Это исследование было поддержано детского диабета исследовательский фонд грант 5-2007-97 (для ЗВП), Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний гранты R01DK064973 (для ЗВП), R01DK48494 (для КТТ), T32DK07074 (с поддержкой SCE), K01DK083552 (для MDK), а также P60DK20595 в Чикагском университете Диабет исследовательский и учебный центр. Содержание несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения NIDDK или НИЗ.

1. Предварительно инъекционных препаратов <ol><li> Быстрый рыбы, по крайней мере за 24 часа до инъекции. Это будет пустая кишечного луковицы (желудок) содержание. Основной протокол поста заключается в передаче рыбы, по их нормальной плотности, на чистую емкость, то удерживать пищу. Для более долгосрочных поста, который требует более жестких условиях (например, для исследования глюкозы в крови), см. дополнительные соображения в обсуждении. </li><li> Подготовка Кортленд солевой раствор (Perry и соавт., 1984). За 100 мл объема, растворите следующие в дистиллированной воде: 725 мг NaCl (124,1 ммоль) 38 мг хлорида калия (5,1 ммоль) 41 мг Na 2 HPO 4 (2,9 мм) 24 мг MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1,9 ммоль) 16 мг CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 ммоль) 100 мг NaHCO 3 (11,9 мм) 4 г поливинилпирролидона (ПВП) (4%) 1000 USP единиц гепарина Фильтр, стерилизуют и хранят при температуре 4 ° C. </li><li> Подготовка микроскопа. <ul><li> Обложка микроскопом базы полиэтиленовой пленкой для защиты в случае разливов. </li><li> Поместите бумажное полотенце, сверху полиэтиленовой пленкой. Операционном столе будет сидеть на вершине бумажным полотенцем. </li><li> Предварительно настроить фокус, просмотрев операционном столе и сосредоточение внимания на губку. </li></ul> Совет: Положите палец на верхнюю часть губки и сосредоточиться на этом. Это позволит избежать или свести к минимуму дальнейшие координационного регулировки один раз рыба находится на операционном столе. </li><li> Взвешивание рыбы. <ul><li> Заполните 500 мл стакан, около 1 / 3 полной рыбой воды объекте. </li><li> Тара баланса. </li><li> Сбор рыбы с помощью сети. Вика избыток воды от сети и рыбу кратко вытирать чистой на бумажных полотенцах. Передача рыбу стакан. </li><li> Взвешивание рыбы. </li><li> Передача рыбу чистить бак. </li><li> Передача каждая весила рыба своим помечены танк. </li><li> Рассчитать объемом впрыска для каждой рыбы на основе рыбы весом. </li></ul></li><li> Подготовка шприца и связанные с ними инструменты для инъекций. Для инъекций, мы рекомендуем 35G скошенной иглой стали и 10 мкл микрошприца NanoFil. Подготовка NanoFil шприц и silflex трубы в соответствии с инструкциями производителя. Важно, чтобы удалить пузырьки из шприца и трубки. После заполнения шприца и трубки, смонтировать шприц на насос, и программа объемом впрыска за первую рыбу. </li><li> Подготовка операционном столе. <ul><li> Вырезать мягкой губкой (например, # L800-D, Jaece Industries), так что это примерно 20 мм в высоту. На плоское лицо, сделать разрез, что составляет 10-15 мм в глубину. Этот разрез корыта, который будет содержать рыбу для инъекций. </li><li> Установить губку в 60 мм чашки Петри. </li><li> Установите чашку Петри с губкой в ​​подходящего размера пипетки крышкой окно кончик. Крышка должна быть достаточно большой для хранения воды для поддержания температуры губкой, но она должна быть достаточно мелко, чтобы не мешать. Мы используем крышку с наконечником P200 окно, которое составляет 11,4 см Д х Ш 7,7 см х 1,5 см D. </li></ul> Эти три пункта собраны вместе (губку в чашку Петри в коробке крышкой) составляют операционный стол. </li><li> Подготовка анестезии. <ul><li> Сделать дробленый лед использованием кубов из рыбы вода объекта. </li></ul> Совет: Используя типичные лотки для льда, это займет 3 лотков, чтобы обезболить 10-12 рыб. <ul><li> Заполните чистое ведро льда с колотым льдом. </li><li> Положите операционном столе в емкости большего объема, таких как 2,4-литровый Rubbermaid контейнер для хранения пищи. </li><li> Налейте немного объекта водой (теплой) во внешний контейнер и хирургический стол. Имейте запас теплой воды объекте неподалеку. </li><li> Положите термометр в наружный контейнер. </li></ul></li></ol> 2. Анестезия, инъекции и восстановление <ol><li> Место анестезии внешний контейнер плюс операционном столе рядом с микроскопом. Есть ведро кусочки льда поблизости. </li><li> Доведите температуру воды до 17 ° С, добавляя кусочки льда. Важно: не опускаться ниже 17 ° С для этого шага. </li><li> Использование сети для передачи рыбу внешний контейнер. </li><li> Медленно добавить кусочки льда в контейнер для доведения температуры до 12 ° C, в течение нескольких минут. </li><li> Монитор поведение рыб: при 17 ° С или чуть ниже, рыба обычно будет распространять свои грудные плавники по горизонтали, вздох, и быстрыми движениями крышечкой. Когда температура падает, рыба будет плавать медленнее и, наконец, перестать плавание. Как хирургической анестезии плоскости приближения, задыхаясь остановится и крышечки движения будут медленными. Рыба готова для инъекций, когда он не реагирует на обрабатывается. Для большинства рыб, 12 ° С является достаточной. Большие рыбы может потребовать холоднее ватер. </li><li> Как требуемой температуры достигается (~ 12 ° С или ниже), нажмите на губку, чтобы насытить его. </li><li> Держите пальцы в холодной воде достаточно, чтобы они не нагреются до рыбы и вывести его из наркоза во время обработки. </li><li> С холодными пальцами, нежно передачи рыбу желоб губкой. Поместите рыбу с живота и жабры в корыто. </li><li> Быстрый перенос операционный стол, чтобы столик микроскопа. </li><li> Рабочие быстро, аккуратно вставить иглу в среднюю линию между брюшных плавников. Игла должна указывать краниально и быть вставлены ближе к тазового пояса, чем до ануса. Вы должны быть в состоянии чувствовать, когда игла находится глубоко, чтобы стенки тела. Inject соответствующий объем и вывести иглу. </li><li> После инъекции немедленно передать рыбу обратно в теплой воде (~ 28,5 ° С) емкость для восстановления, выпуская рыбу из губки на резервуар для воды. Совет: Если рыба не начинает плавание немедленно, помочь ему устранить, слегка закрученной воды к жабрам. </li><li> Проверьте иглы. Иногда масштабы могут быть приложены и должны быть удалены до следующего инъекции. </li><li> Для последующих инъекций, используйте теплую воду объекте принести воды анестезии температуры в камере обратно до 17 ° C до введения следующей рыбы. </li></ol> 3. Представитель Результаты: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Представителю результаты после внутрибрюшинного введения 0,5 мг / г глюкозы или транспортного средства. Рыба не кормили в течение 72 часов перед инъекцией. Ось абсцисс показывает время, после инъекции. Среднее ± SEM.

