كان أول من استخدم هذه التقنية من خلال تسجيل حمام فريك (1984) [بل] (8) وآخرون. (1990) 9 لقياس المجالات الكهربائية المولدة خلال الذيل تقلب. تعديل في وقت لاحق وتحسين تقنية في مختبر الدكتور دونالد ادواردز (جامعة ولاية جورجيا) من قبل تلميذه السابق الدكتور عيسى خريج ألف فادي وفريقه السابق بعد الدكتوراه المنتسبين الدكتور Herberholz ينس. وقد أحرز مزيد من التحسينات ولقد تم اختبار تطبيقات البحوث العلمية الجديدة في مختبر الدكتور ينس Herberholz في جامعة ميريلاند. وأود أن أشكر زميلي الدكتور ديفيد Yager على السماح لي استخدام جهازه الفيديو عالية السرعة وبحثي مساعدي ديفيد روتشتاين ويدن وليام للمساعدة في التجارب.

الجزء 1 : غرفة تسجيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غرفة تسجيل هو من شكل مستطيل ، والمصنوعة من الزجاج رقيقة الجدران. أبعاد الغرفة هي 8.5 سم × 2 سم x 5 سم (طول × العرض × الارتفاع) للحيوانات من 2.5 -- 3.5 سم مجموع أطوال (تقاس من المنصة لالدبير). انظر الشكل. 1 للحصول على مثال غرفة المستخدمة في تجاربنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك ، يمكن تسجيل الغرف من مواد أخرى (مثلا ، وغير السامة من البلاستيك واضح). قد يختلف حجم الدوائر وفقا للإجراءات التجريبية وغرف مخصصة ينبغي لكل سلسلة التجريبية. للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن تكون صغيرة الحجم غرفة ممكن دون تقييد الحيوانات في سلوكهم الطبيعي. وكقاعدة عامة ، ينبغي للأطوال وعرض الغرفة لن يكون أكثر من ثلاثة أضعاف حجم الحيوان. </li></ol> الجزء 2 : الأقطاب الكهربائية والأسلاك الأرضية حمام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم زوجا واحدا من الأقطاب الكهربائية والقطب تسجيل الأرض. أقطاب كهربائية مصنوعة من الأسلاك النحاسية المعزولة (26 AWG مع العزل 0.25 ملم). يتم توصيل واحدة من نهاية الأقطاب حمام الى مكبر للصوت خارج الخلية (AM نظم 1700 ؛ أنظر أدناه) ، و 0.5 -- 1.0 ملم يتم تجريد من المادة العازلة من الغايات الاخرى. توصيل سلك الأرض إلى الأرض من مكبر للصوت أو أي معدات أخرى ترتكز و 2-3 سم من العزل خلع الطرف الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وترد أقطاب حمام والأسلاك الأرضية على الجدران داخل القاعة مع تسجيل غير سامة الغراء. يتم وضع أقطاب تسجيل مركزيا على جانبي قصيرة للغرفة ، ومعاكس لبعضها البعض (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتوضع قطب الأرض على جانب واحد طويل من تسجيل عمودي غرفة للتسجيل أقطاب (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يملأ الغرفة مع الماء منزوع الأيونات. ويتم الحصول على أفضل النتائج مع الماء للمقاومة عالية (~ 18 MΩ). </li></ol> الجزء 3 : تسجيلات الكهربائي حمام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتتضخم المخرجات من أقطاب تسجيل (1000x) بواسطة مكبر للصوت خارج الخلية (AM الأنظمة ؛ 1700 النموذجي). يتم تصفية إشارة من أقطاب تسجيل باستخدام مزيج من التردد المنخفض (&lt;100 هرتز) وارتفاع وتيرة انقطاع (&gt; 5 كيلو هيرتز). ثم يتم توصيل الإشارات إلى مربع التبديل واقتناء لوحة البيانات (الصكوك الوطنية). يتم تسجيل البيانات الرقمية وتخزينها وتحليلها باستخدام برنامج اكتساب البيانات (Photron أدوات موشن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك ، يمكن الإشارة الرقمية تضخيمها من أقطاب أخرى باستخدام تسجيل التناظرية الرقمية المحولات (على سبيل المثال ، MDS تقنيات تحليلية ؛ Digidata 1440) قبل أن يتم تسجيل البيانات الرقمية باستخدام الأخرى الحصول على البيانات المتاحة تجاريا البرامج (على سبيل المثال ، MDS تقنيات تحليلية ؛ Axoscope). </li></ol> الجزء 4 : دقق تحفيز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إجراء التحقيق لتحفيز ماصة الزجاج (14 سم طول) مجهزة بزوج من سلك كهربائي جيد. ويتعرض نصائح القطب (0.2 ملم) لإنتاج إشارة إلكترونية عند لمس الحيوان التحقيق. وهذا يسمح لقياس الوقت بدقة من التحفيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتتضخم المخرجات من التحقيق تحفيز (1000x) بواسطة مكبر للصوت خارج الخلية (AM