Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, sadece küçük miktarlarda numune mevcut olduğunda solunum süper komplekslerinin analizi için bir tekniği tanımlar.

Özet

Son on yıllarda, solunum süper komplekslerinin (SC'ler) varlığı hakkında toplanan kanıtlar, mitokondriyal elektron taşıma zinciri organizasyonu hakkındaki anlayışımızı değiştirdi ve "plastisite modeli" önerisine yol açtı. Bu model, dokuya veya hücresel metabolik duruma bağlı olarak farklı oranlarda SK'lerin ve komplekslerin bir arada bulunduğunu varsayar. SC'lerdeki düzeneğin dinamik doğası, hücrelerin mevcut yakıtların kullanımını ve elektron transferinin verimliliğini optimize etmesine, reaktif oksijen türlerinin oluşumunu en aza indirmesine ve hücrelerin çevresel değişikliklere uyum sağlama yeteneğini desteklemesine izin verecektir.

Daha yakın zamanlarda, nörodejeneratif bozukluklar (Alzheimer ve Parkinson hastalığı), Barth Sendromu, Leigh sendromu veya kanser gibi farklı hastalıklarda SC montajında anormallikler bildirilmiştir. SK montaj değişikliklerinin hastalığın ilerlemesindeki rolünün hala doğrulanması gerekmektedir. Bununla birlikte, SC montaj durumunu belirlemek için yeterli miktarda numunenin mevcudiyeti genellikle bir zorluktur. Bu, küçük veya çoklu analizler için bölünmesi gereken biyopsi veya doku örneklerinde, yavaş büyüyen veya mikroakışkan cihazlardan gelen hücre kültürlerinde, bazı birincil kültürlerde veya nadir hücrelerde veya belirli maliyetli tedavilerin etkisinin analiz edilmesi gerektiğinde (nanopartiküller, çok pahalı bileşikler vb.) olur. Bu durumlarda verimli ve uygulaması kolay bir yöntem gerekir. Bu makale, mitokondriyal SC'lerin yapısını ve işlevini doğal elektroforez ve ardından jel içi aktivite deneyleri veya western blot ile analiz etmek için küçük miktarlarda hücre veya dokudan zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonlar elde etmek için uyarlanmış bir yöntem sunmaktadır.

Giriş

Süper kompleksler (SK'ler), bireysel solunum zinciri kompleksleriarasındaki supramoleküler ilişkilerdir 1,2. SC'lerin ilk tanımlanması ve bileşimlerinin Schägger 2,3 grubu tarafından tanımlanmasından bu yana, daha sonra diğer gruplar tarafından onaylandığından, farklı stokiyometrilerde solunum kompleksleri I, III ve IV (SIRASIYLA CI, CIII ve CIV) içerdikleri tespit edilmiştir. İki ana SK popülasyonu tanımlanabilir, CI içerenler (ve tek başına CIII veya CIII ve CIV) ve çok yüksek moleküler ağırlığa sahip olanlar (MW, daha küçük SC için ~ 1.5 MDa'dan başlar: CI + CIII2) ve CIII ve CIV içerenler ancak CI içermeyenler, çok daha küçük boyutlu olanlar (~ 680 kDa'lı CIII2 + CIV gibi). Bu SC'ler, iç mitokondriyal zarda da farklı oranlarda serbest komplekslerle bir arada bulunur. Bu nedenle, CI çoğunlukla ilişkili formlarında bulunurken (yani, SC'lerde: sığır kalbinde ~% 80 ve birçok insan hücre tipinde% 90'dan fazla)3, CIV serbest formunda çok bol miktarda bulunur (sığır kalbinde% 80'den fazla), CIII daha dengeli bir dağılım gösterir (daha bol serbest formunda ~% 40, bir dimer olarak, sığır kalbinde).

Varlıkları artık genel olarak kabul edilse de, kesin rolleri hala tartışılmaktadır 4,5,6,7,8,9,10. Plastisite modeline göre, hücre tipine veya metabolik duruma bağlı olarak farklı oranlarda SK'ler ve bireysel kompleksler mevcut olabilir 1,7,11. Düzeneğin bu dinamik doğası, hücrelerin çevresel değişikliklere yanıt olarak mevcut yakıtların kullanımını ve oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) sisteminin verimliliğini düzenlemesine izin verecektir 4,5,7. SK'ler ayrıca reaktif oksijen türlerinin üretim hızının kontrolüne katkıda bulunabilir ve bireysel komplekslerin stabilizasyonuna ve cirosuna katılabilir 4,12,13,14. SC montaj durumundaki modifikasyonlar, farklı fizyolojik ve patolojik durumlarla15,16 ve yaşlanma süreci17 ile ilişkili olarak tanımlanmıştır.

