腎臓からのミトコンドリアの分離
    1. Elvehjem-Potterで4〜6回の上下ストロークで均質化し、モーター駆動のテフロン乳棒を600rpmで使用します。
    2. 均質化された組織を滅菌遠心分離チューブに移します。スイングローターで1,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。
    3. 1.5 mLのポリプロピレンチューブに、前のステップで得られた上清を入れます。4°Cのマイクロフュージで16,000 × g で2分間遠心分離し、以下で説明したように進めます(ステップ1.13から1.15)。
  6. 心臓および筋肉サンプルからのミトコンドリアの単離
    1. Elvehjem-Potterで600rpmのモーター駆動のテフロン乳棒を使用して6〜8ストロークで均質化します。均質化された組織を滅菌遠心分離チューブに移します。
    2. スイングローターで1,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。 上清をきれいな1.5mLポリプロピレンチューブに注ぎます。
      注:ステップ2.6.2で得られたペレットの2回目の均質化は、ミトコンドリアの収率を増加させるために、4〜5回の追加ストロークと1/2容量の均質化バッファーで行うことができます。新しい上清(再び1,000 × gで4°Cで5分間遠心分離した後)は、ステップ2.6.3に進む前に前の上清と組み合わせることができます。粗ミトコンドリアの収率を増加させるための代替手段は、均質化36,37の前にトリプシン溶液中の心臓および筋肉組織サンプルを解離することである。この場合、ミトコンドリア膜がジギトニンで可溶化される前に、トリプシンを効率的に不活性化/除去する必要があります(ステップ3.2)。
    3. 16,000 g×gのマイクロフュー ジで4 °Cで2分間遠心分離し、粗ミトコンドリア画分を得ます。
    4. 上清を捨て、ミトコンドリアが豊富な各ペレットを0.5 mLの緩衝液ATで再懸濁し、2つのチューブの内容物を1つに結合し、ステップ2.6.3で説明したのと同じ条件で遠心分離します。すべての材料が1本のチューブだけに収まるまで、同じプロセスを繰り返します。
    5. 上清を廃棄し、最終ペレットを300 μLのバッファーA(BSAなし)で再懸濁し、Bradfordアッセイを使用してミトコンドリアタンパク質濃度を定量します。前回と同様に再度遠心分離を行い、セクション3に進みます。
  7. 脳からのミトコンドリアの分離
    1. 手動駆動のガラス乳棒を備えたDounceタイプのガラスホモジナイザーを使用して、脳の断片を10〜15回のストロークで均質化します。均質化された組織を滅菌遠心分離チューブに移します。
    2. スイングローターで1,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。
    3. 上清をきれいな遠心分離チューブに集めます。
    4. 前の遠心分離ステップで得られたペレットを、最初の均質化で使用したのと同じ容量のAT培地に再懸濁します。ステップ2.7.1で説明したプロセスを5〜10回のパスで繰り返してペレットを再均質化し、スイングローターで懸濁液を1,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
    5. 上清を取り除き、手順2.7.3で準備したチューブに追加します。固定角ローターで10,000 × g 、4°Cで10分間遠心分離し、粗ミトコンドリア画分を得ます。
    6. 上清を捨て、ペレットを培地ATの初期均質化量(ステップ2.7.1)の1/2に再懸濁します。ミトコンドリア懸濁液を清潔な1.5 mLポリプロピレンチューブに分配し、16,000 × g のマイクロフュージで4°Cで2分間遠心分離します。
    7. 上清を捨て、ミトコンドリアが豊富な各ペレットを0.5 mLの緩衝液ATで再懸濁し、2本のチューブの内容物を1つに結合し、ステップ2.7.6で説明したのと同じ条件で遠心分離します。すべての材料が1本のチューブだけに収まるまで、同じプロセスを繰り返します。
    8. 上清を廃棄し、最終ペレットを300 μLのバッファーA(BSAなし)で再懸濁し、Bradfordアッセイを使用してミトコンドリアタンパク質濃度を定量します。前回と同様に再度遠心分離を行い、セクション3に進みます。
  8. BATからのミトコンドリアの単離
    1. Elvehjem-Potterで8〜10回の上下ストロークで均質化し、モーター駆動のテフロン乳棒を600rpmで使用します。均質化された組織を滅菌遠心分離チューブに移します。
    2. スイングローターで1,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。
    3. 1.5 mLのポリプロピレンチューブに、前のステップで得られた上清を充填し、上部の脂肪層を避けます。.
      注:ステップ2.8.2で得られたペレットの第2の均質化は、ミトコンドリア収率を増加させるために実施することができる。新しい上清(再び1,000 × g で4°C、5分間遠心分離した後)は、ステップ2.8.4に進む前に前の上清と組み合わせることができます。
    4. 4°Cのマイクロフュージで16,000 × g で2分間2分間遠心分離します。
    5. 上清を捨て、ミトコンドリアが豊富な各ペレットを0.5 mLのバッファーAT2で再懸濁し、2つのチューブの内容物を1つにまとめ、ステップ2.8.4で説明したのと同じ条件で遠心分離します。すべての材料が1本のチューブだけに収まるまで、同じプロセスを繰り返します。
    6. 上清を廃棄し、最終ペレットを300 μLのバッファーA(BSAなし)で再懸濁し、Bradfordアッセイを使用してミトコンドリアタンパク質濃度を定量します。前回と同様に再度遠心分離を行い、セクション3に進みます。