<ol>
	<li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G., Hoar, W. S., Randall, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+methods+for+the+study+of+gill+physiology.">Perfusion methods for the study of gill physiology.</a> Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. , 325-388 (1984).</li><li>Brown, L. A., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+restraint.">Anesthesia and restraint.</a> Fish Medicine. , 79-90 (1993).</li><li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis.">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li><li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L.">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li><li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish.">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1995).</li><li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A., Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetics.">Anaesthetics.</a> Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. , 1-15 (1994).</li><li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish.">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li><li>Stoskopf, M. K., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery.">Surgery.</a> Fish Medicine. , 91-97 (1993).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Внутрибрюшинной инъекции состоит из пяти шагов: пост, взвешивание, обезболивающее, инъекции, и восстановление. Для каждого шага Есть рекомендации, которые могут обеспечить успех. Успех включает в себя здоровый пациент рыбы, а также хорошие экспериментальные результаты. Пост: 24-часового голодания должен пустые кишечного лампочки. Эта практика взята из рыбы ветеринарной литературе (например, Браун, 1993). Дополнительный пост соображения будут рассмотрены ниже. Долгосрочные поста: Мы обнаружили, что 72-часового голодания требуется для уменьшения глюкозы в крови до исходного уровня перед инъекцией (Эймс и др., 2010.). Мы также обнаружили, что для исследования глюкозы Есть несколько процедур, которые необходимы для обеспечения того, чтобы рыба постился должным образом. Начать с чистого бака (нет мусора на дне). Цистерны должны быть в автономном режиме, четко обозначены как «пост», а в месте, где энтузиазм персонала ухода рыбы не будет их кормить. Оценка внешней среды бак и принять меры по недопущению рыбы от стресса от возмущения, как стресс, как известно, повышение глюкозы в крови (Чавин и Янг, 1970;. Groff и др., 1999). Например, у нас был пост эксперимент, в котором радио выполняться ежедневно на скамейке, что держал аквариумы. Мы обнаружили, что содержание глюкозы в крови был необычайно высоким и пришли к выводу, что рыбы были подчеркнул вибрации. Другой стрессор перенаселенности. Рыба должна храниться при плотности, что соответствует передовой практике животноводства рыбы. Рекомендации см. Марка и соавт. (2002) и Уэстерфилд (1995). У нас были хорошие результаты поста нашу рыбу с плотностью 10-12 рыбу в 9 литров (с 3-мя слоями мрамора занимая часть этого объема). Разделение полов может вызвать стресс, поэтому мы рекомендуем поддержание обоих полов населения во время поста. Это означает, что яйца могут быть заложены, и яйца должны быть поглощенных так что они не будут съедены. Простой способ секвестр яиц для покрытия дна емкости с 2-3 слоями мрамора. Качество воды необходимо поддерживать путем удаления яиц и отходов и заменить около 10-15% резервуар для воды, ежедневно. Для удаления яиц и отходов, несанкционированный работает хорошо. Взвешивания: При взвешивании рыбы, которые не под наркозом, необходимо принять меры, чтобы минимизировать переброски вод из сети в стакан, для обеспечения точного взвешивания. Если сеть (с рыбой) стирается на бумажных полотенцах, большинство избыток воды может быть удален, а вес может быть точно измерена. Это может быть проще, чтобы обезболить рыбу до взвешивания, но мы не проверяли возможные последствия обезболивающим рыбы два раза в один день. Мы протестировали нашу технику путем взвешивания рыбы сначала с сеткой / промокательной метод, а затем повторного взвешивания рыбы после того, как под наркозом, и аккуратно уничтожены сухой. Мы не обнаружили существенной разницы в весе между методами (р = 0,7927, т-тест). Кроме того, мы тестировали ли эта сетка / промокательной метод пострадавших глюкозы в крови, по сравнению с просто передача рыбы в стакан, как только это сетчатая (нет промокательной). Мы не обнаружили существенных различий в крови уровень глюкозы между двумя способами передачи (р = 0,2241, т-тест). Обезболивающий: Химическая наркоза могут быть пригодны для многих исследований. Здесь мы показали, холодная вода анестезии в качестве альтернативы, потому что многие анестетики (в том числе tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), повышение глюкозы в крови. В предыдущих исследованиях, мы определили, что холодная вода не поднимается уровень глюкозы в крови данио (Эймс и соавт., 2010). Для холодной воды анестезии, температура должна быть снижена медленно. Скорость убывания видимому, зависит от размера рыбы, с мелкой рыбы происходит быстрее, чем в более крупных рыб. После инъекции, вы можете заметить, что рыба идет на поправку слишком медленно после наркоза (см. ниже). Это может привести, когда либо, начиная температура слишком низкая, или когда температура снижается слишком быстро. Начальная температура слишком низкая, если рыба изгибы боков при входе в воду. Если начальная температура правильная, рыба будет поддерживать его баланс на начальном этапе. Это будет вращать свои грудные плавники в горизонтальном положении, вздох, и быстрыми движениями крышечкой. Как правило, он будет плавать. При понижении температуры, движения будет уменьшаться, а рыба будет терять равновесие. Хирургических плоскости анестезии достигается, когда рыба может быть обработано не реагируя. Для сохранения рыбы под хирургический наркоз, ваши пальцы должны быть холодными, так что держите их в воде до обработки рыбы. Губка должна быть холодным при той же температуре, как вода, используемая для анестезии рыбы. Важно, чтобы насытить губкой с водой, которая sufficiently холодной для поддержания анестезии раз рыба помещается на него. Инъекция: До проведения инъекций, вы можете рассекать по крайней мере одну рыбу, чтобы получить чувство тела толщиной стенки. Это может помочь вам судить, насколько иглы должен вставить, чтобы войти в брюшную полость. Кроме того, как вы вставить иглу, вы можете почувствовать стенки тела &quot;дать&quot;, когда игла попадает в брюшную полость. Во время инъекции, принимать меры, чтобы сохранить пациенту счастливой. Убедитесь, что губка насыщена правильной температуры холодной воды, чтобы предотвратить возрождение рыбы во время инъекции. Хорошо насыщенной и мягкой губкой важно для минимизации повреждения чешуи и слизи покрытие кожи. Хорошо насыщенный губки также имеет важное значение для поддержания жабры газированные. Мы настоятельно рекомендуем пена губки, перечисленные ниже по материалам. Наконец, когда рыба под наркозом, действовать быстро, чтобы свести к минимуму время, что рыба находится под. Восстановление: рыба должна оправиться от наркоза практически при въезде в теплой воде танк. Если рыба не начинает плавание сразу, мягко водоворот воды к ее жабры, чтобы ускорить восстановление. Если восстановление идет медленно, затем рыба ушла под слишком быстро, и вы должны настроить анестезии процедуры соответствующим образом. Возможных причин медленного восстановления обсуждаются в рамках Обезболивающий.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foam Sponge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jaece Industries</td>
<td>L800-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 mm Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipet tip box lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>not too deep, e.g. 1.5 cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic storage container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>deep, e.g. 7 cm </td>
</tr>
<tr>
<td>Thermometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crushed ice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>made from facility water</td>
</tr>
<tr>
<td>Warm facility water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 liter or more</td>
</tr>
<tr>
<td>500 ml beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for weighing</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoFil syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
<td>NANOFIL</td>
<td>or Hamilton syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>35 gauge needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>NF35BV-2</td>
<td>beveled</td>
</tr>
<tr>
<td>Silflex tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>SILFLEX-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III and Micro4 controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>UMPS-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foot switch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>15867</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cortland salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intraperitoneal injection into adult zebrafish