Bu nedenle, SC modellerindeki değişiklikler, büyüme2 için kullanılan karbon kaynağına bağlı olarak mayada ve glikoz galaktoz4 ile ikame edildiğinde kültürlenmiş memeli hücrelerinde tanımlanmıştır. Oruç tuttuktan sonra fare karaciğerinde8 ve mitokondriyal yağ asidi oksidasyonubloke edildiğinde astrositlerde de değişiklikler bildirilmiştir 18. Ek olarak, Barth sendromu19, kalp yetmezliği20, çeşitli metabolik21 ve nörolojik 22,23,24 bozukluklarda ve farklı tümörlerde SK'lerde ve OXPHOS'ta bir azalma veya değişiklikler bulunmuştur 25,26,27,28. SK montajındaki ve seviyelerindeki bu değişikliklerin bu patolojik durumlarda birincil neden olup olmadığı veya ikincil etkileri temsil edip etmediği hala araştırılmaktadır15,16. Farklı metodolojiler, SC'lerin montajı ve işlevi hakkında bilgi verebilir; Bunlar arasında aktivite ölçümleri 8,29, ultrastrüktürel analiz30,31 ve proteomik32,33 yer alır. Giderek daha fazla kullanılan ve daha önce bahsedilen metodolojilerin bazıları için başlangıç noktası olan yararlı bir alternatif, Schägger'in grubu34,35 tarafından bu amaç için geliştirilen Blue native (BN) elektroforezi ile SC montaj durumunun doğrudan belirlenmesidir.

Bu yaklaşım, mitokondriyal zarları elde etmek ve çözündürmek için tekrarlanabilir ve verimli prosedürler gerektirir ve jel içi aktivite analizi (IGA), ikinci boyut elektroforezi ve western blot (WB) gibi diğer tekniklerle tamamlanabilir. BN elektroforezi ile SK dinamiği üzerine yapılan çalışmalarda bir sınırlama, başlangıç hücrelerinin veya doku örneklerinin miktarı olabilir. SC montajı ve fonksiyonunun analizi için, Schägger'in grup yöntemlerinden uyarlanan, 20 mg kadar küçük bir dokudan başlayarak taze veya donmuş hücre veya doku örneklerine uygulanabilen bir dizi protokol sunuyoruz.

Protokol

NOT: Tüm kültür ortamlarının ve tamponlarının bileşimi Tablo 1'de belirtilmiştir ve bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücre kültüründen mitokondri izolasyonu

NOT: Test edilen minimum hücre hacmi ~ 30-50 μL paketlenmiş hücre olmuştur (adım 1.4). Bu, hücre tipine bağlı olarak yaklaşık olarak en az iki veya üç adet 100 mm'lik hücre kültürü plakasına veya birleşmenin %80-90'ında bir 150 mm'lik plakaya karşılık gelebilir (L929'dan türetilmiş hücrelerde 5 ×ila 106 ila 107 hücre arasında veya MDA-MB-468). Verimli hücre kırılması kritik bir adımdır.

