Banyo kayıt tekniği ilk Fricke (1984), 8 ve Beall ve ark tarafından kullanılmıştır. Kuyruk çevirir sırasında oluşan elektrik alanları ölçmek için (1990) 9. Bu teknik daha sonra modifiye edilmiş ve Dr. Donald Edwards (Gürcistan Devlet Üniversitesi) eski yüksek lisans öğrencisi Dr. Fadi A. Issa ve eski doktora sonrası yardımcısı Dr Jens Herberholz laboratuvarında geliştirildi. Daha fazla ayrıntılandırmaları yapılmış ve yeni araştırma uygulamaları Maryland Üniversitesi&#39;nden Dr. Jens Herberholz laboratuvar test edilmiştir. Benim meslektaşım Dr David Yager deneyler ile yardım için bana onun yüksek hızda video sistemi ve araştırma görevlisi David Rotstein ve William Liden bildirdiğiniz için teşekkür etmek istiyorum.

Bölüm 1: Kayıt odasına <ol><li> Kayıt odası, dikdörtgen şeklinde ve ince duvarlı cam yapılır. Odası boyutları 8,5 cm x 2 cm hayvanlar için 2,5 x 5 cm (uzunluk x genişlik x yükseklik) - 3,5 cm toplam uzunluk (telzon için kürsüden ölçülen). Bkz: Şekil. 1, deneylerde kullanılan bir oda bir örnek için. </li><li> Alternatif olarak, kayıt odaları, diğer malzemeler (örneğin, non-toksik şeffaf plastik) yapılabilir. Chambers boyutu her bir deney serisi için özelleştirilmiş olmalıdır deneysel prosedür ve odalarına göre farklılık gösterebilir. En iyi sonuç için, oda büyüklüğü, hayvanların doğal davranışlarını kısıtlama olmadan, mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Genel bir kural olarak, uzunlukları ve hayvan odasının genişliği en fazla üç katı büyüklüğünde olmamalıdır. </li></ol> Bölüm 2: Banyo elektrotlar ve topraklama kablosu <ol><li> Bir kayıt elektrot çifti ve bir zemin elektrot kullanılır. Elektrotlar yalıtılmış bakır tel (0.25 mm yalıtım ile 26 AWG) yapılır. Banyo elektrotların bir ucu ekstraselüler amplifikatör (AM Sistemleri 1700; aşağıya bakınız) bağlı olan ve 0,5 - 1,0 mm yalıtım diğer ucu çıkardı. Topraklama kablosu amplifikatör veya diğer herhangi bir topraklı yalıtım ekipman ve 2-3 cm yere bağlı diğer ucunu çıkardı. </li><li> Banyo elektrotlar ve topraklama kablosu, toksik olmayan yapıştırıcı ile kayıt odasının iç duvarları bağlıdırlar. Kayıt elektrotları kısa her iki tarafta birbirine odasının tam karşısında, (Şekil 1) merkezi olarak konumlandırılmış. </li><li> Zemin elektrot kayıt elektrotlar (Şekil 1) kayıt odası dik uzun bir tarafında konumlandırılmış. </li><li> Odası deiyonize su ile doldurulur. En iyi sonuçlar, yüksek direnç su (M ~ 18) ile elde edilir. </li></ol> Bölüm 3: Banyo elektrot kayıtları <ol><li> Çıkışlar kayıt elektrotları ekstraselüler amplifikatör (Model 1700 AM Sistemleri) (1000x) güçlendirilir. Kayıt elektrotları Sinyal düşük frekanslı (&lt;100 Hz) ve yüksek frekanslı cut-off (&gt; 5 KHz) kullanılarak süzülür. Sinyal sonra bir anahtar kutusu ve bir veri toplama kartı (National Instruments) bağlıdır. Sayısallaştırılmış veri kaydedilmiş saklanır ve veri toplama yazılımı (Photron Hareket Araçları) kullanılarak analiz edildi. </li><li> Sayısallastırılması piyasada mevcut diğer veri toplama yazılımı (Axoscope örneğin, MDS Analitik Teknolojileri) kullanılarak kaydedilen önce; Alternatif olarak, kayıt elektrotları amplifiye sinyal diğer analog-dijital dönüştürücüler (Digidata 1440 örneğin, MDS Analitik Teknolojileri) kullanılarak sayısallaştırılmış olabilir. </li></ol> Bölüm 4: Uyarıcı prob <ol><li> Bir uyarıcı prob ince tel elektrotlar bir çift ile donatılmış bir cam pipet (14 cm uzunluğunda) yapılır. Elektrot ipuçları hayvan prob tarafından dokunulmaz bir elektronik sinyal üretmek için (0.2 mm) maruz kalmaktadır. Bu uyarımı tam zamanı ölçmek için sağlar. </li><li> Uyarıcı prob Çıkışlar ekstraselüler amplifikatör (Model 1700 AM Sistemleri) (1000x) güçlendirilir. Sinyal düşük frekans kombinasyonu (&lt;100 Hz) ve yüksek frekanslı cut-off (&gt; 5 KHz) kullanılarak süzülür. Sinyal daha sonra bir anahtar kutusu ve bir veri toplama kartı (National Instruments) bağlıdır. Sayısallaştırılmış veri kaydedilmiş saklanır ve veri toplama yazılımı (Photron Hareket Araçları) kullanılarak analiz edildi. </li></ol> Bölüm 5: Video kayıtları <ol><li> Yüksek hızlı video kamera (Fastcam-X 1280 PCI, Photron) bir yan görünüm sağlamak için kayıt odasına dik olarak konumlandırılmış. Örneğin bir kaz boynu aydınlatma veya diğer odaklanamazlar ışık kaynakları kullanılarak, en iyi sonuçları sunmak için kayıt odasının içinde parlaklık seviyesi ayarlanabilir olmalıdır. </li><li> Yüksek hızda videografisi kombine ve bir breakout kutusu ve veri toplama kartı (National Instruments) kullanılarak elektronik kayıtları ile senkronize edilir. Banyo elektrotlar Amplifiye sinyal BNC kablolar kullanarak ara kutusu ve veri toplama kartı bağlı. El-switch harici bir tetikleyici senkronize video ve veri toplama başlar. </li></ol> Bölüm 6: Deneysel prosedür <ol><li> Tek bir hayvan odasına girmiş ve 5 dakika boyunca gelmesini izin verilir. Kaçış kuyruk çevirir, sırasıyla, farklı şiddette tek musluklar baş veya karın tarafından ortaya. Musluklar yoğunluğu deneyci tarafından kontrol edilir. Her kaçış kuyruk-flip 25 kHz kaydedildi elektronik alanında potansiyellerin 1000 f / sn, ve veri noktaları bir kare hızında yüksek hızlı video ile kaydedilir. Banyo ve video kayıt başlangıcı, bir tetikleyici kutusu manuel anahtarı ile başlatılır. Kayıt süresi, seçilen kare hızı (örneğin, 1000 f / sn = 4 sn toplam kayıt süresi) tarafından belirlenir. Post-ve ön-tetiklemeli kayıt süreleri seçilebilir. </li><li> Değile: Banyo elektrot kayıtları, mevcut diğer kayıtları yöntemleri ile banyo elektrot kayıtları birleştirerek her test edilen türler için bir kez kontrol edilmelidir. Kerevit, bir çift gümüş elektrot cerrahi ventral sinir kablosu çevresinde implante edilebilir. Kaçış kuyruk çevirir eliciting Uyaranlar uygulanır ve banyo elektrot implante ve mukayese edilebilir elektronik izleri kaydedilebilir. </li><li> Escape kuyruk flip davranış ve ilgili nöral aktivitenin farklı bağlamlarda çeşitli kaydedilebilir, örneğin görsel tehditlere yanıt olarak, yırtıcı saldırılar sırasında, ya da iki kerevit agonistik karşılaşmalar sırasında. Oda boyutu, kayıt modu, vb (Tartışma) buna göre ayarlanmalıdır . </li></ol> Bölüm 7: Veri analizi <ol><li> Tek video kareleri hareket aracı yazılım (Photron) kullanılarak analiz edilmektedir. Elektronik izleri, her bir uyaran ile aktive olan nöral devrenin türünü tanımlamak için kullanılır. Video veriler, hayvanın hareket ve aktif sinirsel devre belirlemek için senkronize fizyolojik kayıtları karşılaştırılır. Her aktif devre karakteristik bir elektronik imza (Temsilcisi sonuçları görmek) üretir. </li><li> Prob sinyali başlangıcı ve banyo elektrotlar ile kaydedilen sinyal başlangıcı arasındaki gecikme ölçüm probu temas ve sinir / kas yanıt arasındaki Gecikme her bir deney için hesaplanır. </li></ol> Bölüm 8: Temsilci sonuçları Bir çocuk kerevit baş ve kuyruk (Şekil 2) teslim dokunsal uyarana yanıt olarak tek bir yüksek hızlı video çerçeveleri ve kaçış kuyruk-flip karşılık gelen elektrik alan kayıtları bir dizi. Şekil 2A: baş Güçlü dokunsal uyaran medial dev bir devre tarafından kontrol edilen bir kuyruk-flip uyandırdı. Dev nöron (yıldız) ve takip eden büyük bir fazik saptırma kaydedildi başak olmayan belirsiz kimlik kuyruk-flip dev nöron aktivitesi ile aracılı olarak sağlar. Video izlerini gösterilen geri hareket aktive sinir devresi (MG) kimliğini belirler. Şekil 2B: güçlü bir dokunsal uyaran sonra lateral dev devre Kuyruk-flip aracılı kuyruk uygulandı. Videoda görülen yukarı ve ileri hareket ile birlikte dev başak ve büyük, fazik ilk sapma aktif sinirsel devre (LG) kimliğini belirler gösteren senkronize elektronik iz izler. Şekil 2C: Kuyruk-flip olmayan dev devresi tarafından kontrol edilir. Daha tedrici bir dokunsal uyaran hayvan toraks teslim edildi. Video yakalanan hareketin aktif devre açık kimliği izin vermez iken, elektronik kayıt dev bir başak yoksundur ve aktif devre (Non-G) tanımlamak daha küçük deplasmanlar oluşur. Şekil 3: Gecikme ölçümleri her üç tür kaçış için kuyruk çevirir. Prob temas ve fizyolojik tepki arasındaki süre yedi hayvanlar için ölçüldü. Dev-aracılı kuyruk çevirir hızlı devi olmayan kuyruk-çevirir daha belirgin ortaya çıkardı. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig1.jpg" alt="" /> Şekil 1: Toplam uzunlukları 2.5-3.5 cm hayvanların deneylerde kullanılan bir kayıt odası için bir örnek. Topraklama kablosu, uzun kenarı odanın bağlı ve banyo elektrodlar dik iken, banyo elektrotlar odasının ters tarafa da yapıştırılmış. Şekil 2: 1000 f / sn ve buna karşılık gelen üç farklı türleri için stimülasyon elektronik kayıtlar kaydedildi Tek video kareleri. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2A.jpg" alt="" /> A) güçlü dokunsal uyaran hayvanın kafasına teslim ve medial dev (MG), kuyruk-flip aracılı ortaya çıkardı . Altı video çerçeveleri soldaki görüntülenir. Hayvan dokunmak için kullanılan prob Kayıt eser, gri renkte gösterilir; temas noktası siyah ok ucu ile gösterilir. Kayıt iz banyo elektrotlar ile elde edilen mavi ile yazılmıştır. Içerlek büyük fazik deplasmanlar önündeki küçük dev akson başak gösterir. Gri çubuklar soldaki gösterilen video kare karşılık gelir. Prob ile temas ettikten sonra çerçeve # 3, yedi milisaniye kerevit kuyruk dikkati çeken ilk hareketi oluştu. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2B.jpg" alt="" /> B) güçlü bir dokunsal uyaran hayvanın kuyruk teslim edildi ve kuyruk-flip aracılı lateral dev (LG) ortaya çıkardı. Altı video çerçeveleri soldaki görüntülenir. Hayvan dokunmak için kullanılan prob Kayıt eser, gri renkte gösterilir; temas noktası siyah ok ucu ile gösterilir. Kayıt eser ile elde edilenbanyo elektrotlar kırmızıyla gösterilir. Içerlek büyük fazik deplasmanlar önündeki küçük dev akson başak gösterir. Gri çubuklar soldaki gösterilen video kare karşılık gelir. Prob ile temas ettikten sonra çerçeve # 3, sekiz milisaniye kerevit kuyruk dikkati çeken ilk hareketi oluştu. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2C.jpg" alt="" /> C) zayıf ve yavaş yavaş dokunsal uyaran hayvanın kafasına teslim devi olmayan (Non-G) aracılı tail-flip ortaya çıkardı. Sekiz video çerçeveler soldaki görüntülenir. Hayvan dokunmak için kullanılan prob Kayıt eser, gri renkte gösterilir; temas noktası siyah ok ucu ile gösterilir. Kayıt iz banyo elektrotlar ile elde edilen siyah gösterilir. Iz dev başak potansiyeli, büyük ilk deplasmanlar yoksun ve çok daha küçük genlik potansiyelleri oluşur. Açık gri çubukları, sol tarafta gösterilen video kare karşılık gelir. Probu ile ilk temastan sonra çerçeve # 6, 115 milisaniye kerevit kuyruk dikkati çeken ilk hareketi oluştu. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig3.jpg" alt="" /> Şekil 3: Tepki gecikme ölçümleri her iki cinsiyette ve benzeri boyutları yedi farklı hayvanlar için (uzunlukları ortalama ± stdv: 3.2 cm ± 0.2 cm, telzon için kürsüden ölçülen). MG (mavi bar) ve LG (kırmızı bar) flip-tail göre anlamlı derecede daha kısa tepki gecikmeleri var kuyruk çevirir Non-G (siyah çubuk) devresi aracılığı ile. Ortalama ve standart sapmaları gösterilmiştir. Aynı harf ile Barlar (Wilcoxon Signed Rank testi per bilge karşılaştırma, p &lt;0.05) birbirinden anlamlı farklılık yoktu.

<ol>
	<li>Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neural+circuit+activation+and+behavior+during+dominance+hierarchy+formation+in+freely+behaving+crayfish.">Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish.</a> J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).</li><li>Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+and+escape+circuit+activation+in+juvenile+crayfish+during+prey-predator+interactions.">Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions.</a> J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).</li><li>Liden, W. H., Herberholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+neural+responses+of+juvenile+crayfish+to+moving+shadows.J.">Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J.</a> Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).</li><li>Finley, L. A., Macmillan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+field+potentials+during+different+tailflip+behaviours+in+crayfish.">An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish.</a> Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).</li><li>Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+and+other+identified+neurons+of+the+brainstem+escape+network+of+fish.">The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish.</a> Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+voluntary+C-bends+may+be+Mauthner+neuron+initiated.">Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated.</a> J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).</li><li>W&#246;hl, S., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predictive+start+of+hunting+archer+fish:+a+flexible+and+precise+motor+pattern+performed+with+the+kinematics+of+an+escape+C-start.">The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start.</a> J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).</li><li>Fricke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+habituation+in+the+crayfish+due+to+selective+weakening+of+electrical+synapses.">Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses.</a> Brain Res. 322, 139-143 (1984).</li><li>Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+escape+tailflip+in+crayfish+during+backward+walking+and+the+defense+posture.">Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture.</a> J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Non-invaziv kayıtları, tek bir nöron aktivitesinin veya nöral devre aktivasyon dizginlenmemiş hayvanlar elde etmek zordur. Burada açıklanan yöntem, davranış oluşan doğal altta yatan nöral aktivasyon kalıplarını belirlemek için bir araç sağlar. Geçmişte, başarılı görsel tehditleri 3 yanıt olarak, daha yakın zamanlarda doğal yırtıcılar 2 ve saldırılar sırasında, faaliyet şekillerinin oluşumu sırasında sosyal baskınlık hiyerarşiler...

recordings of neural circuit activation in freely behaving animals

Nöral aktivitenin ve ilgili davranışsal ifade kalıpları arasındaki ilişkinin dizginlenmemiş hayvanlarda kurmak zordur. Geleneksel non-invaziv yöntemler, en azından kısmen ölçülü araştırma konuları gerektirir ve bunlar aynı anda aktif nöron çok sayıda kimlik sadece izin. Öte yandan, küçük bir nöron toplulukları ya da bireysel nöronlar sadece büyük ölçüde azaltılmış hazırlıkları elde edilen tek hücreli kayıtları kullanılarak ölçülür olabilir. Ölçülü ve disseke hayvanların doğal davranışı ifade sınırlı olduğundan, bu tür davranışları kontrol altında yatan nöral mekanizmaların tespit etmek zordur. Burada, serbestçe hayvanlar davranıyor nöral devre aktivasyon ölçüm sağlayan bir non-invaziv fizyolojik tekniği mevcut. Su dolu bir kabin içerisinde bir çift tel elektrotlar kullanarak, banyo elektrotlar, sinir ve kas alan, doğal ya da deneysel uyarılmış kaçış tepkiler sırasında çocuk kerevit tarafından üretilen potansiyelleri kaydedin. Kerevit birincil kaçış yanıtları stimülasyon noktasından uzakta, hayvanların hareket kuyruk döndürür üç farklı türlerine göre aracılık eder. Kuyruk flip Her tür kendi nöral devre tarafından kontrol edilir, en hızlı ve en güçlü iki kaçış yanıtları farklı büyük komut nöronların setleri aktivasyonu gerektirir. Davranışsal gözlemler ile birlikte, banyo elektrot kayıtları açık kimliği ve bu nöronların ilişkili nöral devreler izin verir. Böylece doğal olarak ortaya çıkan davranışın altında yatan nöral devreleri faaliyet dizginlenmemiş hayvanlarda ve farklı davranış bağlamlarda ölçülebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals at JoVE.com

Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Serbestçe hayvanlar davranıyor sinirsel aktivite desen non-invaziv ölçümler, yüksek hız videografisi ile nörofizyolojik kayıtları birleştirerek elde edilir.

Serbestçe Hayvanlar Behaving Sinir Devre Etkinleştirme kayıtları

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

recordings-of-neural-circuit-activation-in-freely-behaving-animals

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Görüntüleme.  University of Maryland. Serbestçe hayvanlar davranıyor sinirsel aktivite desen non-invaziv ölçümler, yüksek hız videografisi ile nörofizyolojik kayıtları birleştirerek elde edilir.

Video: Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

Yetişkin Drosophila Beyin Tüm Hücre Kayıtlar

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

Biyoloji

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Küçük Hayvan Kas Aşı dinamiği ile Takip In Vivo Floresan Görüntüleme

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

Serbestçe Kerevit Hareketli Kalp ve Ventilatuar Oranları Ölçüleri

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Tek hücreli fare Koni fotoreseptörlerin Emiş Kayıtlar

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

RhoC GTPaz Etkinleştirme Testi

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

Devre Biyolojik Membranlar Modelleme ve Aksonlar Elektrik Sinyalleri Ölçme: Öğrenci Laboratuvar Egzersizler

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.