Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica para a análise de supercomplexos respiratórios quando apenas pequenas quantidades de amostras estão disponíveis.

Resumo

Nas últimas décadas, as evidências acumuladas sobre a existência de supercomplexos respiratórios (SCs) mudaram nossa compreensão da organização da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, dando origem à proposta do "modelo de plasticidade". Este modelo postula a coexistência de diferentes proporções de CTs e complexos dependendo do tecido ou do estado metabólico celular. A natureza dinâmica da montagem em SCs permitiria que as células otimizassem o uso dos combustíveis disponíveis e a eficiência da transferência de elétrons, minimizando a geração de espécies reativas de oxigênio e favorecendo a capacidade das células de se adaptarem às mudanças ambientais.

Mais recentemente, anormalidades na montagem de SC foram relatadas em diferentes doenças, como distúrbios neurodegenerativos (doença de Alzheimer e Parkinson), Síndrome de Barth, síndrome de Leigh ou câncer. O papel das alterações da montagem do CS na progressão da doença ainda precisa ser confirmado. No entanto, a disponibilidade de quantidades suficientes de amostras para determinar o status da montagem do SC é muitas vezes um desafio. Isso acontece com biópsias ou amostras de tecido que são pequenas ou precisam ser divididas para múltiplas análises, com culturas de células que têm crescimento lento ou vêm de dispositivos microfluídicos, com algumas culturas primárias ou células raras, ou quando o efeito de determinados tratamentos caros tem que ser analisado (com nanopartículas, compostos muito caros, etc.). Nesses casos, é necessário um método eficiente e fácil de aplicar. Este trabalho apresenta um método adaptado para obter frações mitocondriais enriquecidas a partir de pequenas quantidades de células ou tecidos para analisar a estrutura e função de SCs mitocondriais por eletroforese nativa seguida de ensaios de atividade em gel ou western blot.

Introdução

Supercomplexos (SCs) são associações supramoleculares entre complexos individuais da cadeia respiratória ^1,2. Desde a identificação inicial das CTs e a descrição de sua composição pelo grupo de Schägger ^2,3, posteriormente confirmada por outros grupos, estabeleceu-se que elas contêm complexos respiratórios I, III e IV (IC, CIII e CIV, respectivamente) em diferentes estequiometrias. Duas populações principais de SCs podem ser definidas, aquelas contendo CI (e CIII sozinho ou CIII e CIV) e com peso molecular muito alto (MW, começando ~ 1,5 MDa para o SC ....

Protocolo

NOTA: A composição de todos os meios de cultura e tampões é especificada na Tabela 1 e os detalhes relacionados a todos os materiais e reagentes usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento de mitocôndrias de cultura de células

NOTA: O volume mínimo de células analisadas foi de ~ 30-50 μL de células empacotadas (etapa 1.4). Isso pode corresponder aproximadamente a pelo menos duas ou três placas de cultura de células de 100 mm ou a uma placa de 150 mm a 80-90% de confluência, dependendo do tipo de célula (entre 5 × 10⁶ e 10<....

Discussão

As adaptações metodológicas introduzidas nos protocolos aqui descritos visam evitar perdas e aumentar o rendimento, mantendo as atividades do complexo mitocondrial (o que é crucial quando a disponibilidade de quantidades suficientes de amostras está comprometida) e reproduzir o padrão esperado de SCs do tecido ou da linhagem celular (ver Figura 2C). Com esse objetivo e como não é necessária uma alta pureza mitocondrial para detectar adequadamente os SCs, o número de etapas, tempos .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	PanReac	131008
Aminocaproic acid	Fluka Analytical	7260
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Bis Tris	Acrons Organics	327721000
Bradford assay	Biorad	5000002
Coomassie Blue G-250	Serva	17524
Coomassie Blue R-250	Merck	1125530025
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506
Diamino  benzidine (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
EDTA	PanReac	131669
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fatty acids free BSA	Roche	10775835001
Glycine	PanReac	A1067
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
K2HPO4	PanReac	121512
KH2PO4	PanReac	121509
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Methanol	Labkem	MTOL-P0P
MgSO4	PanReac	131404
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MTCO1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459600
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels	Invitrogen	BN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)	Invitrogen	BN2002
NativePAGE Running Buffer (20x)	Invitrogen	BN2001
NDUFA9 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876
Pb(NO3)2	Sigma-Aldrich	228621
PDVF Membrane	Amersham	10600023
Phenazine methasulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
Pierce ECL Substrate	Thermo Scientific	32106
PMSF	Merck	PMSF-RO
SDHA Monoclonal Antibody	Invitrogen	459200
Sodium succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
Tris	PanReac	A2264
UQCRC1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459140
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001