  1. Yapışık hücreleri yaklaşık% 80 birleşim noktasına veya asılı hücreleri yeterli bir yoğunluğa kadar büyütün.
  2. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleme ile hasat edin (yapışmayan hücreler durumunda doğrudan hücre süspansiyonundan veya yapışık hücreler durumunda 1x PBS'de% 0.05 tripsin ve% 0.02 EDTA'lık bir tripsin-EDTA çözeltisi ile standart tripsinizasyondan sonra).
  3. Hücreleri 2x soğuk 1x PBS ile yıkayın ve 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyerek çökeltin.
    NOT: Bu noktadan itibaren tüm adımlar 4 °C'de gerçekleştirilmelidir. Bu nedenle, tüm reaktifler soğuk olmalı ve hücre veya mitokondri içeren tüpler buz üzerinde tutulmalıdır.
  4. İkinci santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın, hücre pelet hacmini (cpv) tahmin edin ve adım 1.8'de zar kırılmasını kolaylaştırmak için hücreleri en az 15 dakika boyunca -80 ° C'de dondurun.
    NOT: Protokol bu noktada durdurulabilir ve hücreler haftalarca -80 °C'de saklanabilir. Genellikle, konik tabanlı 10 veya 15 mL dereceli tüpler uygundur.
  5. Hücrelerin buz üzerinde yavaşça çözülmesine izin verin.
  6. Paketlenmiş hücre peletini cpv'nin 7 katına eşit bir hipotonik tampon hacminde (10 mM MOPS, 83 mM sükroz, pH 7.2) yeniden süspanse edin (ör., 700 μL tamponda 100 μL paketlenmiş hücre).
    NOT: Etkili patlamalar elde etmek için ses seviyesi yeterli olmalıdır (adım 1.8'deki NOT'a bakın).
  7. Hücre süspansiyonunu uygun boyutta bir Potter-Dounce homojenizatöre aktarın ve hücreleri 2 dakika buzda inkübe ederek şişmesine izin verin. Örneğin, 700-800 μL'lik bir hücre süspansiyonu hacmi için 1 mL kapasiteli bir homojenizatör yeterlidir.
  8. 600 rpm'de dönen motor tahrikli bir Teflon havaneli ile birleştirilmiş homojenizatörde sekiz ila on vuruş yaparak hücre zarlarını kırın.
    NOT: Vuruşları yaparken, zarları şişirmek ve kırılganlaştırmak için sırasıyla hipotonik ve donma etkileriyle birlikte hücre kırılma verimliliğini artıracak bir vakum oluşturmak önemlidir. İyi yapılırsa, homojenizatörü her vuruşta hızlı bir hareketle aşağı çekerken bir "pop" sesi duyulacaktır.
  9. İzotonik bir ortam oluşturmak için hücre süspansiyonuna (cpv'nin 7 katı) (30 mM MOPS, 250 mM sükroz, pH 7.2) aynı hacimde hipertonik tampon ekleyin.
  10. Homojenatı 10-15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 1.000 × g'da sabit bir rotorda 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Kırılmamış hücreleri içeren orijinal tüp bu amaç için kullanılabilir.
  11. Mitokondriyal fraksiyonu içeren süpernatanı 1.5 mL polipropilen tüplere aktarın.
  12. İSTEĞE BAĞLI: Mitokondri verimini artırmak için, peleti 1.10. adımdan itibaren tampon A'nın hücre pelet hacminin 7 katında (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M sükroz, pH 7.4) yukarı ve aşağı pipetleyerek ve 1.000 × g'da 5 ° C'de 4 dakika santrifüjleyerek yeniden süspanse edin. Adım 1.13'e geçmeden önce yeni süpernatanı bir öncekiyle birleştirin.
  13. Mitokondriyal ham fraksiyonu toplamak için 16.000 × g'da 4 ° C'de 2 dakika boyunca bir mikrofüje santrifüjleyin.
  14. Süpernatanı atın ve her mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti 0.5 mL tampon A ile yeniden süspanse edin, iki tüpün içeriğini bir tüpte birleştirin ve adım 1.13'te açıklandığı gibi aynı koşullar altında santrifüjleyin. Tüm malzeme sadece bir tüpte olana kadar aynı işlemi tekrarlayın.
  15. Süpernatanı atın, son peleti 300 μL tampon A ile yeniden süspanse edin ve Bradford testini kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün. Daha önce olduğu gibi tekrar santrifüjleyin ve bölüm 3'e geçin.

2. Mitokondrinin az miktarda hayvan dokusundan izolasyonu

NOT: Bu protokolü belirli bir güvenle uygulamak için minimum doku miktarı, hücre tipine ve mitokondriyal bolluğuna bağlıdır, ancak çoğu durumda ~ 20-30 mg doku olabilir. Doku örnekleri taze materyal veya donmuş örnekler olabilir. İkinci durumda, işleme başlamadan önce numunelerin buz üzerine yerleştirilmiş homojenizasyon tamponunda çözülmesine izin verin.

  1. Doku miktarını (mg) mümkün olduğunca yakın bir şekilde tartın veya tahmin edin.
  2. Dokuyu bir makasla kesin ve küçük parçaların kaybolmamasına dikkat ederek bir süzgeç yardımıyla homojenizasyon tamponunda 3-4 yıkama yapın.
    NOT: Bu adım, iskelet kası veya kalp gibi dokularda, hücreleri homojenizasyon adımıyla doğrudan kolayca ayrıştırılabilen beyin veya daha yumuşak dokulardan daha önemlidir.
  3. Taze homojenizasyon ortamı ekleyin (gram karaciğer başına 4 mL, gram kalp, kahverengi yağ dokusu (BAT) veya kas başına 10 mL ve gram beyin veya böbrek başına 5 mL; Tablo 1'deki her vaka için spesifik tampon bileşimine bakınız).
  4. Tamponlu doku parçalarını homojenizatöre aktarın ve seçilen dokuya bağlı olarak optimum homojenizasyon ve mitokondri izolasyon protokolünü izleyin.
  5. Mitokondrinin karaciğer, dalak ve böbrekten izolasyonu
    1. Elvehjem-Potter'da 600 rpm'de motor tahrikli Teflon tokmak ile dört ila altı yukarı ve aşağı vuruşla homojenize edin.
    2. Homojenize edilmiş dokuyu steril bir santrifüj tüpüne aktarın. 1.000 × g'da sallanan bir rotorda 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    3. 1,5 mL polipropilen tüpleri önceki adımda elde edilen süpernatan ile doldurun. 4 ° C'de bir mikrofüje 16.000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin ve daha sonra daha önce açıklandığı gibi devam edin (adım 1.13 ila 1.15)
  6. Kalp ve kas örneklerinden mitokondri izolasyonu
    1. Elvehjem-Potter'da 600 rpm'de motor tahrikli Teflon havaneli ile altı ila sekiz vuruşla homojenize edin. Homojenize edilmiş dokuyu steril bir santrifüj tüpüne aktarın.
    2. 1.000 × g'da sallanan bir rotorda 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı temiz 1,5 mL polipropilen tüplere dökün.
      NOT: Adım 2.6.2'de elde edilen peletin ikinci bir homojenizasyonu, mitokondriyal verimi artırmak için 4-5 ek vuruş ve 1/2 hacim homojenizasyon tamponu ile gerçekleştirilebilir. Yeni süpernatan (4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 × g'da tekrar santrifüjlemeden sonra), adım 2.6.3'e geçmeden önce bir öncekiyle birleştirilebilir. Ham mitokondri verimini arttırmanın bir alternatifi, homojenizasyondan önce kalp ve kas dokusu örneklerinin tripsin çözeltisi içinde ayrıştırılmasıdır36,37. Bu durumda, mitokondriyal zarlar digitonin ile çözündürülmeden önce tripsinin verimli bir şekilde inaktive edilmesi/uzaklaştırılması gerekir (adım 3.2).
    3. Ham mitokondriyal fraksiyonu elde etmek için 16.000 × g'da bir mikrofüje 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin.
    4. Süpernatanı atın ve her mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti 0.5 mL tampon AT ile yeniden süspanse edin, iki tüpün içeriğini bir tüpte birleştirin ve adım 2.6.3'te açıklandığı gibi aynı koşullar altında santrifüjleyin. Tüm malzeme sadece bir tüpte olana kadar aynı işlemi tekrarlayın.
    5. Süpernatanı atın, son peleti 300 μL tampon A (BSA yok) ile yeniden süspanse edin ve Bradford testini kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün. Daha önce olduğu gibi tekrar santrifüjleyin ve bölüm 3'e geçin.
  7. Mitokondrinin beyinden izolasyonu
    1. Beynin parçalarını 10-15 vuruşla homojenize edin, manuel olarak sürülen bir cam tokmağı ile Doutence tipi bir cam homojenizatör kullanarak. Homojenize edilmiş dokuyu steril bir santrifüj tüpüne aktarın.
    2. 1.000 × g'da sallanan bir rotorda 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    3. Süpernatanı temiz bir santrifüj tüpüne toplayın.
    4. Önceki santrifüjleme adımında elde edilen peleti, ilk homojenizasyonda kullanılan aynı hacimde AT ortamında yeniden süspanse edin. Adım 2.7.1'de açıklanan işlemi 5-10 geçiş kullanarak tekrarlayarak peleti yeniden homojenize edin ve süspansiyonu 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.000 × g'da sallanan bir rotorda santrifüjleyin.
    5. Süpernatanı çıkarın ve adım 2.7.3'te hazırlanan tüpe ekleyin. Ham mitokondriyal fraksiyonu elde etmek için sabit açılı bir rotorda 10.000 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı atın ve peleti, ortamın AT ortamının ilk homojenizasyon hacminin (adım 2.7.1) 1/2'sine kadar yeniden süspanse edin. Mitokondriyal süspansiyonu temiz 1,5 mL polipropilen tüplere dağıtın ve 16.000 × g'da bir mikrofüjde 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin.
    7. Süpernatanı atın ve her mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti 0.5 mL tampon AT ile yeniden süspanse edin, iki tüpün içeriğini bir tüpte birleştirin ve adım 2.7.6'da açıklandığı gibi aynı koşullar altında santrifüjleyin. Tüm malzeme sadece bir tüpte olana kadar aynı işlemi tekrarlayın.
    8. Süpernatanı atın, son peleti 300 μL tampon A (BSA yok) ile yeniden süspanse edin ve Bradford testini kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün. Daha önce olduğu gibi tekrar santrifüjleyin ve bölüm 3'e geçin.
  8. Mitokondrinin BAT'tan izolasyonu
    1. Elvehjem-Potter'da 600 rpm'de motor tahrikli bir Teflon tokmak ile sekiz ila on yukarı ve aşağı vuruşla homojenize edin. Homojenize edilmiş dokuyu steril bir santrifüj tüpüne aktarın.
    2. 1.000 × g'da sallanan bir rotorda 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    3. 1.5 mL polipropilen tüpleri, üst yağ tabakasından kaçınarak önceki adımda elde edilen süpernatan ile doldurun.
      NOT: Mitokondriyal verimi artırmak için adım 2.8.2'de elde edilen peletin ikinci bir homojenizasyonu gerçekleştirilebilir. Yeni süpernatan (4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 × g'da tekrar santrifüjlemeden sonra), adım 2.8.4'e geçmeden önce bir öncekiyle birleştirilebilir.
    4. 16.000 × g'da 2 dakika, 4 °C'de bir mikrofüje 2 dakika santrifüjleyin.
    5. Süpernatanı atın ve her mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti 0.5 mL tampon AT2 ile yeniden süspanse edin, iki tüpün içeriğini bir tüpte birleştirin ve adım 2.8.4'te açıklandığı gibi aynı koşullar altında santrifüjleyin. Tüm malzeme sadece bir tüpte olana kadar aynı işlemi tekrarlayın.
    6. Süpernatanı atın, son peleti 300 μL tampon A (BSA yok) ile yeniden süspanse edin ve Bradford testini kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün. Daha önce olduğu gibi tekrar santrifüjleyin ve bölüm 3'e geçin.