الأنظمة ؛ 1700 النموذجي). يتم تصفية إشارة باستخدام مزيج من التردد المنخفض (&lt;100 هرتز) وارتفاع وتيرة انقطاع (&gt; 5 كيلو هيرتز). ثم يتم توصيل الإشارة إلى مربع التبديل واقتناء لوحة البيانات (الصكوك الوطنية). يتم تسجيل البيانات الرقمية وتخزينها وتحليلها باستخدام برنامج اكتساب البيانات (Photron أدوات موشن). </li></ol> الجزء 5 : تسجيلات فيديو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع كاميرا فيديو عالية السرعة (Fastcam - X 1280 PCI ، Photron) عمودي على غرفة تسجيل لتقديم وجهة نظر الجانب. ولا بد من تعديل مستوى سطوع داخل غرفة تسجيل لتقديم أفضل النتائج ، على سبيل المثال باستخدام منار أوزة الرقبة أو غيرها من مصادر الضوء focusable. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الجمع بين السرعة العالية بالفيديو وتزامن ذلك مع التسجيلات الإلكترونية باستخدام اندلاع مربع وبيانات مجلس اقتناء (الصكوك الوطنية). توصيل تضخيم إشارة من الأقطاب الحمام إلى اندلاع مربع وبيانات مجلس اقتناء باستخدام كابلات BNC. خارجي ناحية التبديل الزناد يبدأ باكتساب الفيديو والبيانات المتزامنة. </li></ol> الجزء 6 : الإجراء التجريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تقديم حيوان واحد في الغرفة والسماح للتأقلم لمدة 5 دقائق. وأثار هروب الذيل تقلب بواسطة الصنابير واحدة من شدة مختلفة في الرأس أو البطن ، على التوالي. يتم التحكم في شدة الصنابير التي المجرب. يتم تسجيل كل الهرب الذيل الوجه مع الفيديو عالي السرعة بمعدل إطار نقطة و / ثانية ، وبيانات 1000 من امكانات الحقل الالكترونية يتم تسجيلها عند 25 كيلوهرتز. يبدأ بداية حمام وتسجيل الفيديو عن طريق تبديل دليل على مربع الزناد. يتم تحديد وقت التسجيل عن طريق اختيار معدل الإطار (على سبيل المثال ، 1000 و / ثانية = 4 ثوانى تسجيل الوقت الإجمالي). يمكن اختيار وآخر مرة قبل تسجيل الزناد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليسه : وينبغي التحقق من صحة التسجيلات قطب مرة واحدة لكل أنواع اختبارها من خلال الجمع بين التسجيلات الكهربائي حمام مع غيرها من الأساليب التسجيلات المتاحة. في جراد البحر ، يمكن أن تكون زوج من أقطاب الفضة مزروع جراحيا حول الحبل العصبي البطني. ويمكن تطبيق مؤثرات انتزاع الذيل تقلب الهرب وسجلت آثار الالكترونية وزرع أقطاب كهربائية يمكن مقارنة الحمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهروب الذيل الوجه السلوك ويمكن تسجيل النشاط العصبي المناظرة في مجموعة متنوعة من السياقات المختلفة ، على سبيل المثال في الاستجابة للتهديدات البصرية ، وخلال الهجمات المفترس ، أو خلال اللقاءات ناهض اثنين من جراد البحر. حجم الغرفة ، ووضع التسجيل ، الخ لابد من تعديلها وفقا لذلك (انظر مناقشة). </li></ol> الجزء 7 : تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحليل إطارات الفيديو واحد باستخدام أداة الحركة البرمجيات (Photron). وتستخدم التعقب الالكترونية لتحديد نوع من الدوائر العصبية التي تم تفعيلها من قبل كل التحفيز. تتم مقارنة البيانات لتسجيلات الفيديو الفسيولوجية متزامنة لتحديد حركة الحيوان وتنشيط الدائرة العصبية. كل دائرة تنشيط تنتج التوقيع مميزة الإلكترونية (انظر نتائج الممثل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتحسب الكمون بين المسبار الاتصال والاستجابة العصبية / العضلي لكل تجربة من خلال قياس التأخير بين ظهور إشارة التحقيق وبداية الإشارات المسجلة مع أقطاب الحمام. </li></ol> الجزء 8 : نتائج الممثل سلسلة من إطارات الفيديو واحد عالي السرعة والمناظرة التسجيلات الحقل الكهربائي للهروب الذيل الوجه استجابة لحافز لمسية تسليمها الى الرأس أو الذيل من جراد البحر الأحداث (الشكل 2). التين. أثار اللمس التحفيز القوية لرأس الذيل الوجه الدوائر التي تسيطر عليها العملاقة الإنسي : 2A. الارتفاع المسجل في الخلايا العصبية العملاقة (النجمة) وانحراف كبير طوري يتبع تمكن غير غامضة تحديد الوجه والذيل بوساطة نشاط الخلايا العصبية العملاقة. حركة الى الوراء تظهر في آثار الفيديو يحدد هوية الدارة العصبية تنشيط (MG). التين. تم تطبيق الذيل الوجه بوساطة الدائرة العملاقة الوحشي بعد الحافز القوي لمسية الذيل : 2B. الحركة إلى أعلى وإلى الأمام ينظر في شريط الفيديو مع آثار التتبع الإلكترونية تزامن ارتفاع عرض عملاقة و، طوري كبيرة انحراف أولي يحدد هوية الدارة العصبية تنشيط (LG). التين. 2C : الذيل الوجه التي يسيطر عليها غير العملاقة الدوائر. وتم تسليم التحفيز عن طريق اللمس أكثر تدرجا إلى القفص الصدري من الحيوان. في حين أن الحركة استولت على الفيديو لا يسمح بتحديد واضح للدائرة تنشيط وتسجيل الالكترونية يفتقر إلى ارتفاع العملاقة ، ويتألف من الانحرافات أصغر بكثير تحديد الدوائر المنشط (غير - G). التين. 3 : اختفاء القياسات لجميع الأنواع الثلاثة من الهرب الذيل تقلب. وقد تم قياس الوقت بين الاتصال والاستجابة الفسيولوجية التحقيق لمدة سبعة الحيوانات. وأثارت العملاقة التي تتوسط الذيل تقلب بشكل أسرع من غير العملاقة تقلب الذيل. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig1.jpg" alt="" /> الشكل 1 : مثال لدائرة تسجيل المستخدمة في التجارب على الحيوانات لدينا من 2،5-3،5 سم في مجموع أطوال. يتم لصقها على الأقطاب حمام طرفي نقيض في غرفة بينما يتم إرفاق سلك الأرض إلى الجانب البعيد من الغرفة وعمودي على الأقطاب الحمام. الشكل 2 : واحدة إطارات الفيديو المسجلة في التسجيلات و / ثانية و1000 الموافق الإلكترونية لثلاثة أنواع مختلفة من التحفيز. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2A.jpg" alt="" /> أ) وقد وزعت عن طريق اللمس حافزا قويا لرئيس الحيوان واستدعت العملاقة الإنسية (MG) ​​بوساطة الذيل الوجه. يتم عرض ستة إطارات الفيديو على اليسار. ويظهر أثر التسجيل من التحقيق المستخدمة للمس الحيوانات في الرمادي ، ويدل على نقطة الاتصال عن طريق رأس السهم الأسود. ويظهر أثر تسجيل حصلت مع أقطاب حمام باللون الأزرق. وأقحم يبين محوار عملاق الصغيرة التي تسبق ارتفاع الانحرافات الكبيرة طوري. أشرطة رمادية تتوافق مع إطارات الفيديو الذي يظهر على اليسار. وقعت اول تحرك ملحوظ للجراد في ذيل في الإطار رقم 3 ، وسبعة مللي ثانية بعد الاتصال مع التحقيق. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2B.jpg" alt="" /> ب) تم تسليمها عن طريق اللمس حافزا قويا لذيل الحيوان واستدعت العملاقة الوحشي (LG) بوساطة الذيل الوجه. يتم عرض ستة إطارات الفيديو على اليسار. ويظهر أثر التسجيل من التحقيق المستخدمة للمس الحيوانات في الرمادي ، ويدل على نقطة الاتصال عن طريق رأس السهم الأسود. تتبع تسجيل حصل معويرد أقطاب حمام باللون الأحمر. وأقحم يبين محوار عملاق الصغيرة التي تسبق ارتفاع الانحرافات الكبيرة طوري. أشرطة رمادية تتوافق مع إطارات الفيديو الذي يظهر على اليسار. وقعت اول تحرك ملحوظ للجراد في ذيل في الإطار رقم 3 ، وثمانية ميلي ثانية بعد الاتصال مع التحقيق. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2C.jpg" alt="" /> C) وتم تسليم التحفيز وضعف تدريجي عن طريق اللمس على رأس الحيوان واستدعت غير العملاقة (غير G) بوساطة الذيل الوجه. يتم عرض ثمانية إطارات الفيديو على اليسار. ويظهر أثر التسجيل من التحقيق المستخدمة للمس الحيوانات في الرمادي ، ويدل على نقطة الاتصال عن طريق رأس السهم الأسود. ويظهر أثر تسجيل حصلت مع أقطاب حمام باللون الأسود. تتبع يفتقر إلى إمكانية ارتفاع العملاقة ، فإن هذه الانحرافات الكبيرة الأولي ويتكون من إمكانات سعة أصغر من ذلك بكثير. أشرطة رمادي فاتح تتوافق مع إطارات الفيديو الذي يظهر على اليسار. وقعت اول تحرك ملحوظ للجراد في ذيل في الإطار رقم 6 ، 115 ميلي ثانية بعد أول اتصال مع التحقيق. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig3.jpg" alt="" /> الشكل 3 : قياسات كمون الاستجابة لمدة سبعة حيوانات مختلفة من كلا الجنسين وأحجام مماثلة (يعني أطوال ± stdv : 3.2 سم ± 0.2 سم ، يقاس من المنصة لالدبير). MG (الشريط الأزرق) وشركة إل جي (أحمر بار) الذيل تقلب والإختفاء استجابة أقصر بكثير من الذيل تقلب بوساطة الدوائر (شريط أسود) غير G. وتظهر وسائل والانحرافات المعيارية. لم الحانات مع الرسالة نفسها لا تختلف كثيرا عن بعضها البعض (اختبار Wilcoxon رتبة توقيع للمقارنة الزوج الحكيم ، P &lt;0.05).

<ol>
	<li>Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neural+circuit+activation+and+behavior+during+dominance+hierarchy+formation+in+freely+behaving+crayfish.">Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish.</a> J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).</li><li>Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+and+escape+circuit+activation+in+juvenile+crayfish+during+prey-predator+interactions.">Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions.</a> J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).</li><li>Liden, W. H., Herberholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+neural+responses+of+juvenile+crayfish+to+moving+shadows.J.">Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J.</a> Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).</li><li>Finley, L. A., Macmillan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+field+potentials+during+different+tailflip+behaviours+in+crayfish.">An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish.</a> Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).</li><li>Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+and+other+identified+neurons+of+the+brainstem+escape+network+of+fish.">The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish.</a> Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+voluntary+C-bends+may+be+Mauthner+neuron+initiated.">Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated.</a> J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).</li><li>W&#246;hl, S., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predictive+start+of+hunting+archer+fish:+a+flexible+and+precise+motor+pattern+performed+with+the+kinematics+of+an+escape+C-start.">The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start.</a> J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).</li><li>Fricke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+habituation+in+the+crayfish+due+to+selective+weakening+of+electrical+synapses.">Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses.</a> Brain Res. 322, 139-143 (1984).</li><li>Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+escape+tailflip+in+crayfish+during+backward+walking+and+the+defense+posture.">Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture.</a> J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

غير الغازية تسجيلات لنشاط الخلايا العصبية واحدة أو العصبية تنشيط الدائرة يصعب الحصول عليها في الحيوانات غير المقيد. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر وسيلة لتحديد أنماط التنشيط العصبي الكامنة طبيعيا السلوك. في الماضي ، ونحن استخدمت بن?...

recordings of neural circuit activation in freely behaving animals

العلاقة بين أنماط النشاط العصبي والتعبير السلوكي المقابلة من الصعب تحديد في الحيوانات غير المقيد. غير الغازية التقليدية تتطلب طرق موضوعات بحثية على الأقل جزئيا ضبط النفس ، وأنها لا تسمح بتحديد أعداد كبيرة من الخلايا العصبية تفعيلها في وقت واحد. من ناحية أخرى ، لا يمكن إلا فرق صغيرة من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية الفردية يمكن قياسها باستخدام وحيدة الخلية التسجيلات التي تم الحصول عليها من الاستعدادات خفضت الى حد كبير. منذ يقتصر التعبير عن السلوك الطبيعي للحيوانات ضبط النفس وتشريح ، والآليات الكامنة وراء العصبية التي تتحكم في مثل هذا السلوك من الصعب التعرف عليها. هنا ، أقدم تقنية غير الغازية التي تسمح بقياس الفسيولوجية العصبية تنشيط الدائرة في التصرف بحرية الحيوانات. باستخدام زوج من الأقطاب الكهربائية الأسلاك داخل غرفة مملوءة بالماء ، وحمام أقطاب سجل امكانات الحقل العصبية والعضلية التي تولدها الأحداث جراد خلال الاستجابات الطبيعية أو الهرب أثار تجريبيا. وتوسط في الاستجابات الأولية من جراد البحر هربا من ثلاثة أنواع مختلفة من الذيل تقلب الحيوانات التي تتحرك بعيدا عن نقطة من التحفيز. يتم التحكم في كل نوع من الذيل الوجه بواسطة دارتها العصبية الخاصة ، وردين الهروب أسرع وأقوى تتطلب تفعيل مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية الأمر واسع. بالاشتراك مع الملاحظات السلوكية ، وتسجيلات الكهربائي حمام تتيح تحديد هوية لا لبس فيه من هذه الخلايا العصبية والدوائر المرتبطة بها العصبية. بالتالي يمكن قياس نشاط الدوائر العصبية الكامنة وراء السلوك طبيعيا في الحيوانات غير المقيد والسلوكية في سياقات مختلفة.

Watch this Scientific Journal Video about Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals at JoVE.com

Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

ويتم الحصول على قياسات غير الغازية من أنماط النشاط العصبي في التصرف بحرية الحيوانات من خلال الجمع بين العصبية تسجيلات بالفيديو مع سرعة عالية.

تسجيلات لتنشيط الدائرة العصبية في التصرف بحرية حيوانات

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

recordings-of-neural-circuit-activation-in-freely-behaving-animals

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Views.  University of Maryland. ويتم الحصول على قياسات غير الغازية من أنماط النشاط العصبي في التصرف بحرية الحيوانات من خلال الجمع بين العصبية تسجيلات بالفيديو مع سرعة عالية.

Video: Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

تسجيلات كاملة من خلية دماغ ذبابة الفاكهة الكبار

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

مستدعى خلية كاملة تسجيلات الضوء التيارات متشابك مثير في شريحة الشبكية

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

تتبع المسار Engraftment العضلات في الحيوانات الصغيرة من قبل في فيفو نيون التصوير

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

تدابير القلب والتنفس الصناعي في أسعار التحرك بحرية جراد البحر

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

تسجيلات شفط وحيدة الخلية المستقبلة من المخروط ماوس

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

RhoC الفحص GTPase التنشيط

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

النمذجة الأغشية البيولوجية مع لوحات الدوائر الكهربائية وقياس الاشارات في محاور عصبية : تمارين مختبر طالبة

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

والعزلة في المختبر تفعيل انواع معينة ايليجانس الحيوانات المنوية

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.