从小组织和细胞培养样品中分离线粒体用于线粒体超复合物分析

摘要

该方案描述了一种在只有少量样品可用时分析呼吸超复合物的技术。

摘要

在过去的几十年里，关于呼吸超复合物 （SCs） 存在的证据积累改变了我们对线粒体电子传递链组织的理解，从而产生了“可塑性模型”的提出。该模型假设不同比例的 SCs 和复合物共存，具体取决于组织或细胞代谢状态。SCs 中组装的动态性质将使电池能够优化可用燃料的使用和电子转移的效率，最大限度地减少活性氧的产生并有利于电池适应环境变化的能力。

最近，在神经退行性疾病（阿尔茨海默病和帕金森病）、巴斯综合征、Leigh 综合征或癌症等不同疾病中报道了 SC 组装异常。SC 组装改变在疾病进展中的作用仍需确认。然而，获得足够数量的样品来确定 SC 组装状态通常是一个挑战。这种情况发生在活检或组织样本较小或必须分开进行多次分析、细胞培养物生长缓慢或来自微流控设备、一些原代培养物或稀有细胞，或者必须分析特定昂贵处理的效果（使用纳米颗粒、非常昂贵的化合物等）。在这些情况下，需要一种有效且易于应用的方法。本文提出了一种适用于从少量细胞或组织获得富集线粒体组分的方法，以通过天然电泳然后进行凝胶内活性测定或蛋白质印迹来分析线粒体 SCs 的结构和功能。

引言

超复合物 （SC） 是单个呼吸链复合物之间的超分子关联 ^1,2。自 Schägger ^2,3 组最初鉴定 SC 并描述其组成以来，后来被其他组证实，确定它们在不同的化学计量中含有呼吸复合物 I、III 和 IV（分别为 CI、CIII 和 CIV）。可以定义两个主要的 SC 群体，一种含有 CI（单独含有 CIII 或 CIII 和 CIV）且分子量非常高（MW，较小的 SC 从 ~1.5 MDa 开始：CI + CIII₂），另一种含有 CIII 和 CIV 但不含有 CIV，尺寸小得多（例如 CIII₂ + CIV，具有 ~680 kDa）。这些 SC 在线粒体内膜中与游离复合物共存，比例也不同。因此，虽然 CI 主要以相关形式存在（即在 SC 中：~80% 在牛心脏中，在许多人类细胞类型中超过 90%）³，但 CIV 的游离形式非常丰富（在牛心脏中超过 80%），而 CIII 显示出更平衡的分布（~40% 在其更丰富的游离形式中， 作为二聚体，在牛心中）。

虽然它们的存在现在被普遍接受，但它们的确切作用仍在争论^中....

研究方案

注： 表 1 中指定了所有培养基和缓冲液的成分，与本协议中使用的所有材料和试剂相关的详细信息列在 材料表中。

1. 从细胞培养物中分离线粒体

注意：检测的细胞的最小体积为 ~30-50 μL 的浓缩细胞（步骤 1.4）。这大约相当于至少两个或三个 100 mm 细胞培养板或一个汇合度为 80-90% 的 150 mm 板，具体取决于细胞类型（L929 来源细胞或 MDA-MB-468 中的 5 × 10⁶ 和 10⁷ 个细胞之间）。有效的细胞破损是一个关键步骤。

1. 将贴壁细胞培养至约 80% 汇合，或将悬浮细胞培养至足够的密度。
2. 通过以 500 × g 离心 5 分钟收获细胞（在非贴壁细胞的情况下直接从细胞悬液中收获，或者在贴壁细胞的情况下，使用含 0.05% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的胰蛋白酶-EDTA 溶液在 1x PBS 中直接从细胞悬液中收获细胞）。
3. 用冷的 1x PBS 洗涤细胞 2 次，并以 500 × g 离心 5 分钟沉淀。
   注意：从这一点开始，所有步骤都必须在 4 °C 下进行。 因此，所有试剂都必须是冷的，并且含有细胞或线粒体的试管必须保存在冰上。<....

讨论

此处描述的方案中引入的方法学调整旨在避免损失并提高产量，同时保持线粒体复合物活性（当足够量的样品的可用性受到损害时，这一点至关重要）并复制组织或细胞系预期的 SCs 模式（参见 图 2C).为此，由于不需要高线粒体纯度来正确检测 SC，因此只要有可能，步骤、时间和体积的数量就会减少。

因此，在通过低速离心匀浆和去除细胞核和未破碎的.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	PanReac	131008
Aminocaproic acid	Fluka Analytical	7260
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Bis Tris	Acrons Organics	327721000
Bradford assay	Biorad	5000002
Coomassie Blue G-250	Serva	17524
Coomassie Blue R-250	Merck	1125530025
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506
Diamino  benzidine (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
EDTA	PanReac	131669
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fatty acids free BSA	Roche	10775835001
Glycine	PanReac	A1067
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
K2HPO4	PanReac	121512
KH2PO4	PanReac	121509
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Methanol	Labkem	MTOL-P0P
MgSO4	PanReac	131404
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MTCO1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459600
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels	Invitrogen	BN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)	Invitrogen	BN2002
NativePAGE Running Buffer (20x)	Invitrogen	BN2001
NDUFA9 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876
Pb(NO3)2	Sigma-Aldrich	228621
PDVF Membrane	Amersham	10600023
Phenazine methasulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
Pierce ECL Substrate	Thermo Scientific	32106
PMSF	Merck	PMSF-RO
SDHA Monoclonal Antibody	Invitrogen	459200
Sodium succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
Tris	PanReac	A2264
UQCRC1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459140
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001