מיקרו-ייצור של אופטיקה מושתלת משולבת בחלון הדמיה מיקרו-מובנה להדמיה מתקדמת in vivo

Summary

פרוטוקול זה מתאר ייצור של חלון הדמיה משולב מושתל באמצעות הדפסת לייזר תלת מימדית. החלון מורכב ממערכת של מיקרו-עדשות יחד עם מיקרו-פיגומים. השיטה כוללת פילמור דו-פוטוני (2PP) של הפוטו-רזיסט SZ2080 התואם ביולוגית ברצף רציף, תוך אופטימיזציה של יעילות הייצור והיישור בין הרכיבים השונים.

Abstract

בהקשר של ביו-חומרים ובדיקות תרופות במודלים של בעלי חיים, מחקר זה מציג פרוטוקול יעיל לייצור חלון הדמיה משולב מושתל חדש. המיקרו-מכשיר כולל מערכת מתוחכמת של מיקרו-עדשות יחד עם מיקרו-פיגומים שתוכננו במיוחד לכימות in vivo של התגובה החיסונית באמצעות מיקרוסקופ עירור לא ליניארי מתקדם. הפרוטוקול מבוסס על פילמור דו-פוטוני (2PP) של הפוטו-רזיסט SZ2080 התואם ביולוגית, המאפשר ייצור של מיקרו-פיגומים ומיקרו-עדשות ברצף רציף כדי לשפר את יעילות הייצור והדיוק. כדי לשפר עוד יותר את המהירות, הדיוק והשלמות המבנית, יושמה גישת ייצור אופטיקה היברידית, הכוללת את ה-2PP של המעטפת החיצונית של המיקרו-עדשה ואחריה קישור צולב בתפזורת UV של הליבה הפנימית. טכניקה חדשנית זו מייעלת את התכונות האופטיות של המיקרו-עדשות תוך ייעול תהליך הייצור. המיקרו-התקן המתקבל מדגים יכולת שחזור גבוהה ויציבות מכנית, מה שהופך אותו לשיטה יעילה ליצירת אב טיפוס של מערכות אופטיות בקנה מידה מיקרו עבור מגוון יישומים ביו-רפואיים.

Introduction

מיקרוסקופיה תוך-חיונית מעצימה את חקר התהליכים הביולוגיים בבעלי חיים על ידי הדמיה בזמן אמת. בשילוב עם גישות הדמיה פלואורסצנטיות לא ליניאריות, הוא יכול אפילו להגיע לרזולוציה בקנה מידה תת-תאי¹. כתוצאה מכך, הוא הפך לכלי חשוב בתחומים רבים, כגון בדיקות אימונולוגיה או חקר סרטן, שבהם חשובה התבוננות בתאים בתוך סביבתם הפיזיולוגית האמיתית.

גישות נפוצות לבדיקות תוך-חיוניות, כגון תאי קפלי עור גביים או חלונות הדמיה גולגולתיים ובטניים, הן פולשניות ביותר ומהוות קשיים לבדיקות ממושכות של אותה נקודה. לפיכך, גישות הדמיה חדשות in vivo המפחיתות את מצוקת בעלי החיים ומאפשרות מיקום מחדש קל של המבט האופטי רצויות^{מאוד 2}.

במסגרת זו ניתן לקדם חלון הדמיה ממוזער חדשני המבוסס על מצע זכוכית המכיל צד הדמיה עם מיקרו-עדשות אופטיות וצד ייחוס רקמות עם מיקרו-פיגומים תלת מימדיים (תלת מימד). חלון הדמיה ממוזער זה יכול להיות מושתל "תת-חמוד" בבעל החיים ויתפקד כמטרה "פנימית" במיקרוסקופ. עקרון העבודה של המכשיר יהיה להשתמש במיקרו-עדשות יחד עם מטרת מיקרוסקופ חיצוני בעל צמצם מספרי נמוך (NA) כדי לבצע הדמיה לא ליניארית in vivo של התהליכים הביולוגיים המתרחשים בתוך הפיגומים. המיקרו-עדשות יפצו על סטייה כדורית עקב הדמיה דרך מדיה לא הומוגנית כרקמה ^3,4, בעוד שהמיקרו-פיגום יניע את התחדשות הרקמות ויפעל כמשואות אופטיות ^5,6,7, ובכך יאפשר בדיקה ארוכת טווח של אותה נקודה.

הרכיבים הבסיסיים של המכשיר, כלומר מיקרו-פיגומים ומיקרו-עדשות, כבר הודגמו בנפרד, אך שילובם באותו מכשיר מציב מספר אתגרים בשל אופיים התלת-ממדי, גודל המיקרומטר שלהם והצורך ביישור אופטי מושלם ביניהם. הפיגומים המיקרו-פיגומים, המורכבים מרשתות קוביות מלבניות, עם מידות כוללות מייצגות ~ 500 מיקרומטר x 500 מיקרומטר x 100 מיקרומטר ועם גדלי נקבוביות ~ 50 מיקרומטר x 50 מיקרומטר x 20 מיקרומטר, יכולים להנחות גיוס תאים וכלי דם חדשים, ובכך לקדם שילוב רקמות. יתר על כן, בשל האוטופלואורסצנטיות שלהם, פיגומי המיקרו מתפקדים כמשואת פלואורסצנטיות באתרם ובכך מאפשרים מיקום מחדש מהיר ויישור מתחת למיקרוסקופ ואף תיקון של סטיות כדוריות במהלך הדמיה לא ליניארית כדי לאפשר תצפיות אורכיות ברזולוציה גבוהה⁵. המיקרו-עדשות בעלות צמצם מספרי גבוה, עם פרופילים כדוריים או מעין-פרבוליים ואורכי מוקד של כמה מאות מיקרומטרים, הדגימו את יכולותיהן להדמיה ליניארית ולא ליניארית של דגימות ביולוגיות בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי או דו-פוטוני ^3,4.