Удобный метод лечения химически данио является введение реагента в резервуар для воды, где он будет рассмотрен рыбы. Однако этот метод затрудняет знать, сколько реагента поглощается или приняты на рыбу. Некоторые экспериментальные вопросы, особенно связанные с метаболическим исследования, возможно, лучше решать путем предоставления определенного количества для каждой рыбы, в зависимости от веса. Здесь мы представляем метод внутрибрюшинного (IP) раствор для инъекций во взрослых рыбок данио. Инъекция в брюшную полость, сзади тазового пояса. Эта процедура заимствована из ветеринарных методы, используемые для крупной рыбы. Это безопасно, как мы уже наблюдали нулевой смертности. Кроме того, мы видели, кровотечение в месте инъекции только в 5 из 127 инъекций, и в каждом из этих случаев кровотечений была короткой, в течение нескольких секунд, а количество крови потерял было небольшим. Успех такой процедуры требует нежного обращения с рыбой через несколько шагов, в том числе пост, взвешивание, обезболивающее, инъекции, и восстановление. Меры предосторожности необходимы, чтобы минимизировать стресс в течение всей процедуры. Наши меры предосторожности включают использование небольшого объема инъекции и иглы 35G. Мы используем Кортленд солевой раствор, как транспортное средство, которое осмотически сбалансированным для пресноводных рыб. Аэрация жабры сохраняется во время инъекции процедуру сначала привлечения рыбы в хирургической анестезии плоскости, что позволяет медленные движения крышечкой, во-вторых, держа рыбу в корыто в насыщенном водой губкой во время инъекции себя. Мы демонстрируем полезность IP инъекции путем введения глюкозы и мониторинга роста уровня глюкозы крови и его последующее возвращение к нормальной жизни. Как стресс как известно, повышает уровень глюкозы в крови костистых рыб, мы сравниваем уровень глюкозы в крови в автомобиле с впрыском и не вводят взрослым и показать, что процедура не вызывает значительного повышения сахара в крови.

Watch this Scientific Journal Video about Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish at JoVE.com

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Мы демонстрируем внутрибрюшинного введения во взрослых рыбок данио. Мы используем 10 мкл NanoFil микрошприца контролируется Micro4 контроллер и UltraMicroPump III. Эта демонстрация включает в себя использование холодной воды в качестве анестезирующего средства.

Внутрибрюшинного введения в взрослых данио рерио

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

56.8K Views.  The University of Chicago. Мы демонстрируем внутрибрюшинного введения во взрослых рыбок данио. Мы используем 10 мкл NanoFil микрошприца контролируется Micro4 контроллер и UltraMicroPump III. Эта демонстрация включает в себя использование холодной воды в качестве анестезирующего средства.

Video: Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Трансплантация почки Всего мозга у взрослых данио рерио

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Инъекция дсРНК в женский А. Комары aegypti

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Данио рерио желудочков мозга инъекций

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Ретро-орбитальный инъекций у взрослых данио рерио

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Препарирование органов у взрослых данио рерио

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Прямая доставка MIF Morpholinos Into данио рерио отоцист путем инъекций и Электропорация влияет на внутреннее развитие уха

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Трансплантация клеток непосредственно в почках взрослых данио рерио

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Препарирование взрослых почек данио рерио

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Retina взрослых данио рерио

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Восстанавливающий взрослых данио рерио хвостового плавника

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...