두 번째 상부 대구치에서 나일론 결찰에 의해 유발된 진행성 치주염의 쥐 모델

요약

본 연구는 생쥐에서 치주염을 유발하기 위한 변형된 6-0 나일론 결찰 방법을 설명하며, 이는 재현성이 높으며 연구자들이 치주 질환의 발병에서 병리학적 결과에 이르기까지 치주염을 연구할 수 있는 대안을 제시합니다.

초록

치주 질환(PD)은 치아의 지지 조직에 영향을 미치는 염증성 질환으로 전 세계적으로 가장 널리 퍼진 질병 중 하나입니다. 이 병의 심각한 형태인 치주염은 연조직, 치아 및 뼈를 파괴합니다. 치주염의 동물 모델은 영장류, 개, 소형 돼지 및 생쥐를 사용하여 개발되었습니다. 이 중 ligature-induced mouse model은 인간 치주염의 주요 측면을 효과적으로 복제하는 동시에 빠른 질병 진행, 재현성, 예측 가능성 및 저렴한 비용과 같은 이점을 제공합니다. 결찰자를 사용하는 마우스 모델은 치주 조직의 미생물학 및 면역학적 미세환경에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 면역 반응에서 생물막의 중요한 역할과 전신 질환과의 연관성을 강조했습니다. 이 연구는 마우스에서 치주염을 유발하기 위한 변형된 나일론 결찰 방법을 제시합니다. 수정에는 실크 봉합사 대신 나일론 봉합사를 사용하고 접점을 통과하지 않고 치간 접촉 부위 아래에 배치하는 것이 포함됩니다. 이 접근법은 치주염을 효과적으로 유발하는 동시에 기술을 단순화합니다. 봉합사 배치에 대한 자세한 방법론이 그래픽으로 설명되어 있으며 조직학적 및 조직학적 분석을 통해 치주염의 진행을 보여줍니다.

서문

치주 질환(PD)은 치아를 지지하는 조직의 염증성 질환으로 세계에서 가장 흔한 질환^{중 하나입니다 1}; 파킨슨병 발병률은 전 세계적으로 20%-50%인 것으로 보고되었습니다². PD는 진행 정도가 다릅니다. 치은염(gingivitis)이라고 하는 가벼운 형태는 연조직에만 영향을 미치며, 치주염(periodontitis, PT)이라고 하는 심각한 형태는 뼈와 같은 단단한 조직에 영향을 미칩니다³. PT는 염증성 질환이기 때문에 당뇨병^{5, 심}혈관 질환⁶, 임신 부작용^{7 또는 자}간전증⁸과 같은 호르몬 상호작용, 염증성 질환⁹, 심지어 안구 변화¹⁰ 또는 치매¹¹와 같은 질병 진행을 변화시킬 수 있는 여러 위험 요인4에 의해 변형될 수 있는 복잡한 면역 반응으로 간주되어야 한다.

그러므로, PT의 발병 또는 유병률과 관련된 병인을 이해하거나, 새롭거나 더 효과적인 치료 전략을 시험하거나, 전신 질환과 PT 또는 치주 미생물군 사이의 상관관계를 확인하기 위해서는 동물 모델이 필요하다¹².

효과적인 연구 방법을 선택하는 것은 PT의 발달을 이해하고 연구 질문에 적절하게 답변하는 데 중요합니다¹³. 수년에 걸쳐 PT 연구를 위해 다양한 동물 모델이 개발되었습니다. 그러나 영장류, 개, 토끼, 미니어처 돼지와 같은 모델은 비용이 많이 들고 사용하기가 복잡하다 ^14,15,16. PT의 쥐 모델, 특히 ligation-induced PT 모델은 빠른 개발, 재현성, 예측 가능성 및 저비용 등 많은 장점을 가지고 있습니다 17,18,19.

PT를 유도하기 위해 경구용 세균 접종, 지질다당류 주사 및 결찰 유도 ^10,20과 같은 여러 방법이 사용되지만 각각 장점과 단점이 있습니다¹⁷, 나일론 결찰에 의해 유도된 PT의 쥐 모델은 인간의 발달 메커니즘과 유사했습니다 20,21,22,23. PT는 상주 미생물총(microbiota)의 보유를 통해 발생하여 염증을 유발하고 조직 손실을 유발합니다. 또한, 마우스는 PT 연구를 위해 관심 있는 다른 세포 집단 또는 분자를 연구하기 위해 유전적으로 변형될 수 있습니다.

치과 결찰은 교정 와이어, 실크 봉합사^(24,25) 또는 나일론 봉합사⁽²⁶)와 같은 다양한 재료를 사용하여 수행할 수 있습니다. 생쥐에서 결찰에 의해 PT를 유도하는 가장 일반적인 재료는 실크입니다. 이 방법론은 Marchesan et ^al.18, Abe et ^al.27 및 Chadwick et ^al.22과 같은 다른 저자에 의해 설명되었으며, 각각 고유한 수정 사항이 있으며, 이러한 모든 방법은 여러 연구자에 의해 성공적으로 사용되었습니다²⁸. 그러나 생쥐의 위쪽 어금니 주위에 실크 봉합사를 배치하는 것은 복잡할 수 있습니다. Marchesan et al.은 "ligature holder"의 사용을 제안했습니다. Abe et al. 및 Chadwick et al.은 접촉점을 통해 봉합사를 배치했지만 Chadwick et al.은 어금니 M1 및 M2 주위에 봉합사를 배치했습니다.

다양한 두께의 나일론 봉합사는 다양한 동물 모델에서 PT 개발에 사용되었습니다 29,30,31. Lima et ^al.31은 5-0 나일론 봉합사를 사용했습니다. 이전 연구에서는 6-0 나일론 봉합사를 사용했으며, 결과는 비슷했다²⁸.

멀티필라멘트 봉합사와 비교하여, 나일론 봉합사는 비흡수성 모노필라멘트 합성물이며 염증성 조직 반응이 더 낮다³²; 또한, 나일론 봉합사는 미생물 축적 ^33,34을 허용하며, 나일론 봉합사 12,14,17,19,24,27,35,37 의 통성 혐기성 박테리아와 함께 Fusobacterium nucleatum과 Porphyromona intermedia^35,36의 접착에 대한 증거가 있습니다 (표 1).

이러한 특성으로 인해 염증 반응이 물질 축적보다는 박테리아 축적에 주로 집중될 수 있습니다. 또한 나일론은 실크보다 인장 강도와 같은 기계적 특성이 우수합니다³⁸.

따라서, 본 연구에서, 치간 접촉 영역 아래에 M2 주위에 배치된 6-0 나일론 봉합사는 마우스에서 진행성 치주염의 발병을 유도했습니다. 이 접근 방식을 사용하면 일반 핀셋으로 합자를 배치할 수 있으며 결과는 일관됩니다. 30일 후, PT의 발달은 조직 측정 및 조직학적 분석을 통해 확인할 수 있습니다.

프로토콜

실험 동물과 관련된 모든 절차는 멕시코의 공식 표준 NOM-062-ZOO-1999에 따라 '실험 동물에 대한 생물 의학 연구를 위한 윤리적 프레임워크'를 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 이 연구는 CE/FESI/072024/1765 프로토콜에 따라 FES-Iztacala(Facultad de Estudios Superiores Izzacala)의 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다. 생쥐는 FES-Iztacala 동물 시설의 병원체가 없는 환경에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 동물 방에 수용되었습니다. 이 프로토콜은 이전에 Abe et ^al.27에 의해 설명된 방법을 수정한 것입니다. 생후 6주에서 8주 된 암컷 BALB/c 마우스(체중 16g)를 대조군(CTL)과 치주염(PT) 그룹으로 나누었습니다. 치주염은 지속적인 박테리아 부착을 촉진하고 심각한 만성 질환 진행을 유발하기 위해 0일차에 6-0 나일론 봉합사를 배치하여 유발되었습니다. 30일 후, 조직 분석을 통해 조직 손상 및 부착 손실(AL)을 평가하기 위해 모든 마우스를 안락사시켰습니다(기관 승인 프로토콜에 따라). 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 마취 준비

1. 자일라진과 케타민의 희석액(1:10)을 주사 가능한 물(스톡)로 준비합니다. 4 °C에서 보관하고 4 주 이내에 사용하십시오.
2. 각 마우스를 식별하고 무게를 측정합니다. 인슐린 주사기를 사용하여 근육 주사를 위해 자일라진(1mg/kg)과 케타민(2mg/kg)의 체중 기준 용량을 준비합니다.
3. 마취액 총 용량의 50%를 뒷다리에 주입합니다. 반대쪽에서도 절차를 반복합니다.
4. 쥐를 깊은 상자(10cm³)에 넣고 잠들게 하는데 약 3-5분이 걸립니다.
5. 마우스가 완전히 깨어나 정상적으로 눈을 깜박일 수 있을 때까지 15분마다 각 눈에 하이프로멜로스 방울을 바르면 마취로 인한 안구 건조증과 각막 손상을 예방할 수 있습니다.
   참고: 마우스는 대략적인 마취 시간인 45분 동안 관찰해야 합니다. 절차가 완료되기 전에 마우스가 깨어나면 절차를 일시 중단하고 마우스를 교체해야 합니다.

2. 동물 포지셔닝

1. 마우스가 절전 모드로 전환되면 머리가 작업자를 향하도록 하여 작업대에 놓습니다. 긴장 없이 각 다리를 부드럽게 당기고 미세 기공 테이프로 고정하여 갑작스러운 비자발적 움직임을 방지합니다. 체온을 유지하기 위해 담요나 거즈로 마우스를 덮으십시오.
2. 주둥이를 열어 두려면 교정 고무줄의 한쪽 끝을 위쪽 앞니에 놓고 다른 쪽 끝을 장력 없이 위쪽 홀더에 고정합니다. 아래 앞니 주위에 두 번째 교정 고무줄을 놓고 고무 밴드로 아래 홀더에 고정합니다.
3. 볼 세퍼레이터를 놓고 더 잘 보이도록 혀를 한쪽으로 조심스럽게 움직입니다.
4. 가장 낮은 배율의 대물렌즈부터 시작하여 위쪽 어금니를 적절하게 시각화할 수 있도록 현미경을 배치합니다. 위치를 찾으면 배율을 조정하여 작업자가 최적의 편안함과 집중력을 얻을 수 있도록 합니다.

3. 합자 배치

1. 이미지가 선명해지면 3개의 위쪽 어금니, 즉 가장 큰 근위 어금니(M1), 다음 어금니(M2), 가장 작고 원위 어금니(M3)를 식별합니다. 6-0 나일론 봉합사는 직경이 합자 배치를 용이하게 하고 넓은 봉합사보다 조직에 기계적 손상을 덜 일으키기 때문에 배치합니다.
   1. M2의 말단부를 찾아 핀셋으로 6-0 나일론 봉합사의 끝을 잡고 팁을 구개에서 유두 바닥에 놓습니다. 치간 구개 공간의 기저부를 통해 협측 표면을 향해 가벼운 압력을 가합니다(그림 2A).
   2. 6-0 나일론 봉합사가 교차하면 치간 공간을 통해 협측 쪽으로 당깁니다(그림 2B).
2. 6-0 나일론 봉합사의 끝을 협측 측에서 M2의 근심 표면에 있는 치간 영역의 기저부에 놓습니다. 봉합사의 끝을 부드럽게 밀어 치간 공간 아래를 가로지르고 협측 공간을 통해 구개로 다시 통과시킵니다(그림 2C).
3. 6-0 나일론 봉합사를 부드럽게 당기고 핀셋으로 팁을 잡고 M2 주변으로 조정하고 세 개의 간단한 매듭으로 봉합사를 고정합니다.
4. 가는 가위로 6-0 나일론 봉합사를 자릅니다(그림 2D).

4. 동물 회복

1. 마우스를 해제하려면 뺨 분리기, 다리의 미세 기공 테이프 및 교정 고무줄을 제거하십시오. 먼저 아래 앞니 주위의 고무줄을 제거한 다음 위 앞니 주위의 고무줄을 제거합니다.
   1. 작업대에서 마우스를 제거하고 거즈나 천으로 싸서 앞면이 위로 향하게 놓습니다. 기도를 열고 막히는 것을 방지하기 위해 혀를 옆으로 유지하십시오.
2. 동물을 따뜻하게 하고 천이나 거즈로 덮고 완전히 깨어날 때까지 관찰하십시오. 그런 다음 일반 케이지에 넣으십시오.
3. 마우스가 정상적으로 깜박일 수 있을 때까지 각 눈에 하이프로멜로스 방울을 바르십시오.
4. 동물을 표준 조건에서 유지하십시오.

5. 합자 확인

1. 매주 나일론 합자의 영속성을 확인하십시오(그림 3A, B).
2. 마우스를 잡고 머리와 몸통을 단단히 잡고 핀셋을 사용하여 주둥이를 엽니다. 램프 조명 아래에서 M2 주변의 6-0 나일론 봉합사를 관찰하십시오.
3. 생물막 축적과 기계적 자극을 기반으로 한 치주 질환의 발병을 확립합니다. 조직학적 분석을 통해 이를 확인하십시오.

6. 조직학

1. 30일 후, CO₂ 챔버에서 마우스를 안락사시킵니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 이전에 보고된 대로 상악골을 수확합니다³⁹. 채취한 조직을 0.9% NaCl 용액으로 세척하고 라벨이 부착된 새 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
2. 교반과 함께 4% 파라포름알데히드 용액에 샘플을 2시간 동안 고정합니다.
3. 샘플을 수돗물로 2시간 동안 씻습니다.
4. 뼈에서 미네랄을 제거하고 고품질 파라핀 절편을 준비하기 위해 마이크로 원심분리기 튜브에서 20일 동안 4% EDTA(pH 7.3) 용액 20부피에 샘플을 석회질화하고 4일마다 EDTA를 교체합니다⁴⁰.
5. 샘플을 파라핀에 넣습니다. M2 영역의 5μm 절편을 절단하고 Hematoxylin 및 Eosin (H&E)⁴¹로 염색합니다.

7. 데이터 분석

1. 광학 현미경으로 염색된 조직학적 단면을 관찰하여 열구 상피, 치은 섬유, 치주 섬유, 높이 및 폐포 능선 무결성의 구성 변화에 대한 설명 분석을 수행합니다.
2. 시멘트 에나멜 접합부(CEJ)와 골마루의 가장 높은 지점 사이의 거리를 측정하여 부착 손실(AL)을 측정합니다. 디지털 편집 프로그램을 사용하여 이 두 점 사이에 선을 긋습니다. Semenoff et ^al.42 (그림 4)에 설명된 방법론에 따라 협측 및 구개 표면에 대한 조직 분석을 수행합니다.

8. 통계 분석

1. Mann-Whitney U 검정을 사용하여 CTL 및 PT 그룹에서 얻은 데이터를 분석합니다. p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다. 분석을 위해 통계 및 그래프 소프트웨어를 사용하십시오.

결과

이 방법론을 통해 유도된 마우스는 2주째부터 치주염(PT)이 발생할 수 있습니다. 생쥐는 결찰의 존재를 확인하기 위해 매주 모니터링되었습니다. 안락사는 30일째에 시행되었다. 모든 그룹의 임상적 특성을 평가했다. 대조군은 시간이 지남에 따라 색깔과 가장자리 치은의 구조와 같은 정상적인 특성을 유지했습니다. CTL 그룹과 비교했을 때, PT 그룹 조직은 염증, 출혈 및 치...

토론

미생물 및 면역 반응과 같은 다양한 측면을 평가하기 위해 여러 동물 치주염 동물 모델이 사용되었으며, 인간 질병과 몇 가지 유사점이 있다⁴³. 이러한 발견은 생물막의 역할, 면역 반응 및 전신 상태와의 상호 작용과 같은 치주 질환의 틀에 대한 증거를 제공합니다^44,45.

치주염의 동물 모?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl solution	PiSA		Rinse maxillae
6-0 nylon suture	Atramat, Internacional Farmacéutica	PE1946-N	Ligature placement
Amscope 3.7 program for digital camera	Amscope	x64, 4.11.21973.20230107	Data colection
EDTA solution	Sigma–Aldrich	E5134	Decalcification
Fine scissors	generic		To cut the 6-0 nylon suture
Fine tweezers	generic		6-0 nylon suture
Gauze pad	generic		To keep corporal tempature
GraphPad Prism	GraphPad Prism	Version 8.3.0	Data analysis
Hypromellose	generic		Eye lubricant
Injectable water	Pisa		Dilution of anesthetic solution
Ketamine	Anesket, Pisa		Anesthetic
Micro centrifuge tubes	Cellpro	801501	To contain tissues durin decalcification
Micropore	3M	1533	To fix mouse
Microscope digital camera	Amscope	MU1603	Histology
Microtubes	Axygen	MCT-150-C	Store anesthetic dilution
Optical microscope	UNICO	Serie G380	Histology
Orhodontic elastics	TP Orthodintics, Inc	blue	To keep the snout open
Paraformaldehyde solution	Sigma–Aldrich	158127	Tissue Fixation
Paraplast	Leica	39601006	Histology
Surgical microscope	Carl Zeiss GmbH Berlin		6-0 nylon suture
Ultra Fine Insulin Syringes 6mm U-100, 0.3 mL	BD	326385	To inject the anesthetic solution
Universal rubber bands	generic		To keep the snout open
Worktable	Generic		Wooden base to support mice
Xylazine	Porcin, Pisa		Preanesthetic