3. Blue Native analizi için numunelerin hazırlanması

  1. Yaklaşık 10 mg / mL'lik bir protein konsantrasyonu elde etmek için mitokondriyal fraksiyonları (memeli hücre kültürlerinden veya dokularından elde edilen) BN numune tamponunda (50 mM NaCl, 50 mM İmidazol, 5 mM Aminokaproik asit, 4 mM PMSF) yeniden süspanse edin. Farklı numune türleri için beklenen verimler için Tablo 2'ye bakın.
  2. 4 g digitonin/g mitokondriyal protein (adım 3.1'de hazırlanan 10 μL mitokondriyal süspansiyon için 4 μL digitonin% 10 stok) oranı elde etmek için digitonin (% 10 stok çözeltisi) ekleyerek mitokondriyal membranları çözündürün.
    NOT: Deterjan-protein oranı (g/g), tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için her numune türü için optimize edilmelidir; 2-8 g digitonin/g mitokondriyal proteinin çoğu doku için optimal olduğu bulunmuştur34,35.
  3. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Numuneleri buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu adımdan sonra, mitokondriyal süspansiyon daha net hale gelmelidir (opaktan yarı saydama geçiş); Aksi takdirde, deterjan miktarının doğru membran çözündürmesi için yetersiz olduğunu gösterebilir.
  4. Çözünmeyen materyali çıkarmak için bir mikrofüjde (yaklaşık 20.000 × g ) 4 ° C'de 25 dakika boyunca tam hızda santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı yeni bir tüpte toplayın. Süpernatanınta, ilk yeniden süspansiyon hacminin 1 / 3'üne eşdeğer bir hacim% 5 G-250 (Coomassie Blue G-250 0.75 M aminokaproik asit içinde% 5) ekleyin (adım 3.1, bu, 1.6 g Coomassie / g proteinin nihai oranına karşılık gelir) ve pipetleme ile karıştırın.
  6. Jeli yüklemeden önce buz üzerinde tutun veya alikotları -80 ° C'de dondurun.

