JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מתאר שיטת קשירת ניילון 6-0 שונה להשראת דלקת חניכיים בעכברים, הניתנת לשחזור מאוד ומהווה אלטרנטיבה לחוקרים לחקור מחלות חניכיים מהתפתחותה ועד לתוצאותיה הפתולוגיות.

Abstract

מחלת חניכיים (PD) היא הפרעה דלקתית הפוגעת ברקמות התומכות של השיניים והיא אחת המחלות הנפוצות ביותר ברחבי העולם. צורתו החמורה, דלקת חניכיים, מובילה להרס של רקמות רכות, שיניים ועצם. מודלים של בעלי חיים של דלקת חניכיים פותחו באמצעות פרימטים, כלבים, חזירים מיניאטוריים ועכברים. בין אלה, מודל העכברים המושרה על ידי קשירה מציע יתרונות כגון התקדמות מהירה של מחלה, יכולת שחזור, יכולת חיזוי ועלות נמוכה תוך שכפול יעיל של היבטים מרכזיים של דלקת חניכיים אנושית. מודלים של עכברים המשתמשים בקשרים סיפקו תובנות חשובות לגבי המיקרו-סביבות המיקרוביולוגיות והאימונולוגיות של רקמות חניכיים, והדגישו את התפקיד הקריטי של ביופילמים בתגובות החיסוניות ואת הקשר שלהם למחלות מערכתיות. מחקר זה מציג שיטת קשירת ניילון שונה להשראת דלקת חניכיים בעכברים. השינוי כולל שימוש בתפר ניילון במקום תפר משי והנחתו מתחת לאזור המגע הבין-פרוקסימלי במקום להעבירו דרך נקודת המגע. גישה זו מפשטת את הטכניקה תוך גרימת דלקת חניכיים ביעילות. המתודולוגיה המפורטת למיקום תפרים מודגמת בצורה גרפית, והתקדמות דלקת חניכיים מודגמת באמצעות ניתוחים היסטולוגיים והיסטומטריים.

Introduction

מחלת חניכיים (PD) היא הפרעה דלקתית של הרקמות התומכות בשיניים והיא בין המחלות השכיחות ביותר בעולם1; שכיחות מחלת פרקינסון דווחה בטווח שבין 20%-50% ברחבי העולם2. למחלת פרקינסון יש דרגות שונות של התקדמות; צורתו הקלה, הנקראת דלקת חניכיים, משפיעה רק על רקמות רכות, וצורתו החמורה, הנקראת דלקת חניכיים (PT), משפיעה על רקמות קשות כמו עצם3. מכיוון ש-PT היא מחלה דלקתית, יש להתייחס אליה כתגובה חיסונית מורכבת הניתנת לשינוי על ידי מספר גורמי סיכון שיכולים לשנות את תהליך המחלה4, כגון סוכרת5, מחלות לב וכלי דם6, אינטראקציות הורמונליות כגון תוצאות הריון שליליות7 או רעלת הריון8, מחלות דלקתיות9, ואפילו שינויים בעיניים10 או דמנציה11.

לכן, כדי להבין את האטיולוגיה הקשורה להתפתחות או לשכיחות של PT, לבחון אסטרטגיות טיפוליות חדשות או יעילות יותר, או לזהות מתאם כלשהו בין מחלות מערכתיות לבין PT או המיקרוביוטה החניכיים, יש צורך במודלים של בעלי חיים12.

בחירת שיטת מחקר יעילה היא חיונית להבנת התפתחות PT ומענה הולם על שאלות מחקר13. במהלך השנים פותחו מודלים שונים של בעלי חיים לחקר PT; עם זאת, מודלים כמו פרימטים, כלבים, ארנבות וחזירים מיניאטוריים הם יקרים ומורכבים לשימוש 14,15,16. למודלים עכבריים של PT, במיוחד למודל PT המושרה על ידי קשירה, יש יתרונות רבים, כולל פיתוח מהיר, יכולת שחזור, יכולת חיזוי ועלות נמוכה 17,18,19.

למרות שמספר שיטות משמשות לגרימת PT, כגון חיסון חיידקי דרך הפה, הזרקת ליפופוליסכריד והשראת קשירה10,20, לכל אחת מהן יתרונות וחסרונות17, מודל העכברים של PT המושרה על ידי קשירת ניילון דמה למנגנון האנושי להתפתחותו 20,21,22,23. PT מתרחש באמצעות שימור המיקרוביוטה המקומית, גורם לדלקת ומוביל לאובדן רקמות. יתר על כן, עכברים יכולים לעבור שינוי גנטי כדי לחקור אוכלוסיות תאים שונות או מולקולות מעניינות לחקר PT.