המיקרו-עדשות והמיקרו-פיגומים מיוצרים על ידי כיתוב לייזר תלת מימדי, הידוע גם בשם פילמור דו-פוטוני (2PP). ב-2PP, קרן לייזר פמטו-שנייה אינפרא אדום ממוקדת היטב בתוך פוטו-רזיסט הניתן לריפוי UV, ובשל ספיגת ריבוי פוטונים בנקודת המוקד, נוצר ווקסל מוגבל של חומר פולימרי בגודל תת-מיקרומטרי (~100 ננומטר). על ידי הזזת מיקוד הלייזר ביחס לדגימת הפוטו-רזיסט, ניתן להשיג מבנים תלת מימדיים של חומר פולימרי לאחר שטיפת החומר הלא פולימרי⁸. לתהליך יש רזולוציה גבוהה מהותית ואופי תלת מימד המאפשר רכישה של מיקרו-מבנים תלת מימדיים, כמו פיגומים ועדשות, עם יציבות טובה ואיכות משטח גבוהה ^9,10,11. ישנן טכניקות שונות לייצור פיגומי מיקרו נקבוביים כמו הדפסת תלת מימד, ננו-הטבעה או אלקטרו-ספינינג 12,13,14,15. כל הטכניקות הללו סובלות מחסרון עיקרי; הם אינם מסוגלים להגיע לרזולוציות בתחום התת-מיקרומטר, ובכך נותנים מבנים בגודל נקבוביות (~100 מיקרומטר) גדולים מגודל התא, ואינם מחקים מטריצה חוץ-תאית, החיונית להתחדשות רקמות טובה. ניתן לגשת לייצור מיקרו-עדשות בשיטות המבוססות על שכפול העדשה מתבנית או מסכה כמו הזרקה, הבלטה חמה או יציקת UV, או בשיטות ישירות כמו זרימה תרמית, הבלטת מיקרופלסטיק או הזרקת מיקרו-טיפות ^16,17. כולם מציגים מגבלות על מורפולוגיה של פני השטח שניתן להשיג וקשה לשלב אותם בזרימת ייצור שבה יש לייצר גם את הפיגומים הזעירים. מצד שני, 2PP הוכיחה את הרבגוניות שלה לייצור רכיבים אופטיים מורכבים^18,19, כמו עדשות כדוריות או פרבוליות, עדשות עקיפה, או אפילו שילובים של עדשות שונות באותו רכיב אופטי 20,21,22,23,24. במסגרת זו, נראה כי 2PP היא הטכניקה הטובה ביותר לייצור שלם המכיל גם עדשות וגם מיקרו-פיגומים.

למרות היותה בחירה ייחודית למימוש מבנים תלת מימדיים אלה ברזולוציית מיקרומטר, 2PP מציגה שתי מגבלות עיקריות, כלומר, זוהי גישה גוזלת זמן עבור מבנים בנפח גדול יחסית, והיא מציגה עומק ייצור מוגבל (לאורך הציר האופטי) בשל מרחק העבודה הקצר של מטרות המיקרוסקופ המשמשות למיקוד הדוק.

מאמר זה מציע פרוטוקול ייחודי לייצור הפיגומים המיקרו-פיגומים והמיקרו-עדשות בצדדים הנגדיים של מצע זכוכית בתהליך הקרנה של שלב אורך אחד המבטיח יישור טוב של שני האלמנטים ומתגבר על מגבלות עומק הייצור. הפרוטוקול מותאם גם לזמן הייצור; מצד אחד, ההקרנה החד-שלבית חוסכת זמן יישור, והשימוש בגישה היברידית המשלבת 2PP של מעטפת העדשה וריפוי UV של הפוטו-רזיסטים הפנימיים מפחית את זמן ההקרנה עבור עדשות בנפח גבוה²⁵. היכולת של 2PP לייצר מבנים תלת מימדיים בצורה חופשית מאפשרת שימוש בפרוטוקול זה עבור כל עיצוב מיקרו-עדשות ומיקרו-פיגומים, ובכך מעצימה את השיטה הנוכחית.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מדגם

1. הטלת טיפה ראשונה (איור 1A)
   1. נקה עם אצטון על שני המשטחים של כיסוי זכוכית עגול בקוטר 12 מ"מ (עובי 170 מיקרומטר).
   2. יבש את שני המשטחים עם גז חנקן בטמפרטורת החדר.
   3. הפקידו כמות מבוקרת של 46 מיקרוליטר של פוטו-רזיסט נוזלי בצד אחד של כיסוי הזכוכית באמצעות פיפטת נפח.
      הערה: החומר הרגיש לאור המשמש בפרוטוקול זה הוא פוטו-רזיסט אורגני/אנאורגני היברידי תואם ביולוגית המכונה SZ2080, הידוע ומאומת ליישומים ביו-רפואיים²⁶. שימו לב להשאיר טבעת חיצונית חופשית על מצע הזכוכית. בהיותו נקי מהתנגדות לאור, חלל זכוכית זה מבטיח אחיזה נכונה של הדגימה בתוך התמיכה כדי לסייע טוב יותר בהכנה.
   4. השאירו את הדגימה מתחת למכסה המנוע הכימי למשך 48 שעות כדי לאפשר ייבוש של הטיפה הראשונה של פוטו-רזיסט על ידי אידוי הממס, ולהגיע למצב סול-ג'ל.
2. הטלת טיפה שנייה (איור 1A)
   1. כאשר הטיפה הראשונה של פוטו-רזיסט מגיעה למצב סול-ג'ל (שלב 1.1.4.), הפוך את הדגימה הפוכה וחשוף את המשטח הנקי.
   2. הנח את הדגימה על מחזיק תומך, והרם את המשטח היצוק הראשון מהקרקע.
   3. הפקידו טיפה שנייה של 46 מיקרוליטר של פוטו-רזיסט נוזלי על משטח הזכוכית הנקי, והשאירו את הטבעת החיצונית כמו גם בשלב 1.1.3.
   4. השאירו את הדגימה מתחת למכסה המנוע הכימי למשך 48 שעות לפחות, ותנו לממס להתאדות.
      הערה: לאחר 4-6 ימים, הדגימה הכפולה מוכנה לשימוש עבור 2PP (איור 1B). מעתה ואילך, שימו לב לא לחשוף את הדגימה לאור הסביבה בגלל החומר הרגיש לאור. חשיפה לאור פוגעת בפוטו-רזיסט.