3. Blue Native分析用サンプルの調製

  1. ミトコンドリア画分(哺乳類細胞培養物または組織から得られたもの)をBNサンプルバッファー(50 mM NaCl、50 mMイミダゾール、5 mMアミノカプロン酸、4 mM PMSF)に再懸濁して、約10 mg/mLのタンパク質濃度を得ます。さまざまなタイプのサンプルの期待収量については、 表2 を参照してください。
  2. ジギトニン(10%ストック溶液)を添加してミトコンドリア膜を可溶化し、ジギトニン4g/ミトコンドリアタンパク質1g(ステップ3.1で調製したミトコンドリア懸濁液10μLに対してジギトニン10%ストック4μL)の比率を得ます。
    注:界面活性剤とタンパク質の比率(g / g)は、再現性のある結果を得るために、サンプルの種類ごとに最適化する必要があります。2-8gのジギトニン/gのミトコンドリアタンパク質が、ほとんどの組織に最適であることがわかりました34,35。
  3. ピペッティングで優しく上下させて混ぜます。サンプルを氷上で5分間インキュベートします。
    注:このステップの後、ミトコンドリア懸濁液はより明確になるはずです(不透明から半透明にシフトします)。そうでなければ、洗剤の量が正しい膜可溶化に不十分であることを示している可能性があります。
  4. マイクロフュージ(約20,000 × g )で4°Cで25分間全速力で遠心分離し、不溶性物質を除去します。
  5. 上清を新しいチューブに集めます。上清に、初期再懸濁量の1/3に相当する5%G-250(Coomassie Blue G-250 5% in 0.75 Mアミノカプロン酸)を加えます(ステップ3.1、これはタンパク質の最終比率1.6 gのCoomassie/gに相当)し、ピペッティングで混合します。
  6. ゲルにロードする前に氷上に保管するか、アリコートを-80°Cで凍結してください。

4. Blue Nativeゲル電気泳動

注:電気泳動は冷蔵室(4-8°C)で行われます。冷蔵室設備がない場合は、電気泳動タンクに冷却ブロックを導入できます。市販の3〜13%天然ポリアクリルアミドゲル29が使用されるが、所望の勾配濃度の自家製ゲルも使用することができる38,39。

  1. 上部と下部のチャンバーにそれぞれ冷陰極Aと陽極バッファーをロードします。あるいは、サンプルをウェルにロードしてから、上部チャンバーにカソードバッファーAを慎重に充填します。
    注:当研究室では市販の電気泳動バッファーを使用していますが、 表1に示すように調製することができます。
  2. 30〜100μgのミトコンドリアタンパク質をロードします。
    注:通常、10レーンゲル(0.5 x 0.15 cmウェル)にウェルあたり30〜50 μgのタンパク質(WB用)または40〜100 μgのタンパク質(IGA用)をロードします。カソードAバッファーにはクマシーブルーG-250が含まれており、濃い青色をしているため、サンプルローディング時にゲルウェルが見えにくくなっています。例えば、このステップ中にピペットチップを配置するのを助けるために、赤いマーカーで各ウェルの中心をマークすると便利です。ネイティブ分子量マーカーは、BN-PAGE法を設定する際に、グラジエントゲルが適切に形成されていること、および複合体とSCパターンが正しいものであることを確認するのに役立ちます。
  3. 80-100Vで25-30分間運転し、次に160-180Vで、電流を12mA/ゲルに制限し、染料がゲルの底に達するまで(合計で~125-165分)運転します。
  4. ゲル内活性アッセイ(IGA)を実施する場合は、色素前面がゲルの中央にあるとき(ラン開始後~1時間後)に、カソードバッファーAをカソードバッファーBに置換します。
    注:G-250色素への結合により、一部のバンド(主に複合体V、MWが~600 kDaの「内部」メーカーと見なすことができる)が見えるため、ラン直後にゲルを染色せずに文書化できますが、通常、SCおよび個々の複合体は染色またはIGAアッセイなしでは見えません。IGAアッセイまたはWBに使用するゲルは、染色または固定しないでください。
  5. カセットからゲルを分解し、Coomassie blue染色(セクション5)、IGA分析(セクション6)、またはWB免疫検出(セクション7)を続けます。

5. ゲル染色

  1. Coomassie青色色素溶液(Coomassie色素R-250を40%メタノール、10%酢酸に0.25%で、10〜15分間染色)を使用して、室温(RT)でゲルを10〜15分間染色します。
  2. RTで40%メタノールと10%酢酸で数回の洗浄(通常は4〜5 x 15分)で脱染します。
  3. ゲルを文書化します。

6. ゲル活性(IGA)アッセイ

  1. 電気泳動が終了する前に、さまざまな呼吸複合体の分析用のIGA溶液を調製し、それらを暗闇で維持します(たとえば、暗い色のプラスチックボックスを使用するか、アルミホイルで覆うなど)。各バッファーの構成を 表1に詳述します。
  2. 使用するゲルまたはレーンをできるだけ小さいプラスチックの箱に入れて、それを収容します。
  3. ゲルを覆うのに十分な量の適切な溶液(通常、5または10のゲルレーンでそれぞれ5または10 mL)を加え、軽く振とう(60-80 rpm)しながらRTでインキュベートし、光を避けてインキュベートします。
    注:インキュベーションの時間は、分析する複合体と、ロードされるサンプルの性質と量によって異なります。CI と CIV は、最も簡単で迅速に結果を出すことができます。したがって、CI活性は通常数分後に見え始めますが、CIIとCIVは観察に~30分、CVは~1.5-2時間かかります。反応はすべての場合において数時間継続することができ、インキュベーションを冷蔵室(4-6°C)に移すことで、例えば一晩(ON)インキュベーションすることでシグナルの増強速度を減らすことができます。CIII活性は、透明なネイティブ電気泳動(CN)でのみ機能し、BN34では機能しません。
  4. 適切なバンドができたら、アッセイ溶液を取り出し、蒸留水で2回洗浄し、ゲルを40%メタノールと10%酢酸(メタノールのみで固定するCVを除く)で30分間固定して反応を停止します。
    1. IGAによるCI検出後にCIV活性を解析するには、ゲルを蒸留水で2回洗浄し、CI活性を記録し、ゲルを50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.2)と2回30分間インキュベートし(固定せずに)、次に完全なCIV反応緩衝液で複合体IVバンドが現れるまで(通常は室温または4°CでONインキュベート)します。
  5. ゲルを文書化します。
    注:ATPase活性については、開発されたバンドが白色であるため、ゲルを文書化するときは、透明なバンドが見えるように暗い背景に置いてください。

7. ウェスタンブロット解析

  1. 表1に従って転写バッファーを調製し、電気泳動が終了するまで4°Cに保ちます。
  2. ゲルをトレイに置き、転写バッファーを追加します。室温で10〜15分間インキュベートします。
  3. ゲルと同じサイズのPVDFメンブレンを切断し、攪拌下で10秒間メタノール中で活性化します。蒸留水で数回洗浄し、転写バッファーを加えます。室温で10〜15分間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。
  4. 転写サンドイッチを下から上に、ゲルとメンブレンの間の気泡を避けて、次の順序で準備します:カセットの黒い面-スポンジ-吸い取り紙-ゲル-メンブレン-吸い取り紙-スポンジ-カセットの透明な面。
  5. カセットを閉じてロックし、サンドイッチをトランスファータンクに正しい向き(黒面を負極に向けて)に置きます。
  6. トランスファータンクにトランスファーバッファーを充填し、マグネチックスターラーを追加してバッファーを攪拌し、電源を80Vで2時間、または100Vで1時間接続します。4〜8°Cの移送(冷蔵室など)で、移送システムの冷却ブロックを使用して移送します。
  7. メンブレンを回収し、検出するさまざまな呼吸器複合体に対する特異的抗体を使用して、標準的なウェスタンブロットプロトコルを続行します29。