ניתן לבצע קשירת שיניים באמצעות חומרים שונים, כגון חוטים אורתודונטיים, תפרי משי24,25 או תפרי ניילון26. החומר הנפוץ ביותר להשראת PT על ידי קשירה בעכברים הוא משי; מתודולוגיה זו הוסברה על ידי מחברים שונים, כגון Marchesan et al.18, Abe et al.27 ו-Chadwick et al.22, כל אחד עם השינויים שלו, וכל השיטות הללו שימשו בהצלחה על ידי מספר חוקרים28. עם זאת, הנחת תפר משי סביב הטוחנות העליונות בעכברים יכולה להיות מורכבת. Marchesan ואחרים הציעו להשתמש ב"מחזיק קשירה"; אייב ואחרים וצ'דוויק ואחרים הניחו את התפר דרך נקודת המגע, אם כי צ'דוויק ועמיתיו הניחו אותו סביב שיניים טוחנות M1 ו-M2.

תפרי ניילון בעוביים שונים שימשו להתפתחות PT במודלים שונים של בעלי חיים 29,30,31. Lima et al.31 השתמשו בתפרי ניילון 5-0; במחקרים קודמים השתמשנו בתפרי ניילון 6-0 עם תוצאות דומות28.

בהשוואה לתפרים מרובי פילמנטים, תפרי ניילון הם סינתטיים מונופילמנטים שאינם ניתנים לספיגה ומציגים תגובת רקמה דלקתית נמוכה יותר32; בנוסף, תפרי ניילון מאפשרים גם הצטברות חיידקים 33,34, ויש עדויות להידבקות של Fusobacterium nucleatum ו-Porphyromona intermedia35,36, יחד עם חיידקים אנאירוביים פקולטטיביים בתפרי ניילון 12,14,17,19,24,27,35,37 (טבלה 1).

מאפיינים אלה עשויים לאפשר לתגובה הדלקתית להתמקד בעיקר בהצטברות חיידקים ולא בהצטברות חומרים. בנוסף, לניילון יש תכונות מכניות טובות יותר, כגון חוזק מתיחה, מאשר משי38.

לכן, במחקר הנוכחי, תפר הניילון 6-0 שהוצב סביב M2 מתחת לאזור המגע הבין-פרוקסימלי גרם להתפתחות של דלקת חניכיים בשלב מתקדם בעכבר. גישה זו מאפשרת מיקום קשירה בפינצטה רגילה, והתוצאות עקביות. לאחר 30 יום ניתן לאשר את התפתחות ה-PT על ידי ניתוח היסטומטרי והיסטולוגי.

Protocol

כל ההליכים המעורבים בחיות ניסוי נערכו תוך עמידה קפדנית ב'מסגרת האתית למחקר ביו-רפואי בחיות מעבדה', בהתאם לתקן המקסיקני הרשמי NOM-062-ZOO-1999. מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של Facultad de Estudios Superiores Iztacala (FES-Iztacala) תחת פרוטוקול CE/FESI/072024/1765. העכברים שוכנו בתאי בעלי חיים עם גישה חופשית למזון ומים בסביבה נטולת פתוגנים במתקן החיות FES-Iztacala. פרוטוקול זה הוא שינוי של השיטה שתוארה קודם לכן על ידי Abe et al.27. נקבות עכברי BALB/c בנות שישה עד שמונה שבועות (במשקל 16 גרם) חולקו לקבוצות ביקורת (CTL) ודלקת חניכיים (PT). דלקת חניכיים הושרה על ידי הנחת תפר ניילון 6-0 ביום 0 כדי לקדם הידבקות חיידקית מתמשכת ולעורר התקדמות מחלה כרונית חמורה. לאחר 30 יום, כל העכברים הומתו (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד) כדי להעריך נזק לרקמות ואובדן התקשרות (AL) באמצעות ניתוח היסטומטרי (איור 1). פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת הרדמה

  1. הכינו דילול של קסילזין וקטמין (1:10) עם מים להזרקה (ציר). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש תוך 4 שבועות.
  2. זהה ושקול כל עכבר. הכינו מינון מבוסס משקל של קסילזין (1 מ"ג/ק"ג) וקטמין (2 מ"ג/ק"ג) למריחה תוך שרירית באמצעות מזרק אינסולין.
  3. יש להזריק 50% מהמינון הכולל של תמיסת ההרדמה לתוך החלק האחורי. חזור על ההליך בצד הנגדי.
  4. הניחו את העכברים בקופסה עמוקה (10 ס"מ) והניחו להם להירדם, מה שלוקח כ 3-5 דקות.
  5. מנעו יובש בעיניים ונזק לקרנית עקב הרדמה על ידי מריחת טיפת היפרומלוז על כל עין כל 15 דקות עד שהעכברים ערים לחלוטין ויכולים למצמץ כרגיל.
    הערה: יש לשמור את העכברים בהשגחה למשך 45 דקות, משך ההרדמה המשוער. אם עכבר מתעורר לפני השלמת ההליך, יש להשעות את ההליך ולהחליף את העכבר.

2. מיקום בעלי חיים

  1. לאחר שהעכבר ישן, הנח אותו על שולחן עבודה הפונה כלפי מעלה כשראשו לכיוון המפעיל. משוך בעדינות כל רגל ללא מתח ואבטח אותן עם סרט מיקרופור כדי למנוע תנועות לא רצוניות פתאומיות. כסו את העכבר בשמיכה או בגזה כדי לשמור על חום הגוף.
  2. כדי לשמור על החוטם פתוח, הנח קצה אחד של גומי אורתודונטי סביב החותכות העליונות והדק את הקצה השני למחזיק עליון ללא מתח. הניחו גומי אורתודונטי שני סביב החותכות התחתונות ואבטחו אותו למחזיק תחתון בעזרת גומיה.
  3. הניחו את מפרידי הלחיים והזיזו בזהירות את הלשון לצד אחד לנראות טובה יותר.
  4. מקם את המיקרוסקופ כדי לאפשר הדמיה נאותה של הטוחנות העליונות, החל ממטרת ההגדלה הנמוכה ביותר. לאחר האיתור, כוונן את ההגדלה כדי להבטיח נוחות ומיקוד מיטביים למפעיל.

3. מיקום קשירה

  1. לאחר שהתמונה ברורה, זהה את שלוש הטוחנות העליונות: הטוחנת הגדולה והפרוקסימלית (M1), הטוחנת הבאה (M2) והטוחנת הקטנה והדיסטלית (M3). הנח תפר ניילון 6-0, מכיוון שקוטרו מקל על מיקום הקשירה וגורם פחות נזק מכני לרקמות מאשר תפרים רחבים יותר.
    1. אתר את הצד הדיסטלי של M2, החזק את קצה תפר הניילון 6-0 בעזרת פינצטה, והנח את הקצה בבסיס הפפילה מהפלטין. הפעילו לחץ קל דרך בסיס חלל החך הבין-פרוקסימלי לכיוון פני השטח הבוקאלי (איור 2A).
    2. ברגע שתפר הניילון 6-0 חוצה, משוך אותו דרך החלל הבין-פרוקסימלי לכיוון הצד הבוקאלי (איור 2B).
  2. הנח את קצה תפר הניילון 6-0 בבסיס האזור הבין-פרוקסימלי על פני השטח המזיאלי של M2 מהצד הבוקאלי. דחפו בעדינות את קצה התפר כדי לחצות אותו מתחת לחלל הבין-פרוקסימלי והעבירו אותו דרך החלל הבוקאלי בחזרה אל החיך (איור 2C).
  3. משוך את תפר הניילון 6-0 בעדינות, החזק את הקצה בפינצטה, כוונן אותו סביב M2 ואבטח את התפר בשלושה קשרים פשוטים.
  4. חותכים את תפר הניילון 6-0 במספריים עדינים (איור 2D).

4. התאוששות בעלי חיים

  1. כדי לשחרר את העכבר, הסר את מפרידי הלחיים, סרט המיקרופור מהרגליים וגומיות אורתודונטיות. ראשית, הסר את האלסטי סביב החותכות התחתונות, ולאחר מכן הסר את האלסטי סביב החותכות העליונות.
    1. הסר את העכבר משולחן העבודה, עטוף אותו בגזה או בבד והניח אותו עם הפנים כלפי מעלה. שמור על הלשון הצידה כדי לשמור על דרכי הנשימה פתוחות ולמנוע חסימה.
  2. שמור על החיה חמה, מכוסה בבד או בגזה, ותחת השגחה עד שהיא ערה לחלוטין. לאחר מכן, הניחו אותם בכלובים הרגילים שלהם.
  3. מרחו טיפת היפרומלוז על כל עין עד שהעכבר יכול למצמץ כרגיל.
  4. שמור על בעל החיים בתנאים סטנדרטיים.

5. בדיקת קשירה

  1. בדקו את הקביעות של קשירת הניילון מדי שבוע (איור 3A,B).
  2. קח את העכבר, החזק את הראש והגוף בחוזקה והשתמש בפינצטה כדי לפתוח את החוטם. התבונן בתפר הניילון 6-0 סביב M2 לאור מנורה.
  3. לבסס התפתחות של מחלת חניכיים המבוססת על הצטברות ביופילם וגירוי מכני. אמת זאת באמצעות ניתוח היסטולוגי.

6. היסטולוגיה

  1. לאחר 30 יום, המתת חסד של העכברים בתא CO2 (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). קציר את הלסתות העליונות כפי שדווח קודם לכן39. שטפו את הרקמות שנקטפו בתמיסת NaCl של 0.9% והניחו אותן בצינורות מיקרו-צנטריפוגה חדשים ומסומנים.
  2. תקן את הדגימות בתמיסת פרפורמלדהיד של 4% למשך שעתיים עם תסיסה.
  3. שוטפים את הדגימות במי ברז למשך שעתיים.
  4. כדי להסיר מינרלים מהעצם ולהכין קטעי פרפין איכותיים, יש להסיר את הדגימות בעשרים נפחים של תמיסת EDTA 4% (pH 7.3) למשך 20 יום בצינורות מיקרו-צנטריפוגה, להחליף את ה-EDTA כל 4 ימים40.
  5. הטמע את הדגימות בפרפין. חותכים קטעים של 5 מיקרומטר מאזור M2 ומכתימים אותם בהמטוקסילין ואאוזין (H&E)41.

7. ניתוח נתונים

  1. התבונן בחתכים ההיסטולוגיים המוכתמים במיקרוסקופ אופטי כדי לבצע ניתוח תיאורי של שינויים בתצורת אפיתל הסולקוס, סיבי חניכיים, סיבי חניכיים, גובה ושלמות פסגת המכתשית.
  2. קבע אובדן התקשרות (AL) על ידי מדידת המרחק בין צומת הצמנטואמייל (CEJ) לנקודה הגבוהה ביותר של פסגת העצם. צייר קו בין שתי הנקודות הללו באמצעות תוכנת עריכה דיגיטלית. בצע ניתוח היסטומטרי על משטחי הבוקאלי והחך על פי המתודולוגיה שתוארה על ידי Semenoff et al.42 (איור 4).

8. ניתוח סטטיסטי

  1. לנתח את הנתונים שהתקבלו מקבוצות CTL ו-PT באמצעות מבחן Mann-Whitney U. קחו בחשבון את p < 0.05 כמובהקות סטטיסטית. השתמש בסטטיסטיקה ובתוכנות גרפים לניתוח.

תוצאות

מתודולוגיה זו מאפשרת לעכברים מושרים לפתח דלקת חניכיים (PT) מהשבוע השני ואילך. העכברים היו במעקב שבועי כדי לוודא את נוכחות הקשירה. המתת חסד בוצעה ביום ה-30. המאפיינים הקליניים של כל הקבוצות הוערכו. קבוצת הביקורת שמרה על מאפיינים נורמליים, כגון צבע ומבנה החניכיים השוליים, לאורך זמן. בהשוואה לאלו בקבוצת ה-CTL, רקמות קבוצת ה-PT הראו דלקת, דימום והיווצרות כיס חניכיים, שנצפו בשולי החניכיים בעכברים שהושרו (איור 5).

התפתחות המחלה אושרה על ידי ביצוע ניתוח היסטולוגי והיסטומטרי של ה-AL של רקמת החניכיים של M2 בשתי הקבוצות. קבוצת ה-CTL הציגה מאפיינים היסטולוגיים הדומים לאלה של רקמות בריאות: האפיתל של חניכיים שוליים וסולקוס, סיבי חניכיים (איור 6A, חץ כחול CTL), אפיתל הצומת ופסגת המכתשית (איור 6A, חץ ירוק CTL); סיבי רקמת החיבור היו במצב ובגובה תקינים; הסיבים של שארפי היו שלמים בעת החדרתם לעצם המכתשית ולשורש הצמנטום; ונצפה עובי סימטרי סביב השורש (איור 6A, חץ כתום CTL), במיוחד בחיבור הן במבט הבוקאלי והן במבט הפלאטיני. גרעיני התאים בסיבי הרצועה החניכיים (PDL), רקמת החיבור והאוסטאוציטים של העצם המכתשית נראו בבירור (40x). בקבוצת PT, רקמות החניכיים הציגו נזק חמור, עם נוכחות של כיסי חניכיים, המאופיינים באובדן הפסגה המכתשית (איור 6A, PT, חץ ירוק), נדידה אפיקלית של האפיתל וניתוק של סיבי שארפי על פני השורש (איור 6A, PT, חץ כתום). ברקמת החיבור, החניכיים והעצם של הצד הבוקאלי והחך חסרו גרעיני תאים (איור 6A, PT, חץ כחול), שכולם אופייניים למחלות חניכיים.

ניתוח היסטומטרי גילה כי עבור קבוצת ה-CTL, מיקום פסגת העצם היה קבוע משני הצדדים: בוקאלי ופלאטין. יתר על כן, בהשוואה לקבוצת ה-CTL, קבוצת ה-PT הציגה עלייה משמעותית בעומק ה-AL של פני השטח הבוקאלי (p = 0.0001, 117.5 ננומטר ± 6 לעומת 209.17 ננומטר ± 10) עקב אובדן רקמות. בהשוואה לזה של קבוצת ה-CTL, שטח הפנים של קבוצת ה-PT היה גדול משמעותית (p = 0.03, 175.25 ננומטר ± 8 לעומת 254.03 ננומטר ±-50). למרות ששני הצדדים הציגו הרס רקמות, זה היה בולט יותר על פני החך, עם עומק גדול יותר ואובדן חיבור גדול יותר, מאשר על פני השטח הבוקאלי (איור 6B,C). ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו בעבר שהראו התנהגות דומה28.

figure-results-2457
איור 1: תכנון ניסוי. דלקת חניכיים (PT) הושרה בעכברי BALB/c בני שישה עד שמונה שבועות (16 גרם) באמצעות מודל קשירת ניילון 6-0 (יום 0). שלושים יום לאחר ההשראה, PT ועכברים בריאים (CTL) הומתו להערכת רקמות חניכיים. בוצעו שלושה ניסויים עצמאיים; המספר הכולל של עכברים בשתי קבוצות ה-CTL וה-PT היה n = 9. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3097
איור 2: הליך שלב אחר שלב למיקום קשירה כדי לגרום לדלקת חניכיים. תמונות מייצגות של רצף השלבים המשמשים להשראת דלקת חניכיים בטוחנות העליונות השנייה של העכבר: (A) מראה כיצד תפר הניילון 6-0 מוחדר דיסטלי ל-M2, מהחיך לבוקלי; (B) מראה כיצד יש להפעיל לחץ בעדינות מתחת לאזור המגע; (C) מראה כיצד תפר הניילון צריך לעבור דרך החלק המזיאלי של M2, מהחיך לבוקלי; ו-(D) מראה כיצד תפר הניילון מותאם סביב M2 ומאובטח בקשר משולש כדי לשמש כקשירה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3934
איור 3: מודל מחלת חניכיים של קשירת ניילון. (A) איור של מיקום הקשירה בשן הטוחנת העליונה השנייה. (B) תמונה של קשירת הניילון שממוקמת במודל של עכבר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4459
איור 4: ניתוח היסטומטרי. אובדן ההצמדה (AL) נקבע בהתחשב במרחק בין צומת הצמנטואמייל (CEJ) לנקודה הקרובה ביותר של הפסגה המכתשית, תוך מתיחת קו בין שתי הנקודות על פני השטח הבוקאלי והחך. לעיון: V(B): בוקאלי, P חיך. הגדלה: פי 10; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5058
איור 5: התפתחות סימנים קליניים של דלקת חניכיים בעכברי WT. תמונה קלינית מייצגת של רקמות חניכיים, בקרת CTL; PT, מחלת חניכיים יום 1 לאחר הנחת תפר הניילון 6-0; יום 30 לאחר הסרת תפרים. בוצעו תמונות מייצגות של שלושה ניסויים עצמאיים; המספר הכולל של עכברים בשתי קבוצות ה-CTL וה-PT היה n = 9. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5688
איור 6: רקמות חניכיים הראו אובדן התקשרות ונזק לרקמות במודל המושרה על ידי ניילון של דלקת חניכיים. (A) תמונות היסטולוגיות מייצגות עם צביעת H&E של רקמות חניכיים, בקרה (CTL); דלקת חניכיים (PT), פאנל שמאלי 10x, מוצג ניתוח היסטומטרי, עם קו מצומת הצמנטואמייל (CEJ) לקצה הפסגה המכתשית, בוקאלי (B), פלאטין (P), המצוין בקופסה הכחולה בוקאלי הקופסה האדומה. לוחות ימניים בוקאליים וחך בהגדלה קרובה פי 40. חץ כחול, רקמת חיבור; חץ כתום, החדרת רצועות חניכיים במלט רדיקולרי; חץ ירוק, סמל עצם. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B, C) ניתוח היסטומטרי של CEJ והנקודה הגבוהה ביותר של הסמל המכתשית. בוצעה תמונה מייצגת של שלושה ניסויים עצמאיים; המספר הכולל של עכברים בשתי קבוצות ה-CTL וה-PT היה n = 9. הנתונים מבוטאים כאמצעים ± SEMs, וערכים של *p < 0.05 ו-****p <-0.0001 נחשבו מובהקים סטטיסטית על פי מבחן Mann-Whitney U. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

חומראינדוקציהיתרונותחסרונות
משיעובר במרחב הבין-פרוקסימליהיצמדות חיידקית גבוההדורש מיומנות כדי להכניס
תפר רב-פילמנטנקרע בקלות
ממקור טבעיאובדן קשירה
חוט אורתודונטיהחדרה באזור הבין שינייםקל יותר למקםזקוק להחדרה זהירה כדי למנוע נזק לרקמות
עמיד
ניילוןהוספה מתחת לנקודת המגעקל יותר למקםדורש הגדלה
אין נזק לרקמות מחומרניתן לעקור קשר
עמיד וגמיש
היצמדות חיידקי חניכיים

טבלה 1: חומרים שונים המשמשים לגרימת מחלת חניכיים על ידי קשירה בעכברים.

Discussion

מספר מודלים של בעלי חיים של דלקת חניכיים שימשו להערכת היבטים שונים, כגון תגובות מיקרוביולוגיות וחיסוניות, ויש להם כמה קווי דמיון למחלות אנושיות43. ממצאים אלה מספקים עדות למסגרת של מחלות חניכיים, כגון תפקיד הביופילמים, התגובה החיסונית ואינטראקציות עם מצבים מערכתיים44,45.

למודלים של בעלי חיים של דלקת חניכיים יש מורכבויות ודמיון שונים; לדוגמה, פרימטים, כלבים או חזירים מיניאטוריים שאינם אנושיים הם הדומים ביותרלמחלות חניכיים אנושיות, אם כי ההוצאות והדרישות לטיפול ותחזוקה שלהם הופכים את המודלים הללו לבלתי מעשיים. יתר על כן, דגמי עכברים של דלקת חניכיים הם פחות יקרים וקלים יותר לטיפול. יתר על כן, עכברים יכולים לעבור שינוי גנטי כדי ליצור מולקולה או תא ספציפי מעניין46, והמתודולוגיה מבוססת היטב47.

למרות שעכברים אינם מפתחים PT באופן טבעי, זה יכול להיגרם על ידי מתודולוגיות שונות; הדגם הנפוץ ביותר הוא המודל המושרה על ידי קשירה, הניתן לשחזור מאוד22,23, שכן נעשה שימוש במספר חומרים, כגון חוט אורתודונטי, משי או ניילון, בין היתר.

בפרט, ניילון עשוי להיות אופציה מעשית לגרימת PT; בשל חלק ממאפייניו, כמונופילמנט סינטטי, יש לו תגובת רקמות מינימלית ומאפשר הידבקות של חיידקי חניכיים כגון Fusobacterium nucleatum ו- Porphyromona intermedia35,36. זה מאפשר לתגובה הדלקתית להוביל להצטברות חיידקים "רגילה".

מחקר זה מציע אלטרנטיבה לפיתוח PT באמצעות שימוש בתפר ניילון 6-0 כמודל אינדוקציה, וניתחנו את הנתונים הקליניים וההיסטולוגיים של עכברי CTL ו-PT. זיהינו את המאפיינים של שולי החניכיים הקיימים בקבוצת PT, כגון דימום, דלקת והיווצרות כיס חניכיים. תצפיות אלה אומתו באמצעות ניתוח היסטומטרי. בפרט, מידת אובדן ה-PT הייתה שונה באופן משמעותי; למרות שגם משטחי הבוקאלי וגם החך הראו הרס רקמות, הוא היה גדול יותר על פני החך. הסיבה לכך היא ככל הנראה שהדופן הבוקאלית רחבה יותר בעכברים מאשר בבני אדם.

Lima et al.31 דיווחו כי קשירה מניילון גרמה ל-PT; למרות שהם השתמשו בתפר 5-0, הם הניחו את הקשר על פני השטח הבוקאלי ומדדו אובדן עצם ליניאלי 6 מיקרו-CT לאחר 15 יום. בעוד שנעשה שימוש בתפרי ניילון 6-0, הקשר הונח על משטח החך, וניתוח היסטומטרי בוצע לאחר 30 יום כדי לגרום ל-PT חמור. התוצאות חשפו כי 6-0 תפרי ניילון סביב M2 הובילו ל-PT. ליברמן ועמיתיו לא דיווחו על הבדלים בין השיטות המשמשות להערכת אובדן עצם48.

תוצאות אלו מראות כי המודל המוצע ניתן לשחזור ויש לו מספר יתרונות. ראשית, זה קל יותר לשימוש מכיוון שהוא דומה לשימוש במשחיל; לפיכך, הוא לא בהכרח דוחף את התפר לכיוון החלל הבין-פרוקסימלי, מה שמגדיל את הסיכון לפגיעה בחלל הפה של העכבר בגלל החלל המוגבל. שנית, מודל זה מאפשר התפתחות PT באמצעות הצטברות ביופילמים בצורה טבעית וגורם לדלקת כרונית ברקמות חניכיים.

למודל זה מספר מגבלות, כולל עקומת הלמידה, הצורך בעזרים חזותיים והאתגרים הכרוכים בשימוש במיקרוסקופים או בזכוכית מגדלת. בנוסף, קיימת אפשרות לאבד את הקשרים והקשרים, מה שמחייב לוודא את קביעות הקשירה כדי להבטיח את המשך נוכחותו של הגירוי המרגיז.

לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את השלבים הנדרשים להקמת מודל חזק של PT מתקדם המושרה על ידי תפר ניילון 6-0, המאפשר מיקום קשירה. הוא גם מפרט את המתודולוגיה למתן הרדמה, הגדלה והערכת אובדן התקשרות. יתר על כן, ניתן להשתמש במודל זה כדי לחקור מנגנונים ספציפיים למארח המעורבים באובדן עצם דלקתי עקב PT, כמו גם את תפקידו של PT בהתפתחות מחלות או הפרעות ממקור זיהומי, ניאופלסטי, אוטואימוני או הורמונלי. לכן, לשימוש במודל זה לחקר PT הנגרם על ידי הצטברות ביופילם ודלקת יש פוטנציאל לייצר ידע בסיסי עם השלכות טיפוליות ולשפר את האבחון.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי אינטרסים בנוגע לפרסום מאמר זה.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מספר המענק של המועצה למדע וטכנולוגיה של מדינת מקסיקו (COMECYT) [FICDTEM-2021-072] ותוכנית התמיכה בפרויקטים מחקריים וחדשנות טכנולוגית (PAPIIT)-UNAM, מספר מענק [IN-217021]. אנו מודים לתוכנית ההתמחות באנדופריודונטולוגיה, FES Iztacala, UNAM על המתקנים שניתנו ליצירת סרטון זה ולרוזלבה יאנז אורטיז, DDS, על תמיכתה ביצירת סרטון זה. חלק מהדמויות נוצרו באמצעות תוכנית Biorender (הסכם מספר ME282NWCI1).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% NaCl solution PiSARinse maxillae 
6-0 nylon sutureAtramat, Internacional FarmacéuticaPE1946-NLigature placement
Amscope 3.7 program for digital cameraAmscope x64, 4.11.21973.20230107Data colection
EDTA solution Sigma–AldrichE5134Decalcification 
Fine scissorsgenericTo cut the 6-0 nylon suture
Fine tweezersgeneric6-0 nylon suture
Gauze padgenericTo keep corporal tempature 
GraphPad Prism GraphPad Prism Version 8.3.0Data analysis 
Hypromellosegeneric Eye lubricant
Injectable waterPisaDilution of anesthetic solution
KetamineAnesket, PisaAnesthetic
Micro centrifuge tubes Cellpro801501To contain tissues durin decalcification 
Micropore3M 1533To fix mouse
Microscope digital cameraAmscope MU1603Histology 
MicrotubesAxygenMCT-150-CStore anesthetic dilution
Optical microscope UNICOSerie G380Histology 
Orhodontic elasticsTP Orthodintics, Inc blueTo keep the snout open 
Paraformaldehyde solutionSigma–Aldrich158127Tissue Fixation 
Paraplast Leica39601006Histology 
Surgical microscope Carl Zeiss GmbH Berlin6-0 nylon suture
Ultra Fine Insulin Syringes 6mm U-100, 0.3 mLBD326385To inject the anesthetic solution 
Universal rubber bands genericTo keep the snout open 
WorktableGeneric Wooden base to support mice 
XylazinePorcin, PisaPreanesthetic

References

  1. Nazir, M., et al. Global prevalence of periodontal disease and lack of its surveillance. Sci World J. 2020 (1), 2146160(2020).
  2. Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: A call for global action. J Clin Periodontol. 44 (5), 456-462 (2017).
  3. Caton, J. G., et al. A new classification scheme for periodontal and peri-implant diseases and conditions - introduction and key changes from the 1999 classification. J Clin Periodontol. 45 (Suppl 20), S1-S8 (2018).
  4. Harrel, S. K., Cobb, C. M., Sottosanti, J. S., Sheldon, L. N., Rethman, M. P. Clinical decisions based on the 2018 classification of periodontal diseases. Compend Contin Educ Dent. 43 (1), 52-56 (2022).
  5. Stöhr, J., Barbaresko, J., Neuenschwander, M., Schlesinger, S. Bidirectional association between periodontal disease and diabetes mellitus: A systematic review and meta-analysis of cohort studies. Sci Rep. 11 (1), 13686(2021).
  6. Sanz, M., et al. Periodontitis and cardiovascular diseases: Consensus report. J Clin Periodontol. 47 (3), 268-288 (2020).
  7. Figuero, E., Han, Y. W., Furuichi, Y. Periodontal diseases and adverse pregnancy outcomes: Mechanisms. Periodontol 2000. 83 (1), 175-188 (2000).
  8. Jung, E., et al. The etiology of preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 226 (2s), S844-S866 (2022).
  9. Hajishengallis, G., Chavakis, T. Local and systemic mechanisms linking periodontal disease and inflammatory comorbidities. Nat Rev Immunol. 21 (7), 426-440 (2021).
  10. Arjunan, P., et al. Exacerbation of AMD phenotype in lasered CNV murine model by dysbiotic oral pathogens. Antioxidants. 10 (2), 309(2021).
  11. Ma, K. S., et al. Dementia and the risk of periodontitis: A population-based cohort study. J Dent Res. 101 (3), 270-277 (2022).
  12. Hajishengallis, G. Illuminating the oral microbiome and its host interactions: Animal models of disease. FEMS Microbiol Rev. 47 (3), fuad018(2023).
  13. Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The enduring importance of animal models in understanding periodontal disease. Virulence. 6 (3), 229-235 (2015).
  14. Weinberg, M. A., Bral, M. Laboratory animal models in periodontology. J Clin Periodontol. 26 (6), 335-340 (1999).
  15. Shanbhag, S., et al. Peri-implant bone regeneration in pigs. Int J Implant Dent. 10 (1), 55(2024).
  16. Do, M. J., et al. Development of animal experimental periodontitis models. J Periodontal Implant Sci. 43 (4), 147-152 (2013).
  17. Khuda, F., Baharin, B., Anuar, N. N. M., Satimin, B. S. F., Nasruddin, N. S. Effective modalities of periodontitis induction in rat model. J Vet Dent. 41 (1), 49-57 (2024).
  18. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nat Protoc. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  19. Martuscelli, G., Fiorellini, J. P., Crohin, C. C., Howell, T. H. The effect of interleukin-11 on the progression of ligature-induced periodontal disease in the beagle dog. J Periodontol. 71 (4), 573-578 (2000).
  20. Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. Int J Mol Sci. 22 (16), 8900(2021).
  21. Wong, R. L., et al. Comparing the healing potential of late-stage periodontitis and peri-implantitis. J Oral Implantol. 43 (6), 437-445 (2017).
  22. Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. J Vis Exp. (155), e59667(2020).
  23. De Almeida, K., et al. Identification of microRNAs expressed in an animal model of periodontal disease and their impact on pathological processes. Tissue Cell. 90, 102525(2024).
  24. Yoon, H., et al. Temporal changes of periodontal tissue pathology in a periodontitis animal model. J Periodontal Implant Sci. 53 (4), 248-258 (2023).
  25. Benzen, B. H., et al. A comparison of two models of experimental periodontitis in rats. Scand J Lab Anim Sci. 32 (2), 73-80 (2005).
  26. Franca, L. F. C., et al. Periodontitis changes renal structures by oxidative stress and lipid peroxidation. J Clin Periodontol. 44 (6), 568-576 (2017).
  27. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  28. Ortiz-Sánchez, B. J., et al. Periodontitis exacerbation during pregnancy in mice: Role of macrophage migration inhibitory factor as a key inductor. J Periodontal Res. 59 (2), 267-279 (2023).
  29. Lu, H., et al. Chronic stress accelerates ligature-induced periodontitis by suppressing glucocorticoid receptor-α signaling. Exp Mol Med. 48 (3), e223(2016).
  30. França, A. L. Q., et al. Molecular docking study and antireabsorptive activity of a semi-synthetic coumarin derivative from Platymiscium floribundum in the ligature-induced periodontitis in rats: The involvement of heme oxygenase-1. Clin Oral Investig. 26 (2), 1701-1711 (2022).
  31. Lima, M. L. S., et al. The receptor at1 appears to be important for the maintenance of bone mass, and at2 receptor function in periodontal bone loss appears to be regulated by at1 receptor. Int J Mol Sci. 22 (23), 12849(2021).
  32. Faris, A., et al. Characteristics of suture materials used in oral surgery: Systematic review. Int Dent J. 72 (3), 278-287 (2022).
  33. Nadafpour, N., Montazeri, M., Moradi, M., Ahmadzadeh, S., Etemadi, A. Bacterial colonization on different suture materials used in oral implantology: A randomized clinical trial. Front Dent. 18, 25(2021).
  34. Naghsh, N., Yaghini, J., Arab, A., Soltani, S. Comparison of the number of bacterial colonies among four types of suture threads using simple loop method following periodontal surgery in patients with periodontitis: A single-blind randomized clinical trial. Dent Res J (Isfahan). 20, 71(2023).
  35. De Castro Costa Neto, O., et al. Oral bacteria adherence to suture threads: An in vitro study. Oral Maxillofac Surg. 19 (3), 275-280 (2015).
  36. Asher, R., Chacartchi, T., Tandlich, M., Shapira, L., Polak, D. Microbial accumulation on different suture materials following oral surgery: A randomized controlled study. Clin Oral Investig. 23 (2), 559-565 (2019).
  37. Banche, G., et al. Microbial adherence on various intraoral suture materials in patients undergoing dental surgery. J Oral Maxillofac Surg. 65 (8), 1503-1507 (2007).
  38. Kaur Randhawa, R., et al. Assessment of the mechanical properties of different suture materials for oral surgery: An in vitro tensile strength study. Cureus. 16 (8), e65952(2024).
  39. Liu, Y., et al. Using inducible osteoblastic lineage-specific stat3 knockout mice to study alveolar bone remodeling during orthodontic tooth movement. J Vis Exp. (197), e65613(2023).
  40. Wang, S. K., et al. Itgb6 loss-of-function mutations cause autosomal recessive amelogenesis imperfecta. Hum Mol Genet. 23 (8), 2157-2163 (2014).
  41. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin-embedded blocks. Methods Mol Biol. 1897, 253-268 (2019).
  42. Semenoff, T. A., et al. Histometric analysis of ligature-induced periodontitis in rats: A comparison of histological section planes. J Appl Oral Sci. 16 (4), 251-256 (2008).
  43. Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. J Biomed Biotechnol. 2011, 754857(2011).
  44. Zhao, P., Xu, A., Leung, W. K. Obesity, bone loss, and periodontitis: The interlink. Biomolecules. 12 (7), 865(2022).
  45. Graves, D. T., Corrêa, J. D., Silva, T. A. The oral microbiota is modified by systemic diseases. J Dent Res. 98 (2), 148-156 (2019).
  46. Yoshimi, K., Mashimo, T. Application of genome editing technologies in rats for human disease models. J Hum Genet. 63 (2), 115-123 (2018).
  47. Vandamme, T. F. Rodent models for human diseases. Eur J Pharmacol. 759, 84-89 (2015).
  48. Liberman, D. N., Pilau, R. M., Orlandini, L. F., Gaio, E. J., Rösing, C. K. Comparison of two methods for alveolar bone loss measurement in an experimental periodontal disease model in rats. Braz Oral Res. 25 (1), 80-84 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved