Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu

Özet

Bu protokol, sadece küçük miktarlarda numune mevcut olduğunda solunum süper komplekslerinin analizi için bir tekniği tanımlar.

Özet

Son on yıllarda, solunum süper komplekslerinin (SC'ler) varlığı hakkında toplanan kanıtlar, mitokondriyal elektron taşıma zinciri organizasyonu hakkındaki anlayışımızı değiştirdi ve "plastisite modeli" önerisine yol açtı. Bu model, dokuya veya hücresel metabolik duruma bağlı olarak farklı oranlarda SK'lerin ve komplekslerin bir arada bulunduğunu varsayar. SC'lerdeki düzeneğin dinamik doğası, hücrelerin mevcut yakıtların kullanımını ve elektron transferinin verimliliğini optimize etmesine, reaktif oksijen türlerinin oluşumunu en aza indirmesine ve hücrelerin çevresel değişikliklere uyum sağlama yeteneğini desteklemesine izin verecektir.

Daha yakın zamanlarda, nörodejeneratif bozukluklar (Alzheimer ve Parkinson hastalığı), Barth Sendromu, Leigh sendromu veya kanser gibi farklı hastalıklarda SC montajında anormallikler bildirilmiştir. SK montaj değişikliklerinin hastalığın ilerlemesindeki rolünün hala doğrulanması gerekmektedir. Bununla birlikte, SC montaj durumunu belirlemek için yeterli miktarda numunenin mevcudiyeti genellikle bir zorluktur. Bu, küçük veya çoklu analizler için bölünmesi gereken biyopsi veya doku örneklerinde, yavaş büyüyen veya mikroakışkan cihazlardan gelen hücre kültürlerinde, bazı birincil kültürlerde veya nadir hücrelerde veya belirli maliyetli tedavilerin etkisinin analiz edilmesi gerektiğinde (nanopartiküller, çok pahalı bileşikler vb.) olur. Bu durumlarda verimli ve uygulaması kolay bir yöntem gerekir. Bu makale, mitokondriyal SC'lerin yapısını ve işlevini doğal elektroforez ve ardından jel içi aktivite deneyleri veya western blot ile analiz etmek için küçük miktarlarda hücre veya dokudan zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonlar elde etmek için uyarlanmış bir yöntem sunmaktadır.

Giriş

Süper kompleksler (SK'ler), bireysel solunum zinciri kompleksleri^arasındaki supramoleküler ilişkilerdir ^1,2. SC'lerin ilk tanımlanması ve bileşimlerinin Schägger ^2,3 grubu tarafından tanımlanmasından bu yana, daha sonra diğer gruplar tarafından onaylandığından, farklı stokiyometrilerde solunum kompleksleri I, III ve IV (SIRASIYLA CI, CIII ve CIV) içerdikleri tespit edilmiştir. İki ana SK popülasyonu tanımlanabilir, CI içerenler (ve tek başına CIII veya CIII ve CIV) ve çok yüksek moleküler ağırlığa sahip olanlar (MW, daha küçük SC için ~ 1.5 MDa'dan baş....

Protokol

NOT: Tüm kültür ortamlarının ve tamponlarının bileşimi Tablo 1'de belirtilmiştir ve bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücre kültüründen mitokondri izolasyonu

NOT: Test edilen minimum hücre hacmi ~ 30-50 μL paketlenmiş hücre olmuştur (adım 1.4). Bu, hücre tipine bağlı olarak yaklaşık olarak en az iki veya üç adet 100 mm'lik hücre kültürü plakasına veya birleşmenin %80-90'ında bir 150 mm'lik plakaya karşılık gelebilir (L929'dan türetilmiş hücrelerde 5 ×ila 10^{6 ila} 10⁷ ....

Tartışmalar

Burada açıklanan protokollerde tanıtılan metodolojik uyarlamalar, mitokondriyal kompleks aktiviteleri korurken (yeterli miktarda numunenin mevcudiyeti tehlikeye girdiğinde çok önemlidir) kayıpları önlemeyi ve verimi artırmayı ve dokunun veya hücre hattının beklenen SC modelini yeniden üretmeyi amaçlamaktadır (bkz. Şekil 2C). Bu amaçla ve SK'leri düzgün bir şekilde tespit etmek için yüksek bir mitokondriyal saflık gerekmediğinden, bu mümkün olduğunda adım, süre.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	PanReac	131008
Aminocaproic acid	Fluka Analytical	7260
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Bis Tris	Acrons Organics	327721000
Bradford assay	Biorad	5000002
Coomassie Blue G-250	Serva	17524
Coomassie Blue R-250	Merck	1125530025
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506
Diamino  benzidine (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
EDTA	PanReac	131669
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fatty acids free BSA	Roche	10775835001
Glycine	PanReac	A1067
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
K2HPO4	PanReac	121512
KH2PO4	PanReac	121509
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Methanol	Labkem	MTOL-P0P
MgSO4	PanReac	131404
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MTCO1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459600
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels	Invitrogen	BN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)	Invitrogen	BN2002
NativePAGE Running Buffer (20x)	Invitrogen	BN2001
NDUFA9 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876
Pb(NO3)2	Sigma-Aldrich	228621
PDVF Membrane	Amersham	10600023
Phenazine methasulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
Pierce ECL Substrate	Thermo Scientific	32106
PMSF	Merck	PMSF-RO
SDHA Monoclonal Antibody	Invitrogen	459200
Sodium succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
Tris	PanReac	A2264
UQCRC1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459140
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001