結果

上記のプロトコルに従って得られるミトコンドリアの収量は、細胞株または組織の種類、サンプルの性質(すなわち、新鮮組織または凍結組織を使用する場合)、または均質化プロセスの効率などのいくつかの要因によって異なります。さまざまな細胞株および組織からのミトコンドリアの予想収量を 表2に示します。ミトコンドリア画分が得られたら、次のステップは呼吸器SCパ?...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルで導入された方法論的適応は、ミトコンドリアの複雑な活性を維持しながら損失を回避し、収量を増加させることを目的としています(これは、十分な量のサンプルの利用可能性が損なわれた場合に重要です)そして、組織または細胞株の予想されるSCのパターンを再現することを目的としています( 図2Cを参照)).この目的により、SCを適切に検出...

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) からの助成金番号「PGC2018-095795-B-I00」、およびアラゴン州立行政局 (DGA) (https://www.aragon.es/) からの助成金「Grupo de Referencia: E35_17R」および助成金番号「LMP220_21」から PF-S および RM-L への支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidPanReac131008
Aminocaproic acidFluka Analytical7260
ATPSigma-AldrichA2383
Bis TrisAcrons Organics327721000
Bradford assayBiorad5000002
Coomassie Blue G-250Serva17524
Coomassie Blue R-250Merck1125530025
Cytochrome cSigma-AldrichC2506
Diamino  benzidine (DAB)Sigma-AldrichD5637
DigitoninSigma-AldrichD5628
EDTAPanReac131669
EGTASigma-AldrichE3889
Fatty acids free BSARoche10775835001
GlycinePanReacA1067
Homogenizer Teflon pestleDeltalab196102
ImidazoleSigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
MannitolSigma-AldrichM4125
MethanolLabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
Mini Trans-Blot CellBioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1 Monoclonal AntibodyInvitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein GelsInvitrogenBN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE Running Buffer (20x) InvitrogenBN2001
NDUFA9 Monoclonal AntibodyInvitrogen459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)Sigma-AldrichN6876
Pb(NO3)2Sigma-Aldrich228621
PDVF MembraneAmersham10600023
Phenazine methasulfate (PMS)Sigma-AldrichP9625
Pierce ECL SubstrateThermo Scientific32106
PMSFMerckPMSF-RO
SDHA Monoclonal AntibodyInvitrogen459200
Sodium succinateSigma-AldrichS2378
Streptomycin/penicillinPAN biotechP06-07100
SucroseSigma-AldrichS3089
TrisPanReacA2264
UQCRC1 Monoclonal AntibodyInvitrogen459140
XCell SureLock Mini-CellInvitrogen EI0001

参考文献

  1. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  2. Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  3. Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).
  4. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  5. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  6. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  7. Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes. EMBO Rep. 24 (11), e57092 (2023).
  8. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  9. Milenkovic, D., et al. Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes. Cell Metab. 35 (10), 1799-1813 (2023).
  10. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  11. Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P., Ostojic, S. . Clinical Bioenergetics. , 3-60 (2021).
  12. Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain. Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).
  13. Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role. Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).
  14. Lopez-Fabuel, I., et al. Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).
  15. Mukherjee, S., Ghosh, A. Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases. Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).
  16. Nesci, S., et al. Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology. Life (Basel). 11 (3), 242 (2021).
  17. Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).
  18. Morant-Ferrando, B., et al. Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition. Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).
  19. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients. J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).
  20. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  21. Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935 (2020).
  22. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  23. Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600 (2020).
  24. Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging. Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).
  25. Hollinshead, K. E. R., et al. Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer. Cell Rep. 33 (1), 108231 (2020).
  26. Ikeda, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance. Nat Commun. 10 (1), 4108 (2019).
  27. Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer. Front Cell Dev Biol. 10, 717881 (2022).
  28. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers (Basel). 11 (7), 1027 (2019).
  29. Moreno-Loshuertos, R., et al. How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria. Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).
  30. Vonck, J., Schafer, E. Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).
  31. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  32. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  33. Gonzalez-Franquesa, A., et al. Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity. Cell Rep. 35 (8), 109180 (2021).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).
  35. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  36. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. J Vis Exp. (49), e2452 (2011).
  37. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182 (2019).
  38. Schagger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).
  39. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  40. Chomyn, A., et al. Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers. Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).
  41. Moreno-Loshuertos, R., et al. Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants. Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).
  42. Fernández-Vizarra, E., Fernández-Silva, P., Enríquez, J. A., Celis, J. E. . Cell Biology (Third Edition). , 69-77 (2006).
  43. Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332 (2021).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved