목욕 녹음 기술이 처음 프리클 (1984) 8 비올 외 의해 사용되었다. 꼬리 - 화나게하는 동안 생성된 전기 분야를 측정하기 위해 (1990) 9. 기술은 나중에 수정과 그의 전 대학원생 박사 Fadi A. 이사와 전 박사와 연관 박사 젠스 Herberholz로 박사 도널드 에드워즈 (조지아 주립 대학)의 실험실에서 개선되었습니다. 또한 개선 되었어요과 새로운 연구 응용 프로그램은 메릴랜드 대학에서 박사 젠스 Herberholz의 연구실에서 테스트되었습니다. 나는 내가 실험에 도움을 위해서 자기의 고속 비디오 시스템 및 연구 보조 데이비드 Rotstein와 윌리엄 리덴를 사용셔서 나의 동료 데이빗 예이거 감사하고 싶습니다.

1 부 : 녹음 챔버 <ol><li> 녹음 챔버는 직사각형 모양이며, 얇은 벽의 유리로 만들어진 것입니다. 챔버 크기는 8.5 cm 아르 X 2cm 2.5 동물 X 5cm (길이 X 너비 X 높이) - 3.5 cm 전체 길이 (텔슨에 연단에서 측정). 그림을 참조하십시오. 우리의 실험에 사용되는 챔버 예를 들어 1. </li><li> 또는 녹음 여왕님 기타 자료 (예, 무독성 투명한 플라스틱)에서 할 수 있습니다. 챔버의 크기는 각 실험 시리즈에 맞게해야 실험 절차와 챔버에 따라 다를 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면, 챔버의 크기는 자연 행동에 동물을 억제하지 않고 가능한 한 작게해야합니다. 엄지의 규칙으로, 길이와 챔버의 너비가 동물보다 3 배 크기해서는 안됩니다. </li></ol> 2 부 : 목욕 전극과 접지 와이어 <ol><li> 한 기록 전극의 쌍 및 접지 전극이 사용됩니다. 전극은 절연 구리선 (0.25 mm 절연와 26 AWG)의 만들어집니다. 욕조 전극의 한쪽 끝을는 세포 증폭기 (AM 시스템 1700, 아래 참조)에 연결되어 있고 0.5 - 단열 1.0 mm는 다른 끝을에서 제외됩니다. 접지 와이어는 앰프 또는 다른 접지 설비 및 단열의 2~3센티미터의 접지에 연결되어있는 것은 다른 한쪽을 분해까지입니다. </li><li> 목욕 전극과 접지 와이어는 무독성 접착제로 기록 챔버의 내부 벽면에 붙어있다. 녹화 전극이 서로 챔버와 반대 (그림 1)의 두 짧은 측면에서 중앙 위치입니다. </li><li> 접지 전극은 기록 전극 (그림 1)에 기록 챔버 직각 중 하나가 긴 측면에 위치합니다. </li><li> 상공 회의소는 탈이온수으로 가득합니다. 최상의 결과는 높은 저항의 물 (MΩ ~ 18)을 얻을 수 있습니다. </li></ol> 파트 3 : 바스 전극 레코딩 <ol><li> 기록 전극의 출력은 세포 증폭기 (; 모델 1700 AM 시스템)에 의해 (1000x) 증폭됩니다. 기록 전극의 신호는 낮은 주파수의 조합 (&lt;100 Hz에서) 높은 주파수 컷 - 싫어하는 (&gt; 5 kHz에서)를 사용하여 필터링됩니다. 신호는 다음 스위치 박스와 데이터 수집 보드 (국가 악기)에 연결되어 있습니다. 디지털 데이터는 기록 저장 및 데이터 수집 소프트웨어 (Photron 모션 도구)를 사용하여 분석합니다. </li><li> 디지털 데이터가 다른 상용 데이터 수집 소프트웨어를 (; Axoscope 예를 들어, MDS 분석 기술)를 사용하여 기록되기 전에, 또는 기록 전극에서 증폭된 신호는 다른 아날로그 - 디지털 컨버터 (Digidata 1,440 예, MDS 분석 기술)를 사용하여 디지털하실 수 있습니다. </li></ol> 부 4 : 자극 프로브 <ol><li> 자극 프로브 미세 와이어 전극의 쌍을 갖춘 유리 피펫 (14cm 길이)의 이루어집니다. 전극 팁은 동물이 프로브에 의해 감동하는 전자 신호를 생성하기 위해 (0.2 mm) 노출됩니다. 이 자극의 정확한 시간을 측정할 수 있습니다. </li><li> 자극 프로브의 출력은 세포 증폭기 (; 모델 1700 AM 시스템)에 의해 (1000x) 증폭됩니다. 신호는 낮은 주파수의 조합 (&lt;100 Hz에서) 높은 주파수 컷 - 싫어하는 (&gt; 5 kHz에서)를 사용하여 필터링됩니다. 신호는 다음 스위치 박스와 데이터 수집 보드 (국가 악기)에 연결되어 있습니다. 디지털 데이터는 기록 저장 및 데이터 수집 소프트웨어 (Photron 모션 도구)를 사용하여 분석합니다. </li></ol> 제 5 부 : 비디오 레코딩 <ol><li> 고속 비디오 카메라 (Fastcam - X 1280 PCI, Photron)은 측면보기를 제공하기 위해 녹화 실로 수직 위치입니다. 레코딩 챔버 내부의 밝기 레벨은 거위 목 조명기 또는 기타 focusable 광원을 사용하여 예 : 최상의 결과를 제공하기 위해 조정해야합니다. </li><li> 고속 videography가 결합하여 브레이크 아웃 박스 및 데이터 수집 보드 (내쇼날 인 스트 루먼트)를 사용하여 전자 기록과 동기화됩니다. 목욕 전극에서 증폭된 신호는 BNC 케이블을 사용하여 브레이크 아웃 박스와 데이터 수집 보드에 연결됩니다. 외부 손으로 스위치 트리거는 동기화된 비디오 및 데이터 수집을 시작합니다. </li></ol> 6 부 : 실험 절차 <ol><li> 하나의 동물이 챔버로 도입하고 5 분 순응 수 있습니다. 이스케이프 꼬리를 방방 뜬다는 각각 머리 또는 복부에 서로 다른 강도의 단일 도청 장치에 의해 elicited 수 있습니다. 도청의 강도는 실험자에 의해 제어됩니다. 각 탈출 꼬리 - 플립은 25 kHz에서에서 기록된 전자 분야의 잠재력 1000 F / 초, 데이터 포인트의 프레임 속도로 고속 동영상 기록됩니다. 목욕 및 비디오 녹화의 시작은 트리거 상자에서 수동으로 스위치에 의해 시작됩니다. 녹화 시간은 선택한 프레임 속도 (예 : 1000 F / 초 = 4 초 총 녹화 시간)에 의해 결정됩니다. 우편 및 사전 트리거 녹화 시간을 선택할 수 있습니다. </li><li> 아니E : 바스 전극 기록이 다른 사용 가능한 레코딩 방식 욕조 전극 기록을 결합하여 각 검사 종류에 대해 한 번 확인해야합니다. 크레이 피쉬에서 실버 전극 한 켤레가 수술 복부 신경 코드 주위에 이식 수 있습니다. 탈출 꼬리를 팅겨주는군요 도출 자극이 적용 이식 및 목욕 전극을 비교할 수의 전자 흔적을 기록하실 수 있습니다. </li><li> 꼬리 - 플립 행동과 해당 신경 활동이 다른 문맥 다양한 기록할 수, 시각 위협에 대응 예를 들어, 육식 동물의 공격 중에, 또는 두 왕새우 무리한 조우하는 동안을 탈출. 챔버 크기, 촬영 모드 등 (토론 참조) 이에 따라 조정되어야한다. </li></ol> 7 부 : 데이터 분석 <ol><li> 단일 비디오 프레임은 모션 도구 소프트웨어 (Photron)를 사용 분석하고 있습니다. 전자 흔적은 각 자극에 의​​해 활성화된 신경 회로의 종류를 식별하는 데 사용됩니다. 비디오 데이터는 동물의 움직임과 활성화된 신경 회로를 결정하는 동기 생리적 녹음 비교합니다. 각 활성 회로 특성 전자 서명 (대표 결과를 참조) 생산하고 있습니다. </li><li> 프로브 연락처 및 신경 / 근육 응답 사이의 지연 시간은 프로브 신호의 발병과 목욕 전극로 기록된 신호의 발병 사이의 지연 시간을 측정하여 각 실험에 대해 계산됩니다. </li></ol> 8 부 : 대표 결과 소년 왕새우 머리 또는 꼬리 (그림 2)에 전달 촉각 자극에 대한 응답으로 단일 고속 비디오 프레임과 탈출 꼬리 - 플립을 위해 해당 전기장 레코딩 시리즈. 그림. 2A : 머리에 강력한 촉각 자극은 중간 거대한 회로에 의해 통제 꼬리 - 플립을 evoked. 거대한 신경 세포 (별표)와 다음과 대형 phasic 편향의 기록 스파이크가 아닌 모호한 신원 꼬리 - 플립 거대한 신경 세포 활동에 의해 중재로 수 있습니다. 비디오 흔적에 나타난 뒤로 운동이 활성화된 신경 회로 (MG)의 신원을 결정합니다. 그림. 2B : 강한 촉각 자극 후 측면 거대한 회로에 의해 타일 - 플립 중재는 꼬리에 적용되었다. 동영상에서 볼 상향 앞으로 움직임은 거대한 스파이크와 대형 phasic 초기 편향이 활성화된 신경 회로 (LG)의 신원을 결정을 표시하는 동기 전자 추적과 함께 흔적. 그림. 2C : 타일 - 플립이 아닌 거대한 회로에 의해 제어. 더 점차 촉각 자극은 동물의 근육에 전달했다. 비디오 캡처 운동은 활성 회로의 모호하지 신분을 허용하지 않는 반면, 전자 기록은 거대한 스파이크를 결여하고 활성 회로 (비 - G)를 식별하는 아주 작은 deflections로 구성되어 있습니다. 그림. 3 : 탈출의 모든 세 가지 유형에 대한 대기 시간 측정 꼬리가 화나게하다. 프로브 연락처 및 생리적 반응 사이의 시간 7 동물 측정되었다. 장 - 중재 꼬리 - 방방 뜬다는 빠른 아닌 거대한 꼬리가 - 팅겨주는군요보다 훨씬 elicited 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig1.jpg" alt="" /> 그림 1 : 전체 길이 2.5-3.5 cm의 동물 실험에 사용되는 기록 챔버에 대한 예. 접지 와이어는 챔버의 긴 측면에 붙어 목욕 전극에 수직하는 동안 목욕탕 전극은 챔버의 반대편에 붙어 있습니다. 그림 2 : 자극을 세 가지 유형의 1000 F / 초 및 해당 전자 기록에 기록된 단일 비디오 프레임. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2A.jpg" alt="" /> A) 강한 촉각 자극은 동물의 머리에 전달하고 중간 거대한 (MG)는 꼬리 - 플립 중재 elicited했다. 식스 비디오 프레임은 왼쪽에 표시됩니다. 동물을 터치하는 데 사용되는 프로브에서 기록 추적은 회색으로 표시됩니다, 접촉의 요점은 검정색 화살촉으로 표시됩니다. 목욕 전극과 함께 얻은 레코딩 추적이 파란색으로 표시됩니다. 삽입된 페이지는 큰 phasic deflections을 앞에 작은 거대한 축삭의 스파이크를 보여줍니다. 그레이 바는 왼쪽에 표시된 비디오 프레임에 해당합니다. 크레이 피쉬 꼬리의 첫 번째 주목할 움직임은 프로브와 접촉 후 프레임 # 3, 일곱 밀리초에서 발생했습니다. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2B.jpg" alt="" /> B) 강한 촉각 자극이 동물의 꼬리에게 전달되었으며 꼬리 - 플립 중재 측면 거대한 (LG)를 elicited. 식스 비디오 프레임은 왼쪽에 표시됩니다. 동물을 터치하는 데 사용되는 프로브에서 기록 추적은 회색으로 표시됩니다, 접촉의 요점은 검정색 화살촉으로 표시됩니다. 기록 추적과 취득목욕 전극은 빨간색으로 표시됩니다. 삽입된 페이지는 큰 phasic deflections을 앞에 작은 거대한 축삭의 스파이크를 보여줍니다. 그레이 바는 왼쪽에 표시된 비디오 프레임에 해당합니다. 크레이 피쉬 꼬리의 첫 번째 주목할 움직임은 프로브와 접촉 후 프레임 # 3, 여덟 밀리초에서 발생했습니다. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2C.jpg" alt="" /> C) 나약하고 점진적 촉각 자극은 동물의 머리에 배달하고 이외의 거대한 (비 - G) 중재 꼬리 - 플립을 elicited했다. 에이트 비디오 프레임은 왼쪽에 표시됩니다. 동물을 터치하는 데 사용되는 프로브에서 기록 추적은 회색으로 표시됩니다, 접촉의 요점은 검정색 화살촉으로 표시됩니다. 목욕 전극과 함께 얻은 레코딩 추적은 검은색으로 표시됩니다. 추적 거대한 스파이크 가능성이 큰 초기 deflections이 부족하고 많은 작은 진폭의 가능성으로 구성되어 있습니다. 밝은 회색 막대는 왼쪽에 표시된 비디오 프레임에 해당합니다. 크레이 피쉬 꼬리의 첫 번째 주목할 움직임은 프로브와 첫 접촉 후 프레임 # 6, 115 밀리초에서 발생했습니다. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig3.jpg" alt="" /> 그림 3 : 남녀와 유사한 크기 모두 7 가지 동물에 대한 응답 대기 시간 측정 (길이를 의미 ± stdv : 3.2 cm ± 0.2 cm, 텔슨에 연단에서 측정). MG (파란색 막대)와 LG 전자 (적색 막대) 팅겨주는군요 - 꼬리보다 훨씬 짧은 응답 대기 시간을 가지고 꼬리 - 팅겨주는군요 비 - G (검은 막대) 회로에 의해 중재. 의미 및 표준 편차가 표시됩니다. 같은 글자로 바 (한쌍 - 현명한 비교, P는 &lt;0.05에 대한 윌콕슨이 체결 순위 테스트) 서로 크게 다를하지 않았다.

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	<li>Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neural+circuit+activation+and+behavior+during+dominance+hierarchy+formation+in+freely+behaving+crayfish.">Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish.</a> J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).</li><li>Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+and+escape+circuit+activation+in+juvenile+crayfish+during+prey-predator+interactions.">Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions.</a> J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).</li><li>Liden, W. H., Herberholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+neural+responses+of+juvenile+crayfish+to+moving+shadows.J.">Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J.</a> Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).</li><li>Finley, L. A., Macmillan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+field+potentials+during+different+tailflip+behaviours+in+crayfish.">An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish.</a> Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).</li><li>Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+and+other+identified+neurons+of+the+brainstem+escape+network+of+fish.">The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish.</a> Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+voluntary+C-bends+may+be+Mauthner+neuron+initiated.">Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated.</a> J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).</li><li>W&#246;hl, S., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predictive+start+of+hunting+archer+fish:+a+flexible+and+precise+motor+pattern+performed+with+the+kinematics+of+an+escape+C-start.">The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start.</a> J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).</li><li>Fricke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+habituation+in+the+crayfish+due+to+selective+weakening+of+electrical+synapses.">Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses.</a> Brain Res. 322, 139-143 (1984).</li><li>Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+escape+tailflip+in+crayfish+during+backward+walking+and+the+defense+posture.">Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture.</a> J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

단일 신경 세포의 활동이나 신경 회로 활성화 비침습 녹음 억제 동물 얻기 어렵습니다. 방법은 여기에서 설명한이 자연스럽게 동작을 발생 근본적인 신경 활성화의 패턴을 식별하는 수단을 제공합니다. 과거에는, 우리는 성공적으로 영상 위협 3에 대한 응답으로, 더 최근에는 천연 육식 동물 2,에서 공격하는 동안, 사회적 지배 계층 1의 형성 기간 동?...

recordings of neural circuit activation in freely behaving animals

신경 활동 및 대응 행동 표현의 패턴 사이의 관계는 억제 동물 구축하기가 어렵습니다. 전통 비침습 방법은 적어도 부분적으로 억제 연구 과목을 요구하고, 그들은 동시에 활성화된 뉴런 다수의 식별만을 허용합니다. 반면에, 뉴런 또는 개별 뉴런의 작은 ensembles은 크게 감소 준비에서 얻은 단일 셀 녹음을 사용하여 측정할 수 있습니다. 자연 행동의 표현이 억제 및 해부 동물에 제한이 있기 때문에, 그런 행동을 제어하는​​ 기본 신경 메커니즘은 파악하기 어렵습니다. 자, 내가 자유롭게 동물을 행동의 신경 회로 활성을 측정 수있는 비침습 생리 기법을 제시한다. 물이 채워진 챔버 내부 와이어 전극의 쌍을 사용하여 목욕 전극 자연 또는 실험적 evoked 탈출 반응 동안 청소년 왕새우에 의해 생성된 신경 및 근육의 현장 잠재력을 기록합니다. 왕새우 기본 탈출 응답 자극의 시점에서 멀리 동물을 이동하는 꼬리 - 팅겨주는군요 세 가지 유형의에 의해 중재됩니다. 꼬리 - 플립의 각 유형은 자신의 신경 회로에 의해 제어되며 두 빠르고 가장 강력한 탈출 응답은 대형 명령 뉴런의 다른 세트의 활성화가 필요합니다. 행동 관찰와 함께, 목욕 전극 녹음이 뉴런의 모호하지 신분증과 관련된 신경 회로를 허용합니다. 따라서 자연스럽게 발생하는 문제가 근본적인 신경 회로의 활동이 억제 동물과 다른 행동 상황에서 측정할 수 있습니다.

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Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

자유롭게 동물 행동의 신경 활동 패턴의 비침습 측정은 고속 videography와 neurophysiological 레코딩을 결합하여 얻을 수 있습니다.

자유롭게 동물 행동의 신경 회로 활성화의 기록

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.5K 조회수.  University of Maryland. 자유롭게 동물 행동의 신경 활동 패턴의 비침습 측정은 고속 videography와 neurophysiological 레코딩을 결합하여 얻을 수 있습니다.

비디오: Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

성인 Drosophila의 머리에서 전체 셀 레코딩

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

연구

생물학

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

작은 동물의 근육 Engraftment의 역학에 의해 추적 VIVO에서 형광 이미징

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

자유롭게 크레이 피쉬 이동에 마음을 Ventilatory 요금 대책

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

마우스 콘 Photoreceptors에서 단일 셀 석션 레코딩

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

RhoC GTPase 활성화 분석

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

회로 기판과 생물 세포막을 모델링하고 Axons에 전기 신호를 측정 : 학생 실험실 연습을

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

시토크롬의 세포질 Microinjection 의한 Apoptosis의 활성화 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.