טכניקת ההקלטה אמבטיה שימש לראשונה על ידי Fricke (1984) 8 ו Beall et al. (1990) 9 למדוד שדות חשמליים שנוצר במהלך זנב הטלות. הטכניקה שונה מאוחר יותר ומשופר במעבדה של ד&quot;ר דונלד אדוארדס (ג&#39;ורג&#39;יה סטייט) על ידי בוגר סטודנט שלו לשעבר ד&quot;ר פאדי עיסא א לשעבר דוקטורט שלו עמית ד&quot;ר Jens Herberholz. שיפורים נוספים נעשו ויישומים המחקר החדש נבדקו במעבדה של ד&quot;ר Jens Herberholz באוניברסיטת מרילנד. אני רוצה להודות לעמית ד&quot;ר דוד שלי Yager שנתת לי להשתמש במערכת במהירות גבוהה שלו וידאו מחקר מעוזרי דוד רוטשטיין וויליאם Liden לעזרה עם הניסויים.

חלק 1: חדר הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדר ההקלטה של ​​צורה מלבנית והוא עשוי זכוכית חומה דקה. ממדים לשכת הם 8.5 ס&quot;מ X 2 ס&quot;מ X 5 ס&quot;מ (אורך x רוחב x גובה) עבור חיות של 2.5-3.5 ס&quot;מ אורך הכולל (הנמדד מעל במה כדי telson). ראה איור. 1 למשל של החדר המשמש בניסויים שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, חדרי הקלטה יכול להיות עשוי מחומרים אחרים (למשל, רעיל פלסטיק שקוף). גודל צ&#39;יימברס עשוי להשתנות בהתאם לנוהל ותאי הניסוי צריך להיות מותאם אישית עבור כל סידרת ניסויים. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, גודל החדר צריך להיות קטן ככל האפשר ללא הגבלה החיות בהתנהגות הטבעית שלהם. ככלל אצבע, אורך ורוחב של החדר לא צריך להיות יותר משלוש פעמים את הגודל של החיה. </li></ol> חלק 2: אלקטרודות באת חוט הקרקע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוג אחד של אלקטרודות הקלטה אלקטרודה הקרקע משמשים. אלקטרודות עשויות חוטי נחושת מבודדים (26 AWG עם בידוד 0.25 מ&quot;מ). קצה אחד של אלקטרודות אמבטיה מחוברת למגבר תאיים (AM מערכות 1700, ראה להלן) ו 0.5-1.0 מ&quot;מ של בידוד הם הפשיטו את הקצוות האחרים. חוט הקרקע מחוברת לקרקע של המגבר או כל ציוד אחר מעוגנת 2-3 ס&quot;מ של בידוד הוא פשט את הקצה השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות באת חוט הקרקע מחוברים הקירות הפנימיים של חדר הקלטה עם דבק רעיל. אלקטרודות הקלטה ממוקמים מרכזי משני צידי קצר של החדר ומול זה לזה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודה קרקע ממוקם בצד אחד ארוך של בניצב ההקלטה הקאמרית של אלקטרודות הקלטה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכת מלא במים deionized. התוצאות הטובות ביותר מושגות עם עמידות גבוהה של מים (~ 18 MΩ). </li></ol> חלק 3: אלקטרודה הקלטות Bath <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יציאות מן האלקטרודות ההקלטה הם מוגבר (1000x) על ידי מגבר תאיים (AM מערכות; דגם 1700). אותות מן האלקטרודות ההקלטה מסונן באמצעות שילוב של תדר נמוך (&lt;100 הרץ) ותדירות גבוהה לחתוך-offs (&gt; 5 KHz). אותות מחובר אז לתיבת מתג לוח רכישת נתונים (מכשירים הלאומי). נתונים סרוקים נרשם, לאחסן ולנתח נתונים באמצעות תוכנה הרכישה (Photron כלי Motion). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, אות מוגבר של אלקטרודות ההקלטה ניתן דיגיטציה באמצעות אחרים אנלוגי דיגיטלי הממירים (למשל, MDS אנליטי טכנולוגיות; Digidata 1440) לפני נתונים דיגיטציה נרשם באמצעות נתונים אחרים זמינים מסחרית תוכנה הרכישה (למשל, MDS אנליטי טכנולוגיות; Axoscope). </li></ol> חלק 4: בדיקה מגרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקה מגרה עשוי פיפטה זכוכית (14 ס&quot;מ אורך) מצויד בזוג אלקטרודות חוט דק. טיפים אלקטרודה חשופים (0.2 מ&quot;מ) כדי לייצר אות אלקטרוני כאשר החיה הוא נגע החללית. זה מאפשר למדוד את הזמן המדויק של גירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יציאות החל לחקור מגרה הם מוגבר (1000x) על ידי מגבר תאיים (AM מערכות; דגם 1700). האות מסונן באמצעות שילוב של תדר נמוך (&lt;100 הרץ) ותדירות גבוהה לחתוך-offs (&gt; 5 KHz). אות מחוברת אז לתיבת מתג לוח רכישת נתונים (מכשירים הלאומי). נתונים סרוקים נרשם, לאחסן ולנתח נתונים באמצעות תוכנה הרכישה (Photron כלי Motion). </li></ol> חלק 5: הקלטות וידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצלמת וידאו במהירות גבוהה (Fastcam PCI-X 1280, Photron) ממוקם בניצב חדר הקלטה על מנת לספק מבט מהצד. רמת בהירות בתוך חדר ההקלטה חייב להיות מותאם על מנת לספק את התוצאות הטובות ביותר, למשל באמצעות הפנס אווז הצוואר או אחר מקורות אור focusable. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות גבוהה videography משולב ומסונכרן עם הקלטות אלקטרוניים באמצעות תיבת הפריצה &amp; נתונים הרכישה הלוח (National Instruments). אות Amplified מן האלקטרודות אמבטיה מחוברת תיבת הפריצה ולוח נתונים הרכישה באמצעות כבלי BNC. טריגר חיצוני יד מתחיל לעבור את הרכישה מסונכרן וידאו ונתונים. </li></ol> חלק 6: נוהל ניסיוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיה אחת מוחדר לתא ואיפשר להסתגל במשך 5 דקות. הבריחה זנב הטלות הם שהושרו על ידי אחד הברזים בעוצמה שונה על הראש או הבטן, בהתאמה. האינטנסיביות של הברזים נשלטת על ידי הנסיין. לברוח כל זנב להעיף מוקלט עם וידאו במהירות גבוהה בשיעור מסגרת של 1,000 נקודות ו / sec, ונתונים של הפוטנציאל בתחום אלקטרוניים נרשמות kHz 25. התחלה של האמבט, הקלטת וידאו היא שיזמה לעבור ידנית על תיבה ההדק. זמן הקלטה נקבעת על ידי קצב הפריימים נבחר (למשל, 1000 ו / sec = 4 שניות זמן ההקלטה הכולל). פוסט מראש ההדק הקלטה פעמים ניתן לבחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאדואר: אלקטרודה הקלטות אמבטיה צריך להיות מאומת פעם אחת על ידי שילוב של האלקטרודה הקלטות אמבטיה עם שיטות זמין הקלטות אחרות עבור כל המינים שנבדקו. ב סרטנים, זוג אלקטרודות כסף יכול להיות מושתל בניתוח סביב חוט העצב הגחון. גירויים לעורר זנב סלטות לברוח יכול להיות מיושם והקליט עקבות האלקטרונית של מושתל אלקטרודות אמבטיה ניתן להשוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבריחה זנב להעיף התנהגות פעילות עצבית מקבילה ניתן להקליט במגוון בהקשרים שונים, למשל בתגובה לאיומים חזותי, במהלך התקפות טורף, או במהלך המפגשים agonistic של סרטנים השניים. גודל הקאמרית, מצב הקלטה וכו &#39;צריך להיות בהתאם (ראה דיון). </li></ol> פרק 7: ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסגרות וידאו יחיד מנותחים באמצעות כלי תוכנה תנועה (Photron). עקבות אלקטרוניים המשמשים לזיהוי סוג של מעגלים עצביים אשר הופעל על ידי כל גירוי. נתוני וידאו לעומת הקלטות פיזיולוגיים מסונכרן כדי לקבוע את התנועה של החיה ואת המעגל העצבי הופעל. כל מעגל מופעל מייצר חתימה אלקטרונית מאפיין (ראה תוצאות נציג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתנה בין מגע בדיקה התגובה העצבית / שרירי מחושבים עבור כל ניסוי על ידי מדידת עיכוב בין התפרצות של האות בדיקה לבין הופעת האות המוקלט עם אלקטרודות אמבטיה. </li></ol> חלק 8: תוצאות נציג סדרת מהירות גבוהה מסגרות יחיד וידאו המקביל הקלטות שדה חשמלי עבור לברוח זנב להעיף בתגובה לגירוי חוש המישוש נמסר הראש או הזנב של סרטנים נער (איור 2). איור. 2A: גירוי מישוש חזק על הראש עוררו זנב להעיף נשלט על ידי מעגל ענק המדיאלי. ספייק מוקלט של נוירון ענק (כוכביות) לבין סטיה phasic גדול העוקב מאפשר אי - משמעי זיהוי זנב להעיף כמו מתווך על ידי פעילות נוירון ענק. התנועה לאחור שמוצג עקבות וידאו קובע את הזהות של המעגל העצבי מופעל (MG). איור. 2B: זנב להעיף בתיווך במעגל ענק לרוחב לאחר גירוי מישוש חזק היה מוחל על הזנב. תנועה מעלה וקדימה לראות וידאו עקבות יחד עם עקבות אלקטרוניים מסונכרן הצגת ספייק הענק סטיה גדולה, phasic הראשוני קובע את הזהות של המעגל העצבי מופעל (LG). איור. 2C: זנב להעיף בשליטת המעגלים הלא ענק. גירוי מישוש הדרגתי יותר נמסר החזה של החיה. בעוד תנועה שנתפסו על וידאו לא מאפשרת זיהוי חד משמעי של המעגל מופעל, ההקלטה אלקטרוניים חסר ספייק ענק והוא מורכב הרבה יותר קטן deflections זיהוי מעגל מופעל (Non-G). איור. 3: מדידות המתנה עבור כל שלושת סוגי לברוח זנב הטלות. הקשר בין זמן בדיקה התגובה הפיזיולוגית נמדדה במשך שבעה בעלי חיים. הענק בתיווך זנב הטלות הם עוררו משמעותית מהר יותר מאשר אי - ענק זנב הטלות. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig1.jpg" alt="" /> איור 1: דוגמה עבור חדר הקלטה השתמשו בניסויים שלנו עבור בעלי החיים של 2.5-3.5 ס&quot;מ באורכים מוחלט. האלקטרודות אמבטיה מודבקות משני צדי האולם בעוד חוט הקרקע מחוברת לצד הארוך של החדר ואת בניצב האלקטרודות אמבטיה. איור 2: מסגרות וידאו רווק נרשם הקלטות 1000 ו / sec המקביל אלקטרוניים עבור שלושה סוגים שונים של גירויים. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2A.jpg" alt="" /> א) גירוי מישוש חזק נמסרה לראש החיה עורר ענק המדיאלי (מ&quot;ג) בתיווך זנב להעיף. ששת וידאו מסגרות מוצגים בצד שמאל. עקבות הקלטה מתוך בדיקה השתמשו לגעת החיה מוצגת אפור נקודת המגע הוא הצביע על ידי ראש החץ השחור. עקבות הקלטה שהושגו עם האלקטרודות האמבט מוצגים בכחול. הבלעה מראה ענקית קטן האקסון ספייק שלפני deflections phasic גדול. ברים גריי מתאימות הווידאו במסגרות המוצג בצד שמאל. התנועה הבולטים הראשונים של הזנב של סרטנים התרחשו # 3 מסגרת, שבע אלפיות השנייה אחרי הקשר עם החללית. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2B.jpg" alt="" /> ב) גירוי מישוש חזק נמסר הזנב של החיה עורר ענק לרוחב (LG) בתיווך זנב להעיף. ששת וידאו מסגרות מוצגים בצד שמאל. עקבות הקלטה מתוך בדיקה השתמשו לגעת החיה מוצגת אפור נקודת המגע הוא הצביע על ידי ראש החץ השחור. עקבות הקלטה שהושגו עםאלקטרודות אמבטיה מוצג באדום. הבלעה מראה ענקית קטן האקסון ספייק שלפני deflections phasic גדול. ברים גריי מתאימות הווידאו במסגרות המוצג בצד שמאל. התנועה הבולטים הראשונים של הזנב של סרטנים התרחשו # 3 מסגרת, שמונה מילישניות לאחר מגע עם החללית. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2C.jpg" alt="" /> ג) גירוי מישוש חלש הדרגתי נמסרה לראש החיה עורר אי - ענק (Non-G) בתיווך זנב להעיף. שמונה וידאו מסגרות מוצגים בצד שמאל. עקבות הקלטה מתוך בדיקה השתמשו לגעת החיה מוצגת אפור נקודת המגע הוא הצביע על ידי ראש החץ השחור. עקבות הקלטה שהושגו עם האלקטרודות אמבטיה מוצגת בשחור. עקבות חסר פוטנציאל ענק ספייק, deflections הראשוני גדול ומורכב הפוטנציאלים של משרעת הרבה יותר קטן. ברים אפור בהיר מתאימות הווידאו במסגרות המוצג בצד שמאל. התנועה הבולטים הראשונים של הזנב של סרטנים התרחשו מסגרת # 6, 115 אלפיות השנייה לאחר המגע הראשון עם החללית. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig3.jpg" alt="" /> איור 3: חביון תגובה מדידות במשך שבע חיות שונות משני המינים והגדלים דומה (כלומר אורכי ± stdv: 3.2 ס&quot;מ ± 0.2 ס&quot;מ, שנמדד מעל במה כדי telson). MG (פס כחול) ו-LG (אדום בר) זנב הטלות יש latencies תגובה משמעותית קצר יותר מאשר זנב סלטות בתיווכו של המעגלים (פס שחור) Non-G. ממוצעים וסטיות תקן מוצגים. ברים עם אותו מכתב לא היו שונים משמעותית זה מזה (מבחן Wilcoxon דרגה חתומים להשוואה זוג חכם, p &lt;0.05).

<ol>
	<li>Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neural+circuit+activation+and+behavior+during+dominance+hierarchy+formation+in+freely+behaving+crayfish.">Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish.</a> J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).</li><li>Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+and+escape+circuit+activation+in+juvenile+crayfish+during+prey-predator+interactions.">Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions.</a> J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).</li><li>Liden, W. H., Herberholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+neural+responses+of+juvenile+crayfish+to+moving+shadows.J.">Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J.</a> Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).</li><li>Finley, L. A., Macmillan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+field+potentials+during+different+tailflip+behaviours+in+crayfish.">An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish.</a> Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).</li><li>Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+and+other+identified+neurons+of+the+brainstem+escape+network+of+fish.">The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish.</a> Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+voluntary+C-bends+may+be+Mauthner+neuron+initiated.">Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated.</a> J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).</li><li>W&#246;hl, S., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predictive+start+of+hunting+archer+fish:+a+flexible+and+precise+motor+pattern+performed+with+the+kinematics+of+an+escape+C-start.">The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start.</a> J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).</li><li>Fricke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+habituation+in+the+crayfish+due+to+selective+weakening+of+electrical+synapses.">Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses.</a> Brain Res. 322, 139-143 (1984).</li><li>Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+escape+tailflip+in+crayfish+during+backward+walking+and+the+defense+posture.">Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture.</a> J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

לא פולשני הקלטות של פעילות נוירון בודד או הפעלת המעגל העצבי קשה להשיג אצל בעלי חיים בלתי מרוסנת. השיטה המתוארת כאן מספק אמצעי כדי לזהות דפוסים של הפעלה עצבית הבסיסית טבעי התנהגות. בעבר, הצלחנו להשתמש בטכניקה זו כדי למדוד את דפוסי ...

recordings of neural circuit activation in freely behaving animals

הקשר בין דפוסי הפעילות העצבית ואת הביטוי ההתנהגותי המקביל קשה לקבוע בבעלי חיים בלתי מרוסנת. מסורתית פולשני שיטות דורשים נושאי מחקר לפחות חלקית מאופקת, והם רק לאפשר זיהוי של מספרים גדולים של נוירונים מופעלים במקביל. מצד שני, הרכבים קטנים של נוירונים נוירונים בודדים או יכול להיות רק נמדד באמצעות תא יחיד הקלטות המתקבל ההכנות מופחת במידה רבה. מאז הביטוי של התנהגות טבעית מוגבלת בחיות מאופקת גזור, המנגנונים העצביים הבסיסיים ששולטים התנהגות כזו שקשה לזהות. הנה, אני מציג טכניקה לא פולשנית המאפשרת מדידה פיזיולוגית הפעלת המעגל העצבי להתנהג בחופשיות בעלי חיים. שימוש בזוג אלקטרודות מתכת בתוך חדר מלא מים, אלקטרודות אמבטיה שיא הפוטנציאל בתחום עצביים ושרירי שנוצר על ידי סרטנים לנוער במהלך התגובות לברוח או טבעי עורר בניסוי. התגובות הבריחה העיקרי של סרטנים מתווכות על ידי שלושה סוגים שונים של זנב סלטות אשר להזיז את החיות הרחק מנקודת גירוי. כל סוג של זנב להעיף נשלטת על ידי מעגלים עצביים משלה; שתי התגובות הבריחה המהירה והחזקה ביותר ומצריכות הפעלה של קבוצות שונות של נוירונים הפקודה גדול. בשילוב עם תצפיות התנהגותיות, את האלקטרודה הקלטות אמבטיה לאפשר זיהוי חד משמעי של הנוירונים האלה ואת המעגלים העצביים הקשורים. לכן הפעילות של המעגלים העצביים שבבסיס ההתנהגות טבעי ניתן למדוד חיים מרוסנת בהקשרים התנהגותיים שונים.

Watch this Scientific Journal Video about Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals at JoVE.com

Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

לא פולשני מדידות של דפוסי פעילות עצבית להתנהג בחופשיות בעלי חיים מתקבלים על ידי שילוב של הקלטות neurophysiological עם videography במהירות גבוהה.

הקלטות של הפעלת מעגלים עצביים מתנהגת בחופשיות בעלי חיים

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

recordings-of-neural-circuit-activation-in-freely-behaving-animals

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Views.  University of Maryland. לא פולשני מדידות של דפוסי פעילות עצבית להתנהג בחופשיות בעלי חיים מתקבלים על ידי שילוב של הקלטות neurophysiological עם videography במהירות גבוהה.

Video: Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

מדדי הלב ושיעורי נשימתית ב שנע בחופשיות סרטן הנהרות

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

RhoC GTPase Assay Activation

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

דוגמנות ממברנות ביולוגיות עם מעגלים מדידת אותות חשמליים בתוך האקסונים: מעבדה תרגילים סטודנטים

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.