2. פילמור דו-פוטוני (2PP) של המיקרו-מבנים

1. יישור התקנה (איור 2)
   1. הפעל את מקור הלייזר הקרוב לאינפרא אדום פמטו-שנייה (אורך גל של 1030 ננומטר, 1 מגה-הרץ, עם משך דופק מינימלי = 230 fs).
      הערה: הגדר פרמטרי לייזר כמו רוחב הדופק וקצב החזרה.
   2. יישר את הנתיב האופטי של קרן הלייזר עד שהיא מגיעה למטרת המיקרוסקופ באמצעות סדרה של אופטיקה ומראות המותקנות על תושבות מראה קינמטיות. סובב את המראות באופן איטרטיבי כדי למרכז את האלומה בתוך חורי יישור קרוב לאינפרא אדום (NIR).
      הערה: מרחק העבודה של מטרת המיקרוסקופ צריך להיות ארוך יותר מהגובה הכולל של המכשיר הסופי שייוצר (גובה העדשה + עובי הכיסוי + גובה המיקרו-פיגום). חורי NIR מתוכננים כראוי כדי לפשט את היישור של קורות IR. זה מבטיח יישור אלומה מדויק לאורך המסלול האופטי, העובר דרך רכיבים כגון לוח חצי גל, מרחיב קרן ומראה דיכרואית. כדי לשלוט אוטומטית בכוח הלייזר, הקרן עוברת דרך מקטב אופקי וצלחת חצי גל, והשנייה מותקנת על מסובב ממונע. במידת הצורך, הקורה יכולה לעבור דרך מרחיב קרן כדי להגדיל את קוטר הקורה ולמלא את הכניסה האחורית של האובייקט.
   3. כוון את קרן הלייזר בניצב למחזיק הדגימה על ידי יישורו באמצעות מרכוז השתקפות אחורית.
   4. הרכיבו את מטרת המיקרוסקופ למרחקי עבודה ארוכים על התמיכה הייעודית בקצה הנתיב האופטי קרוב לדגימה (איור 2).
      הערה: מצלמת CCD מותקנת מעל המראה הדיכרואית מיושרת לציר האופטי האובייקטיבי לניטור תהליכי ייצור. זה יאפשר לראות את נקודת מיקוד הלייזר ואת המבנים הפולימרים.
2. הרכבה לדוגמא
   1. תקן (בעזרת סרט) את כיסוי הזכוכית הכפולה על מחזיק הדגימה המותקן על שלבי התרגום. הרכיב את הדגימה כשהטיפה השנייה המופקדת פונה כלפי מטה.
      הערה: למחזיק המדגם יש חור מרכזי שבו ניתן לתלות את הדגימה מהקרקע stage⁵. המחזיק מחובר למערכת מכנית גימבל המוברגת לשלב תרגום X, Y לתנועת דגימה.
   2. מרכז את הדגימה באופן ידני עם מטרת המיקרוסקופ המותקנת.
3. מרכוז דגימה
   1. הגדר את עוצמת הלייזר בערך המינימלי המספיק כדי לראות את השתקפות הקרן בתוכנת מצלמת CCD (בסביבות 5 mW).
      הערה: מדוד את עוצמת הלייזר באישון האחורי של המטרה (העברת המטרה המשמשת בפרוטוקול זה היא 70% באורך גל של 1030 ננומטר.)
   2. הפעל את תוכנת ממשק המפעיל עבור בקר התנועה ומצלמת ה-CCD.
   3. מקד את קרן הלייזר על המשטח העליון של טיפת הפוטו-רזיסט הראשונה.
   4. בעקבות הפרופיל המעוקל של הטיפה, מצא את קצוות הדגימה לאורך כיווני X ו-Y. הגדר את מרכז הטיפה כהפניה אפס מוחלט על ידי תוכנה.
      הערה: הקלטת המשמשת לקיבוע הדגימה ממלאת תפקיד בזיהוי הקצוות על ידי שינוי מקדם השבירה, ומכאן השתקפות האלומה.
4. פיצוי הטיה לדוגמא
   1. במרכז המדגם, מקד את קרן הלייזר על משטח הממשק בין המשטח העליון של כיסוי הזכוכית לבסיס הטיפה הראשונה של פוטו-רזיסט. הגדר אותו כהפניה לאפס בציר Z.
   2. בהתחשב בקוטר הדגימה, עבור למצב הקצה (עבור הכיסוי של 12 מ"מ, הוא ~ - 4 מ"מ) בכיוון השלילי של ציר ה-X. במצב זה, מקד את משטח הממשק (בין הזכוכית לטיפה העליונה של הפוטו-רזיסט) והגדר אותו כהתייחסות אפס מוחלט לאורך הכיוון האנכי Z.
   3. עבור למצב הקצה בכיוון החיובי של ציר ה-X (עבור החלקת הכיסוי של 12 מ"מ, הוא ~ + 4 מ"מ). מצא כאן את משטח הממשק המניע את המטרה לאורך הכיוון האנכי Z.
   4. הטה את הדגימה כדי לתקן את הסטייה בכיוון Z בין המיקום השלילי לחיובי לאורך ציר X. השתמש בהרכבה קינמטית מתכווננת להטיית מחזיק הדגימה (כמו גימבל).
   5. חזור על שלבים 2.4.2-2.4.4 באופן איטרטיבי עד שהדגימה מאוזנת לחלוטין על ציר ה-X.
   6. בצע את אותו הליך המתואר בשלבים 2.4.2-2.4.5 לאורך כיוון Y.
   7. ברגע שהדגימה מאוזנת בצורה מושלמת הן על ציר X והן על ציר Y, חזור למיקום המרכזי ומקד את הממשק בין הזכוכית לפוטו-רזיסט בנקודה זו.
   8. הגדר את ערך Z החדש של המוקד כהפניה בציר Z (Z = 0).
      הערה: ההליך בשלב 2.4 נועד להבטיח את הניצב המושלם בין קרן הלייזר למשטח הכיסוי כדי להבטיח עיגון מושלם של מבני 2PP שייוצרו מאוחר יותר. מ-2.4 ואילך יש לבצע את כל ההליכים התואמים את מקדם השבירה. לכן, הוסף את אמצעי התאמת המדד של המטרה במידת הצורך.
5. מיקרו-פיגומים 2PP על ירידת הפוטו-התנגדות התחתונה
   1. הפעל מערכת תאורת LED אדומה לניטור בזמן אמת של תהליך הפילמור.
      הערה: תאורת דיודה פולטת אור אדום ממוקמת מתחת לגימבל מחזיק הדגימה המורכב (איור 2). תאורה זו תאפשר לראות את הנפח הפולימרי במהלך תהליך ה-2PP. הפוטו-רזיסט רגיש לאורכי גל קצרים יותר (אור נראה); לכן, נורית ה-LED האדומה לא הולכת להפריע לדגימה.
   2. כשהלייזר כבוי, הזז את המטרה לאורך כיוון Z מתחת לכיסוי הזכוכית כדי למצוא את משטח הממשק השני בין המשטח התחתון של הזכוכית לבסיס טיפת ההתנגדות התחתונה.
      הערה: הממשק השני יימצא בערך Z השווה בערך לעובי החלקת הכיסוי (170 מיקרומטר).
   3. הגדל את עוצמת הלייזר עד 100 mW כדי לאפשר לפילמור דו-פוטוני להתרחש בטיפה התחתונה.
   4. כוונן את מיקום המוקד (הגדלת Z) כדי למצוא את הממשק השני על ידי פילמור מבנה ייחוס פשוט.
      הערה: דוגמה למבנה ייחוס היא קו פולימרי באורך 50 מיקרומטר.
   5. הגדר את מיקום המוקד הראשון שבו הפילמור של מבנה הייחוס מתרחש כהתייחסות האפס לאורך הכיוון האנכי (ציר Z).
      הערה: ההפניה בשלב 2.5.5 מדגישה את מישור הבסיס עבור 2PP של המיקרו-פיגומים.
   6. הגדר את הספקי הפילמור (~ 100-200 mW) והריץ את קוד המכונה כתוכנית בקרה מספרית ממוחשבת (CNC) עבור התנועה הנכונה של שלבי התרגום כדי לייצר את המבנה התלת-ממדי הרצוי (איור 3A).
      הערה: תוכנית ה-CNC מורכבת מקבוצה של קואורדינטות מרחביות (x, y, z) הקובעות לאיזה כיוון נעות פלטפורמות התרגום כדי לייצר את האובייקט התלת-ממדי הסופי. כוחות פילמור אלו יושפעו מגובה הטיפה העליונה ומתנאי הניסוי הספציפיים (פוטו-רזיסט, לייזר ומערכת תנועה).
6. מיקרו-עדשות 2PP על טיפת הפוטו-התנגדות העליונה
   1. נעים לאורך ציר Z, חזור לממשק הראשון בין משטח הזכוכית העליון לטיפה העליונה של הפוטו-רזיסט (שלב 2.4.8). שמור על אותה מערכת ייחוס מישורית (קואורדינטת X, Y) כדי להבטיח יישור מושלם של המיקרו-עדשות 2PP עם המיקרו-מבנים שכבר מפוברקים.
   2. מצא את הממשק על ידי פילמור מבנה ייחוס פשוט.
      הערה: השתמש באותו תהליך המתואר בשלב 2.5.4, אך שונה רק בכיוון התנועה האנכית.
   3. הגדר את קו הפילמור הראשון כהתייחסות אפס לאורך הכיוון האנכי (ציר Z).
      הערה: ההפניה בשלב 2.6.3 מדגישה את מישור הקרקע עבור 2PP של המיקרו-עדשות.
   4. הגדר את פרמטרי הייצור עבור 2PP של קווי המתאר של המיקרו-עדשה הרצויה (איור 3B). קרן הלייזר מתארת מסלול מעגלי היורד ברדיוס כדי לפלמר באופן רציף את המשטח החיצוני של מיקרו-עדשה בודדת. הגדר את פרמטרי הבקיעה והחיתוך לאורך כיווני X ו- Z, בהתאמה.
      הערה: עיצוב העדשות צריך לקחת בחשבון את אורך המוקד האפקטיבי הרצוי על ידי המשתמש. ככלל אצבע, זה צריך להיות ערך ארוך יותר מעובי הכיסוי, והוא אמור לאפשר לצלם את כל האטלס. מומלצת סימולציה חישובית ראשונית של המערכת האופטית הסופית.
   5. הגדר את כוח הפילמור (~ 15-20 mW) והפעל את התוכנית המנחה את תנועת שלבי התרגום.
      הערה: עוצמות פילמור אלו יושפעו מגובה הטיפה העליונה, תנאי הניסוי הספציפיים ועיצוב המיקרו-עדשה הרצויה (איור 3B). איור 4 מציג דוגמה מייצגת של מיקרו-עדשה פרבולית עם הפונקציה הפרמטרית המתארת את פרופיל המיקרו-עדשה ואת המאפיינים הגיאומטריים העיקריים שלו.

3. פיתוח מדגם

1. הסר את הדגימה ממערך הייצור הניסיוני.
   1. כשהלייזר כבוי, השבת את ציר התרגום X, Y ו-Z והסר את המחזיק.
   2. קלף את הסרט הדביק ונתק את הדגימה מהמחזיק.
      הערה: לפני פיתוח הדגימה, שימו לב שלא לחשוף את הדגימה לאור הסביבה עקב החומר הרגיש לאור. חשיפה לאור תצליב את כל כמות הפוטו-רזיסט.
2. פיתוח מדגם (איור 5A)
   1. הנח את הדגימה בתמיכה מתאימה כדי להרים אותה מהקרקע ולהחזיק אותה במצב אופקי.
      הערה: מחזיק מדגם זה הוא מתלה לדוגמה מותאם אישית המודפס ב-SLA שתוכנן כראוי כדי לחשוף את שני משטחי האב-טיפוס של 2PP לפתרון המתפתח⁵.
   2. הכן של 50 מ"ל והנח בתוכה את התמיכה הנושאת את הדגימה.
      הערה: שימו לב לשמירה על המיקרו-עדשות 2PP על המשטח העליון כדי למנוע כל עיוות מבני במהלך ההתפתחות עקב הליבה הפנימית הלא מפולימרת שלהן.
   3. מלאו את הכוס ב~20 מ"ל של תמיסה מתפתחת, המכסה לחלוטין את הדגימה. התמיסה מיוצרת על ידי תמיסת אלכוהול איזופרופיל של 50% (v/v) 2-pentanone ו-50% (v/v).
   4. השאירו את הדגימה בתוך התמיסה המתפתחת למשך 45 דקות.
3. כביסה לדוגמא
   1. הסר את התמיכה מהפתרון המתפתח.
   2. על ידי טיפול ידני או באמצעות זוג פינצטה, קח את הדגימה ושטוף אותה בזהירות עם כמה טיפות אלכוהול איזופרופיל.
   3. יבש את שני המשטחים המפוברקים של כיסוי הזכוכית בזרימה עדינה של חנקן (בטמפרטורת החדר).
      הערה: כל ההליכים המתוארים בשלבים 3.2-3.3 מבוצעים מתחת למכסה אדים כימי.

4. מדגם קרינת UV

1. חשיפה של מיקרו-עדשות לקרינת UV (אורך גל של 385 ננומטר) (איור 5B)
   1. הנח את כיסוי הזכוכית על מחזיק דגימה התלוי ממישור הקרקע. הנח את הדגימה כשהמיקרו-עדשות פונות כלפי מטה.
      הערה: למחזיק המדגם יש חור מרכזי להצבת הדגימה התלויה מהקרקע stage, תוך שמירה על שלמות המיקרו-מבנה על המשטח התחתון.
   2. הכן מנורת UV באורך גל של 385 ננומטר.
   3. מקם את הדגימה מתחת למקור ה-UV בניצב ביחס למשטח כיסוי הזכוכית.
   4. חשוף את הדגימה לקרינת UV המוגדרת על 300 mW למשך 120 שניות.
      הערה: החשיפה ל-UV מתרחשת דרך המיקרו-פיגום ומצע הזכוכית. באופן זה, הליבה שעדיין לא פולימרה של העדשות תהיה צולבת UV, תוך הימנעות מחשיפה ישירה ונוספת למשטח הפולימרי בעבר.
   5. כותרת מקור ה-UV ב-45° ו-+45° ביחס למיקום הרגיל של מישור הדגימה, חזור על שלב 4.1.4.
      הערה: חשיפת UV תלת-שלבית זו בזוויות שונות תאפשר קישור מלא של כל ההתנגדות הלא פולימרית בתוך נפח המיקרו-עדשות, ותשיג יציבות. זה חשוב במיוחד עבור מיקרו-עדשות רחבות.
   6. הסר את הדגימה מהמחזיק ואחסן אותה.

5. אפיון מורפולוגי

1. רכישות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) (איור 6)
   1. הכן את תחנת ה- SEM. חבר חתיכת סרט פחמן למחזיק ה- SEM לצורך הדבקה במדגם.
   2. הנח את דגימת הזכוכית על המחזיק ב-45° ביחס לכיוון מצלמת ה-SEM. שימו לב לחיבור הדגימה בחלל ריק על משטח הכיסוי כדי לשמור על שלמות המבנה (איור 6B).
   3. חזור על הרכישה כמו בשלב 5.1.2 עבור שני המשטחים של כיסוי הזכוכית כדי לאסוף תמונות SEM תלת מימדיות של המיקרו-פיגומים והמיקרו-עדשות (איור 6A,C).
   4. נתק בזהירות את הדגימה מסרט הפחמן ואחסן אותה בקופסה מכוסה.

תוצאות

סופק פרוטוקול לייצור מכשיר מיקרו-מבנה מושתל דו צדדי המכיל מערכת אופטית והפניה לניתוח רקמות. התהליך מנצל פילמור לייזר דו-פוטוני כדי לייצר מיקרו-מבנים תלת מימדיים ומיקרו-אופטיקה בצד הנגדי של אותו מצע. השימוש במטרה למרחק עבודה ארוך מאפשר ייצור של שני המבנים מבלי להפוך את המצע, חוסך את שלב היישור מחדש ומצדיק יישור מושלם בין שני הרכיבים. מכשיר זה יעצים הדמיה מתקדמת באתרה על ידי מתן אפשרות לתיקון סטיות אופטיות ותצפיות חוזרות ונשנות באותו אזור, הודות למיקרו-אופטיקה ומסגרת ייחוס מיקרו-מפוברקת. איור 1 מציג את הנוהל להכנת שני המשטחים של המצע התומך לייצור שלאחר מכן. סקיצה של מערך הניסוי המשמש לייצור מיקרו של שני משטחי הדגימה מיוצגת באיור 2. התמונה מציגה גם את מחזיק מדגם המטרה המורכב, כאשר הראשון מתמקד במדגם המואר על ידי מערכת תאורת LED אדומה, המאפשרת ניטור בזמן אמת של הייצור באמצעות ראיית מכונה. איור 3 מדגים באופן איכותי את הגמישות של הפרוטוקול במתן אפשרות למיקרו-ייצור של עיצובים שונים של מיקרו-פיגומים ומיקרו-עדשות. איור 4 מדגיש את פונקציית השקיעה המשמשת לתכנון מיקרו-עדשות עם פרופיל פרבולי אספרי ושרטוט של תכן מייצג בקורלציה לתכונות העיקריות שלו כדוגמה. באיור 5 מדווחים על שלבי פיתוח הדגימה וחשיפה ל-UV הדרושים כדי להצליב את כל נפח המיקרו-עדשות במלואו. לבסוף, איור 6 מציג דוגמאות לתוצאות מיקרו-ייצור. ההליך המוצג מאפשר פילמור של מיקרו-מבנים תלת מימדיים של שני המשטחים של אותו מכשיר, מה שמבטיח רזולוציה ויציבות מצוינים. לבסוף, איור 7 הוא איור המייצג את זרימת העבודה הכללית של הפרוטוקול, ומסתיים באיור 8, המציג דוגמה ליישום סופי של המכשיר המוצע, כלומר, הדמיה חוץ גופית של תאים הגדלים בתוך הפיגום הקטן.

איור 1: פרוטוקול להכנת דגימה. תמונה זו מציגה סקיצה של התהליך הדו-שלבי ליציקת דרופ-התנגדות על כיסוי זכוכית עגול תומך (A). מימין מדווחת תמונה של הדגימה עם הפוטו-רזיסט המיובש שהופקד משני הצדדים (B). המדגם נתמך על ידי בעל המדגם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מערך ייצור פילמור לייזר דו-פוטוני (2PP). בצד ימין מדווח תרשים מייצג של מערך הייצור. המרכיבים העיקריים של ההתקנה הם מקור לייזר פמטו-שנייה באורך גל של 1030 ננומטר, רוחב פולס מינימלי של 230 fs וקצב חזרה של 1 מגה-הרץ), במה לבקרת כוח, מרחיב אלומה, מראה דיכרואית ומיקרוסקופ צמצם מספרי גבוה (100x, NA 1.1). מצלמת CCD מותקנת מעל המראה הדיכרואית מיושרת לציר האופטי האובייקטיבי לניטור תהליכי ייצור. משמאל, יש פיצוץ, כאשר הזום של החלק האחרון של המערך האופטי מציג תמונה של מערכת תאורת ה-LED המורכבת לראיית מכונה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תכנים מרובים של מיקרו-מבנים ומיקרו-עדשות תלת-ממדיים. האיור מציג דוגמאות שונות של (A) מיקרו-פיגומים ו-(B) מיקרו-עדשות שניתן לייצר באמצעות ההליך המוצע. הגמישות הגבוהה של הפרוטוקול מאפשרת ייצור של מיקרו-מבנים עם מגוון תכונות גיאומטריות, רזולוציה, מידות ונפח, המדגימים את הרבגוניות שלו. הסולם האפור בפאנל (B) נועד להדגיש את הירידה בעוצמת הלייזר ובמהירות הכתיבה כדי להחליק את פני השטח ולמזער את חספוס פני השטח. פרמטרים מדויקים של ייצור נקבעים בהתאם לעיצוב הספציפי של המיקרו-עדשה. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: דוגמה למיקרו-עדשות מפוברקות. הפאנל מציג דוגמה מייצגת של פרופיל פרבולי אספרי המדגיש את התיאור הפרמטרי של המשטח המעוקל של העדשה כפונקציית שקיעה z(r) (A). כאן, H_tot הוא עובי העדשה, r הוא הקואורדינטה הרדיאלית, ו-f_n הוא אורך המוקד של עדשת שבירה פרבולית השונה מאורך המוקד האפקטיבי שלה. הכוח הדיופטרי נקבע על ידי מקדם השבירה של העדשה וכיצד הוא שונה מאלה של המדיום שמסביב. מימין, שרטוט העיצוב מדגיש את שני המישורים העיקריים השוכנים בקודקוד V1 וכמה מיקרומטר מעל פני 2 (Π1 ו-Π2, קווים מקווקוים) (B). השרטוט מציג מיקרו-עדשה פרבולית אספרית אחת בקוטר 600 מיקרומטר ומיוצרת על מצע זכוכית N-BK7 (בעובי של 170 מיקרומטר). (C) מדגיש את הפרמטרים הגיאומטריים עבור העדשה הפרבולית האספרית שעברה מיקרו-ייצור ב-SZ2080 photoresist. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: פרוטוקולים לפיתוח דגימות וחשיפה לקרינת UV. התמונה מדגישה את הדגימה המפוברקת הספוגה בפתרון הפיתוח כסקיצה (A). הדגימה מורמת בתוך התמיסה על ידי המחזיק, ומאפשרת התפתחות תקינה של שני צידי הדגימה וקבלת המכשיר המיקרו-מובנה הדו-צדדי. בצד ימין, מדווחת תמונה של תצורת ההתקנה לקרינת UV של הדגימה (B). התמונה מציגה את מנורת ה-UV הממוקמת בניצב לפני השטח של הדגימה. כפי שצוין בגיליון הנתונים של מנורת ה-UV, המרחק הנוכחי בין המנורה לדגימה תואם את מרחק הפעולה של המנורה. הדגימה העוברת קרינת UV ומטופלת על ידי מחזיק הדגימה מודגשת בתמונת הזום מימין. סרגל קנה מידה: 12 ס"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: רכישות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של תוצאות מייצגות של ייצור. הפאנל מדגיש מכשיר מפוברק דו צדדי דרך מבט רוחבי (B) ושתי תוצאות מייצגות של מיקרו-עדשה מפוברקת (A) ומיקרו-פיגום (C) על ידי תמונות SEM. שני המבנים המונחים על פנים שונות של אותו מצע זכוכית נראים בבירור בתמונה המרכזית (B). המיקרו-עדשות מיוצגות על המשטח התחתון של הזכוכית, ואילו המיקרו-פיגומים נמצאים על החלק העליון. תמונת ה-SEM של מיקרו-עדשה מפוברקת עם עיצוב כדורי מוצגת מימין כדוגמה לתוצאה היציבה והחלקה של ייצור (A). משמאל, התמונה מדגישה תוצאה מייצגת של מיקרו-פיגום נקבובי 2PP עם גיאומטריה שרירותית (C). פסי קנה מידה: (A,C) - 50 מיקרומטר; (B) - 1 ס"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

איור 7: דיאגרמה סכמטית של זרימת העבודה של הפרוטוקול ויישום ההתקן: האיור מציג את תהליך הייצור הכולל ששורטט צעד אחר צעד. זה מתחיל בהכנת הדגימה על ידי יציקת הפוטו-התנגדות הרציפה על שני משטחי מצע הזכוכית (1). ברגע שהפוטו-רזיסט מגיע למצב סול-ג'ל, הדגימה מוכנה לייצור על ידי פילמור לייזר דו-פוטוני (2). לכן, שתי טיפות הפוטו-רזיסט מוקרנות ברצף, תוך מיקרו-מבנה תחילה של המיקרו-מבנים ולאחר מכן המיקרו-עדשות. לאחר מכן, המצע המיקרו-מיוצר הדו-צדדי עובר הליך פיתוח להסרת כל ההתנגדות הלא פולימרית המקיפה את המבנים (3). לשם כך, הדגימה ספוגה בתמיסה אלכוהולית ולאחר מכן מיובשת בעדינות. עוקב אחר הקרנת ה-UV של הדגימה על ידי מעבר דרך המצע הזכוכיתי כדי להצליב לחלוטין את הליבה הפנימית הלא פולימרית של המיקרו-עדשות (4). לבסוף, בדיקת איכות של הדגימה המיקרו-מפוברקת מתבצעת על ידי רכישות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לאפיין מורפולוגית את המיקרו-מבנים (5). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: יישום פוטנציאלי של חלון ההדמיה המיקרו-מבנית. משמאל, סקיצה מייצגת ממחישה את המערכת האופטית המורכבת על ידי המכשיר יחד עם אובייקט מיקרוסקופ חיצוני במערכת סריקה סטנדרטית (A). זוהי מה שנקרא תצורה וירטואלית המשמשת במקרה זה להדמיה של צמיחת תאים חיים בתוך הפיגום הקטן. פיברובלסטים פלואורסצנטיים (חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) נזרעו על משטח הזכוכית של המכשיר, הנושא את המיקרו-מבנים התלת מימדיים. תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות של תאים צולמו במישור המוקד של כיסוי הזכוכית (B, האשטאג ירוק), ולכן עם השימוש היחיד במטרה החיצונית, ודרך מיקרו-עדשה בודדת במישור המוקד שלה (A, האשטאג סגול). גרעיני התא נראים בכחול (צביעת הוכסט), ושלד התא באדום (RFP). פסי קנה מידה: (B) - 100 מיקרומטר; (C) - 50 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

כדי להבטיח הדמיה מדויקת של האזור הרצוי ^3,6 בחלון המיקרו-מובנה, חובה לבצע יישור מדויק של שני המבנים (מיקרו-פיגום ומיקרו-עדשות). זה מציב את האתגר העיקרי של הפרוטוקול המוצע שכן הרזולוציה הגבוהה של 2PP קשורה קשר הדוק למגבלה בעומק הייצור ^3,6. היפוך הדגימה במהלך הייצור כדי לחשוף ברצף את שני המשטחים לקרן הלייזר עשויה להיות אופציה, אך היא מסבכת את היישור מחדש וגוזלת זמן⁵. זה גם יגרום לקשיים במציאת אותה מערכת ייחוס ובכך יפגע ביישור הטוב בין רכיבים מיקרו-אופטיים למיקרו-פיגומים. ביצוע התהליך כולו ברציפות ללא פירוק הדגימה שומר על מערכת ייחוס עקבית, ובכך מקל ומבטיח יישור מדויק של המבנים. לשם כך אנו משתמשים ביעד למרחקי עבודה ארוכים (2.5 מ"מ) השומר על רזולוציה טובה הודות לצמצם המספרי הגבוה שלו (שלב 1.1). גישה זו גם מפחיתה משמעותית את זמן הייצור מכיוון שהיא חוסכת את יישור המדגם לאחר היפוכה³. בנוסף, הטיפול בדגימות מציב אתגר נוסף בשל גודלן הקטן ושבריריותן, מה שהופך את המניפולציה והיישור המדויק לקריטיים עוד יותר.

בתהליכי 2PP, חקירה רחבה של תהליך הייצור חיונית לקביעת פרמטרים מרכזיים כגון אורך גל הלייזר האופטימלי, רוחב הדופק וכן עוצמות לייזר ותנועות שלב ^9,10,11. לכן, בוצע אפיון מקיף של תהליך ה-2PP, אפילו בהתחשב בתצורות שונות של מערך הניסוי כדי להבטיח תחילה מבנים תלת מימדיים יציבים ביותר ברזולוציה גבוהה עם פירוט בקנה מידה סלולרי ליישומים ביולוגיים. בנוסף, מזעור חספוס פני השטח של המיקרו-עדשות המושתלות היה חיוני להשגת מיקרו-אופטיקה איכותית עם התכונות האופטיות הרצויות, ובכך להפחית את התגובה האימונולוגית לשתל 19,22,31. לכן, האתגר של התהליך טמון בהתאמת פרמטרים כמו הספק ורוחב פולסים בהתבסס על גורמים ניסיוניים כגון מקדם השבירה והנפח של החומר הרגיש לאור, תנאי הסביבה (למשל, לחות וטמפרטורה) ויעילות הלייזר. נדרש גם אפיון נרחב לזמן ועוצמת החשיפה ל-UV כדי להצליב באופן מלא את כל נפח המיקרו-עדשות, מה שמבטיח את יציבותן. הגדרות אלה חייבות להיות מותאמות למקור ה-UV, למרחק הפעולה ולנפח הספציפי של האלמנט לפולימר UV.

מגבלה עיקרית של תהליך 2PP היא התפוקה הנמוכה שלו בשל הרזולוציה הגבוהה במיוחד שהוא מציע. בהתחשב בכך, תכונות פולימריות הן קטנות מאוד, ממאות ננומטר ועד כמה מיקרומטרים ^9,26. לכן, זמני הייצור גדלים משמעותית בעת ייצור מבנים בקנה מידה של מאות מיקרומטרים, שהם גדולים יחסית בסטנדרטים של 2PP, במיוחד אם מבנים מגושמים. כתוצאה מכך, יצירת מכשירים משולבים עם מבנים מרובים בממדים כה גדולים יכולה להימשך מספר שעות. במסגרת זו, פרוטוקול ה-UV-2PP ההיברידי המוצע לייצור מיקרו-עדשות שיפר הפחתה של 98% בזמן הייצור של מיקרו-עדשה בודדת בהשוואה ל-2PP של כל נפחה. זה איפשר דיוק מוגבר בסריקת 2PP של המעטפת החיצונית של המיקרו-עדשה, והפחית את חספוס פני השטח תוך קבלת מעטפת מיקרו-עדשה עבה מספיק כדי להבטיח יציבות עדשה, והכל תוך זמן ייצור נסבל. כדי להאיץ עוד יותר את התהליך, תוצע בעתיד גישת הקבלה שתאפשר כתיבה בו זמנית של מבנים מרובים³². אסטרטגיה זו תכלול פיצול קרן הלייזר למספר אלומות כדי ליצור מספר מוקדים, מה שיאפשר ייצור מקביל ובכך יקטין מאוד את זמן הייצור הכולל.

בניגוד לטכניקות הליתוגרפיה הרכות הנפוצות ביותר, אחד היתרונות המרכזיים של ה-2PP הוא שמדובר בגישת ייצור תוספים ללא מסכה המאפשרת ייצור מבנים שרירותיים בתוך נפח של חומר רגיש לאור¹¹. יכולת זו מאפשרת ייצור של מבנים תלת מימדיים ונקבוביים מורכבים בעלי פוטנציאל התאמה אישית גבוה. יתרה מכך, בהתבסס על העיקרון של ספיגה לא ליניארית, ה-2PP מאפשר להגיע לרזולוציה מתחת לגבול העקיפה, דבר שאינו ניתן להשגה על ידי טכניקות הדפסת תלת מימד סטנדרטיות או מידול תצהיר התמזגות (FDM) כדוגמה³³. זה חשוב במיוחד ליצירת פיגומים תלת מימדיים נקבוביים עם תכונות בקנה מידה סלולרי לתמיכה בצמיחה תאית, גיוס ושילוב רקמות.

לייצור מכשירים מושתלים מיקרו-מובנים עם אופטיקה משולבת על ידי התהליך המוצע כאן יש פוטנציאל להשפיע באופן משמעותי על יישומים המשתרעים על פני מכניוביולוגיה, מודלים של מחלות מבחנה והנדסת רקמות (איור 7 ואיור 8). הפרוטוקול המוצג מאפשר ייצור של מכשיר טכני איכותי הכולל מיקרו-מבנים התומכים באינטגרציה של רקמות ובמקביל משמשים כנקודות ייחוס הדמיה in vivo. בנוסף, המיקרו-עדשות שתוכננו כהלכה שיפרו את ההדמיה הלא ליניארית המתקדמת על ידי תיקון סטיות כדוריות הנגרמות על ידי הרקמה המקיפה את השתל⁴. הרבגוניות של התהליך, למעשה, מאפשרת לנו להתאים את עיצוב המכשיר כמו, למשל, ליצור פיגומים ומבני ייחוס עם גיאומטריה המותאמת ליישומים ספציפיים, המסייעת הן בשחזורים תלת מימדיים והן בתיקון סטיות הדמיה לאחר עיבוד. לבסוף, התאמת עיצוב מיקרו-עדשות המבוסס על מדדי שבירה של רקמות משפרת את ההדמיה הספציפית ליישום, ויוצרת למעשה עדשה אופטית באתרה בתוך המכשיר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beam Expander	Thorlabs, Germany	GBE03-C	3X Achromatic Galilean Beam Expander, AR Coated: 650 - 1050 nm (GBE03-C)
Controlled Motorized Rotator	Aerotech, USA	MPS50GR	MPS50GR-TTM-G80-DC-LMO-PLOTS
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	CB00120RA1	12 mm diameter circular glass coverslip with a thickness between 170 and 230 µm (#1.5)
Development solution	Sigma Aldrich, USA.	Custom Solution	50% v/v 2-pentanone, 50% v/v isopropyl alcohol solution
Dichroic Mirror (1030 nm)	Eskma Optics, Lithuania	810-1030D	Ø1" Shortpass Dichroic Mirror, 805 nm Cutoff
Femtosecond laser	Satsuma, Amplitude	Satsuma Series	Femtosecond Ytterbium (Yb) fiber laser (λ = 1030nm, 1MHz, with minimum pulse duration = 230 fs,
Gimbal	Thorlabs, Germany	GMB100	Gimbal Mounts 100
Half wave plate	Thorlabs, Germany	AHWP05M-980	λ/2 at 690-1200 nm (AHWP05M-980)
Machine vision	Thorlabs, Germany	DCU223M/DCU223C	CCD camera  mounted behind a dichroic mirror
Microscope Objective	Nikon, Japan	MRD71100	CFI plan 100×C WI objective with a numerical aperture  1.1
Movement system	Aerotech, USA	ANT130-035-L-ZS; ANT95-50-XY	ANT130-035-L-ZS; ANT95-50-XY
NIR Alignment Pinhole	Thorlabs, Germany	VRC1D1	Ø1" Disk made from slow-fading phosphor material with a 1.5 mm hole in the center
Photoresist SZ2080	Forth, Greece	SZ2080	UV curable photoresist SZ2080+Irgacure-369 Photoiniziator
Pipette	Gilson, USA	F123615	Pipetman 100G
Scanning electron Microscope (SEM)	Phenom World, Netherlands	Phenom Pro	PHENOM PRO
Software CNC	Aerotech, USA	A3200	Automation 3200 CNC Operator Interface
UV Lamp	Hamamatsu, Japan	LC-L1V3	LIGHTNINGCURE ,LC-L1V3