Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires

Résumé

Ce protocole décrit une technique d’analyse des supercomplexes respiratoires lorsque seules de petites quantités d’échantillons sont disponibles.

Résumé

Au cours des dernières décennies, les preuves accumulées de l’existence de supercomplexes respiratoires (SC) ont changé notre compréhension de l’organisation de la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux, donnant lieu à la proposition du « modèle de plasticité ». Ce modèle postule la coexistence de différentes proportions de SC et de complexes en fonction du tissu ou de l’état métabolique cellulaire. La nature dynamique de l’assemblage dans les SC permettrait aux cellules d’optimiser l’utilisation des combustibles disponibles et l’efficacité du transfert d’électrons, minimisant la génération d’espèces réactives de l’oxygène et favorisant la capacité des cellules à s’adapter aux changements environnementaux.

Plus récemment, des anomalies dans l’assemblage des cellules souches embryonnaires ont été rapportées dans différentes maladies telles que les troubles neurodégénératifs (maladie d’Alzheimer et de Parkinson), le syndrome de Barth, le syndrome de Leigh ou le cancer. Le rôle des altérations de l’assemblage des SC dans la progression de la maladie doit encore être confirmé. Néanmoins, la disponibilité d’un nombre suffisant d’échantillons pour déterminer l’état de l’assemblage du SC est souvent un défi. C’est le cas lors de biopsies ou d’échantillons de tissus qui sont petits ou qui doivent être divisés pour plusieurs analyses, avec des cultures cellulaires à croissance lente ou provenant de dispositifs microfluidiques, avec des cultures primaires ou des cellules rares, ou lorsque l’effet de traitements particuliers coûteux doit être analysé (avec des nanoparticules, des composés très coûteux, etc.). Dans ces cas, une méthode efficace et facile à appliquer est nécessaire. Cet article présente une méthode adaptée pour obtenir des fractions mitochondriales enrichies à partir de petites quantités de cellules ou de tissus afin d’analyser la structure et la fonction des CS mitochondriaux par électrophorèse native suivie de dosages d’activité en gel ou de western blot.

Introduction

Les supercomplexes (SC) sont des associations supramoléculaires^{entre les complexes 1,2} de la chaîne respiratoire individuelle. Depuis l’identification initiale des SC et la description de leur composition par le groupe de Schägger ^2,3, confirmée plus tard par d’autres groupes, il a été établi qu’ils contiennent des complexes respiratoires I, III et IV (CI, CII et CIV, respectivement) dans différentes stœchiométries. Deux populations principales de CS peuvent être définies, celles contenant des CI (et soit CIII seul, soit CIII et CIV) et de très haut po....

Protocole

REMARQUE : La composition de tous les milieux de culture et tampons est précisée au tableau 1 et les détails relatifs à tous les matériaux et réactifs utilisés dans le présent protocole sont énumérés dans le tableau des matériaux.

1. Isolement des mitochondries à partir de cultures cellulaires

REMARQUE : Le volume minimum de cellules analysées a été de ~30-50 μL de cellules emballées (étape 1.4). Cela peut correspondre approximativement à au moins deux ou trois plaques de culture cellulaire de 100 mm ou à une plaque de 150 mm à 80-90% de la confluence, selon le typ....

Discussion

Les adaptations méthodologiques introduites dans les protocoles décrits ici visent à éviter les pertes et à augmenter le rendement tout en maintenant les activités du complexe mitochondrial (ce qui est crucial lorsque la disponibilité de quantités suffisantes d’échantillons est compromise) et à reproduire le modèle de SC attendu du tissu ou de la lignée cellulaire (voir Figure 2C). Dans ce but et comme une grande pureté mitochondriale n’est pas nécessaire pour détecter cor.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	PanReac	131008
Aminocaproic acid	Fluka Analytical	7260
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Bis Tris	Acrons Organics	327721000
Bradford assay	Biorad	5000002
Coomassie Blue G-250	Serva	17524
Coomassie Blue R-250	Merck	1125530025
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506
Diamino  benzidine (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
EDTA	PanReac	131669
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fatty acids free BSA	Roche	10775835001
Glycine	PanReac	A1067
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
K2HPO4	PanReac	121512
KH2PO4	PanReac	121509
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Methanol	Labkem	MTOL-P0P
MgSO4	PanReac	131404
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MTCO1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459600
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels	Invitrogen	BN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)	Invitrogen	BN2002
NativePAGE Running Buffer (20x)	Invitrogen	BN2001
NDUFA9 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876
Pb(NO3)2	Sigma-Aldrich	228621
PDVF Membrane	Amersham	10600023
Phenazine methasulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
Pierce ECL Substrate	Thermo Scientific	32106
PMSF	Merck	PMSF-RO
SDHA Monoclonal Antibody	Invitrogen	459200
Sodium succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
Tris	PanReac	A2264
UQCRC1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459140
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001