4. Mavi Yerli jel elektroforezi

NOT: Elektroforez soğuk odada (4-8 °C) gerçekleştirilir. Soğuk oda tesisi yoksa, elektroforez tankına bir soğutma bloğu yerleştirilebilir. Ticari %3-13 doğal poliakrilamid jeller29 kullanılır, ancak istenen gradyan konsantrasyonlarında ev yapımı jeller de kullanılabilir38,39.

  1. Üst ve alt bölmeleri sırasıyla soğuk katot A ve anot tamponları ile yükleyin. Alternatif olarak, üst hazneyi katot tamponu A ile dikkatlice doldurmadan önce numuneleri kuyucuklara yükleyin.
    NOT: Laboratuvarımızda ticari elektroforez tamponları kullanılmaktadır, ancak bunlar Tablo 1'de belirtildiği gibi hazırlanabilir.
  2. 30 ila 100 μg arasında mitokondriyal protein yükleyin.
    NOT: Genellikle, 30-50 μg protein (WB için) veya 40-100 μg protein (IGA için) 10 şeritli bir jelde (0.5 x 0.15 cm oyuklar) kuyucuk başına yüklenir. Katot A tamponu, Coomassie Blue G-250 içerir ve numune yükleme için jel kuyucuklarının görülmesini zorlaştıran yoğun bir mavi renge sahiptir. Bu adım sırasında pipet ucunun yerleştirilmesine yardımcı olmak için, örneğin her bir kuyucuğun merkezini kırmızı bir işaretleyici ile işaretlemek uygundur. Doğal moleküler ağırlık belirteçleri, gradyan jellerin düzgün bir şekilde oluşturulduğunu ve komplekslerin ve SC modelinin doğru olduğunu doğrulamak için BN-PAGE tekniğini kurarken yararlı olabilir.
  3. 80-100 V'ta 25-30 dakika ve ardından 160-180 V'ta çalıştırın, akımı 12 mA/jel ile sınırlayın, boya jelin dibine ulaşana kadar (toplamda ~ 125-165 dakika).
  4. Jel içi aktivite testleri (IGA'lar) yapılacaksa, boya cephesi jelin ortasındayken (çalışmanın başlamasından ~ 1 saat sonra) katot tamponu A'yı katot tamponu B ile değiştirin.
    NOT: Jeller, G-250 boyasına bağlanmaları nedeniyle bazı bantlar görünür olduğundan (esas olarak kompleks V, ~ 600 kDa'lık bir MW'ye sahip "dahili" bir yapıcı olarak kabul edilebilir) çalışmadan hemen sonra herhangi bir lekelenme olmadan belgelenebilse de, genellikle, SC'ler ve bireysel kompleksler boyama veya IGA tahlilleri olmadan görünmez. IGA tahlillerinde veya WB için kullanılacak jeller lekelenmemeli veya sabitlenmemelidir.
  5. Jeli kasetten sökün ve Coomassie mavisi boyama (bölüm 5), IGA analizi (bölüm 6) veya WB immünodetection (bölüm 7) ile devam edin.

5. Jel boyama

  1. Jeli oda sıcaklığında (RT) 10-15 dakika boyunca Coomassie mavi boya solüsyonları kullanarak boyayın (Coomassie boyası R-250 % 40 metanol,% 10 asetik asit içinde% 0.25'te; 10-15 dakika lekeleyin).
  2. RT'de %40 metanol ve %10 asetik asit içinde birkaç yıkama (tipik olarak 4-5 x 15 dakika) ile lekeyi çıkarın.
  3. Jeli belgeleyin.

6. Jel aktivitesi (IGA) testlerinde

  1. Elektroforez sona ermeden önce farklı solunum komplekslerinin analizi için IGA çözeltileri hazırlayın ve bunları karanlıkta tutun (örneğin koyu renkli plastik kutular kullanarak veya alüminyum folyo ile kaplayarak). Her bir tamponun bileşimi Tablo 1'de detaylandırılmıştır.
  2. Kullanılacak jeli veya şeritleri, yerleştirmek için mümkün olduğunca küçük plastik bir kutuya yerleştirin.
  3. Jeli kaplayacak kadar uygun çözelti ekleyin (sırasıyla 5 veya 10 jel şeridi için genellikle 5 veya 10 mL) ve RT'de hafifçe çalkalama (60-80 rpm) ve ışıktan uzakta inkübe edin.
    NOT: Kuluçka süresi, analiz edilecek komplekse ve yüklenen numunenin niteliğine ve miktarına bağlıdır; CI ve CIV, sonuç vermesi en kolay ve en hızlı olanlardır. Bu nedenle, CI aktivitesi genellikle birkaç dakika sonra görünür hale gelmeye başlarken, CII ve CIV'nin gözlemlenmesi için ~ 30 dakika ve CV ~ 1.5-2 saat gerekir. Reaksiyon her durumda saatlerce devam edebilir ve inkübasyonu soğuk bir odaya (4-6 °C), örneğin bir gece (AÇIK) inkübasyon için hareket ettirerek sinyal yoğunlaşma hızı azaltılabilir. CIII aktivitesi sadece berrak doğal elektroforez (CN) için çalışır, BN34 için değil.
  4. Uygun bantlar geliştiğinde, tahlil solüsyonlarını çıkararak, 2x'i damıtılmış suyla yıkayarak ve jeli %40 metanol artı %10 asetik asit (sadece metanol ile sabitlenen CV hariç) ile 30 dakika sabitleyerek reaksiyonları durdurun.
    1. IGA ile CI tespitinden sonra CIV aktivitesini analiz etmek için, jeli 2x'i damıtılmış suyla yıkayın, CI aktivitesini belgeleyin, jeli (sabitlemeden!) 50 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.2) 2x ile 30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından kompleks IV bantları görünene kadar (genellikle RT veya 4 °C'de AÇIK inkübe ederek) tam CIV reaksiyon tamponu ile.
  5. Jelleri belgeleyin.
    NOT: ATPaz aktivitesi için, geliştirilen bantlar beyaz olduğundan, jeli belgelerken, şeffaf bantların görünür olması için koyu bir arka plan üzerine yerleştirin.

7. Batı lekesi analizi

  1. Transfer tamponunu Tablo 1'e göre hazırlayın ve elektroforezin sonuna kadar 4 °C'de tutun.
  2. Jeli bir tepsiye yerleştirin ve transfer tamponu ekleyin. RT'de 10-15 dakika inkübe edin.
  3. Jel ile aynı boyutta bir PVDF membran parçası kesin ve çalkalama altında 10 saniye boyunca metanol içinde etkinleştirin. Damıtılmış su ile birkaç kez yıkayın ve transfer tamponu ekleyin. Hafifçe çalkalayarak RT'de 10-15 dakika inkübe edin.
  4. Transfer sandviçini aşağıdan yukarıya doğru, jel ve zar arasındaki kabarcıkları önleyerek aşağıdaki sırayla hazırlayın: kaset-sünger-leke kağıdının siyah tarafı-jel-zar-leke kağıdı- kasetin sünger berrak tarafı.
  5. Kaseti kapatın ve kilitleyin ve sandviçi transfer için doğru yönde (siyah taraf negatif kutba doğru) transfer tankına koyun.
  6. Transfer tankını transfer tamponu ile doldurun, tamponu çalkalamak için manyetik bir karıştırıcı ekleyin ve güç kaynağını 2 saat boyunca 80 V'ta veya 1 saat boyunca 100 V'a bağlayın. Transferi 4 ila 8 °C arasında (örneğin soğuk odada) ve transfer sisteminde bir soğutma bloğu ile gerçekleştirin.
  7. Membranı alın ve tespit edilecek farklı solunum kompleksleri için spesifik antikorlar kullanarak standart bir western blot protokolü ile devam edin29.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokollere göre elde edilen mitokondri verimleri, hücre hattı veya doku tipi, numunelerin doğası (yani taze veya donmuş dokular kullanılıyorsa) veya homojenizasyon işleminin verimliliği gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak değişir. Farklı hücre dizilerinden ve dokulardan beklenen mitokondri verimleri Tablo 2'de toplanmıştır. Mitokondriyal fraksiyonlar elde edildikten sonra, bir sonraki adım, ham mitokondriyal numunenin çözündürülmesi ve BN-PAGE ile elek...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokollerde tanıtılan metodolojik uyarlamalar, mitokondriyal kompleks aktiviteleri korurken (yeterli miktarda numunenin mevcudiyeti tehlikeye girdiğinde çok önemlidir) kayıpları önlemeyi ve verimi artırmayı ve dokunun veya hücre hattının beklenen SC modelini yeniden üretmeyi amaçlamaktadır (bkz. Şekil 2C). Bu amaçla ve SK'leri düzgün bir şekilde tespit etmek için yüksek bir mitokondriyal saflık gerekmediğinden, bu mümkün olduğunda adım, süre...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ministerio de Ciencia e Innovación'dan (https://ciencia.sede.gob.es/) "PGC2018-095795-B-I00" hibe numarası ve Diputación General de Aragón'dan (DGA) (https://www.aragon.es/) PF-S ve RM-L'ye "Grupo de Referencia: E35_17R" hibe numarası ve "LMP220_21" hibe numarası ile desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidPanReac131008
Aminocaproic acidFluka Analytical7260
ATPSigma-AldrichA2383
Bis TrisAcrons Organics327721000
Bradford assayBiorad5000002
Coomassie Blue G-250Serva17524
Coomassie Blue R-250Merck1125530025
Cytochrome cSigma-AldrichC2506
Diamino  benzidine (DAB)Sigma-AldrichD5637
DigitoninSigma-AldrichD5628
EDTAPanReac131669
EGTASigma-AldrichE3889
Fatty acids free BSARoche10775835001
GlycinePanReacA1067
Homogenizer Teflon pestleDeltalab196102
ImidazoleSigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
MannitolSigma-AldrichM4125
MethanolLabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
Mini Trans-Blot CellBioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1 Monoclonal AntibodyInvitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein GelsInvitrogenBN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE Running Buffer (20x) InvitrogenBN2001
NDUFA9 Monoclonal AntibodyInvitrogen459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)Sigma-AldrichN6876
Pb(NO3)2Sigma-Aldrich228621
PDVF MembraneAmersham10600023
Phenazine methasulfate (PMS)Sigma-AldrichP9625
Pierce ECL SubstrateThermo Scientific32106
PMSFMerckPMSF-RO
SDHA Monoclonal AntibodyInvitrogen459200
Sodium succinateSigma-AldrichS2378
Streptomycin/penicillinPAN biotechP06-07100
SucroseSigma-AldrichS3089
TrisPanReacA2264
UQCRC1 Monoclonal AntibodyInvitrogen459140
XCell SureLock Mini-CellInvitrogen EI0001

Referanslar

  1. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  2. Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  3. Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).
  4. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  5. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  6. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  7. Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes. EMBO Rep. 24 (11), e57092 (2023).
  8. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  9. Milenkovic, D., et al. Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes. Cell Metab. 35 (10), 1799-1813 (2023).
  10. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  11. Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P., Ostojic, S. . Clinical Bioenergetics. , 3-60 (2021).
  12. Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain. Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).
  13. Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role. Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).
  14. Lopez-Fabuel, I., et al. Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).
  15. Mukherjee, S., Ghosh, A. Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases. Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).
  16. Nesci, S., et al. Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology. Life (Basel). 11 (3), 242 (2021).
  17. Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).
  18. Morant-Ferrando, B., et al. Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition. Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).
  19. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients. J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).
  20. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  21. Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935 (2020).
  22. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  23. Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600 (2020).
  24. Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging. Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).
  25. Hollinshead, K. E. R., et al. Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer. Cell Rep. 33 (1), 108231 (2020).
  26. Ikeda, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance. Nat Commun. 10 (1), 4108 (2019).
  27. Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer. Front Cell Dev Biol. 10, 717881 (2022).
  28. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers (Basel). 11 (7), 1027 (2019).
  29. Moreno-Loshuertos, R., et al. How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria. Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).
  30. Vonck, J., Schafer, E. Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).
  31. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  32. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  33. Gonzalez-Franquesa, A., et al. Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity. Cell Rep. 35 (8), 109180 (2021).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).
  35. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  36. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. J Vis Exp. (49), e2452 (2011).
  37. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182 (2019).
  38. Schagger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).
  39. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  40. Chomyn, A., et al. Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers. Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).
  41. Moreno-Loshuertos, R., et al. Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants. Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).
  42. Fernández-Vizarra, E., Fernández-Silva, P., Enríquez, J. A., Celis, J. E. . Cell Biology (Third Edition). , 69-77 (2006).
  43. Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Mitokondriyal S perkomplekslerSolunum Zinciri KompleksleriMitokondriyal zolasyonMitokondriyal FraksiyonasyonK k Doku rnekleriH cre K lt r rnekleriDo al ElektroforezJel i Aktivite DeneyleriWestern Blot

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır