Diese Arbeit wurde teilweise durch American Heart Association gewähren 0950118G.to MC-W unterstützt.

1. Vorbereitung anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierten magnetischen Beads (Dynabeads) <ol><li> Bereiten Sie 0,1% BSA in PBS durch Mischen von 50 mg BSA in 50 ml PBS mit einem Vortex bis BSA auflöst. Sterilisieren durch Filtration durch 0,22 um Spritzenfilter. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> In den TC Kapuze, Transfer 200 ul gut resuspendiert Schaf-anti-Ratte IgG Dynabeads in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und waschen Sie die Perlen: Mount Tube auf MPC und lassen Sie sich für etwa 1 min bis die Perlen in das Sediment zu ermöglichen. Saugen Sie den Überstand, entfernen Sie den Schlauch vom MPC und Resuspendieren der Beads in 1 ml steriler 0,1% BSA / PBS. Pipette auf und ab, um Perlen zu resuspendieren. </li><li> Wiederholen Sie waschen drei weitere Male, für insgesamt vier Waschgänge. </li><li> Entfernen Rohr aus MPC und Resuspendieren der Beads in 500 ul 0,1% BSA / PBS. </li><li> Fügen Sie 10 ul Ratte anti-Maus-PECAM-1 (CD-31) Antikörper gegen das Rohr. </li><li> Tumble über Nacht bei 4 ° C im Kühlraum oder 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Perlen mit steriler 0,1% BSA / PBS, wie in Schritt 1.2 viermal beschrieben. </li><li> Entfernen Rohr aus MPC und Resuspendieren der Beads in 200 ul 0,1% BSA / PBS. Shop anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierte Dynabeads bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. </li></ol> 2. Isolating Maus pulmonalen Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen , Bevor Sie fortfahren mit dem Gewebe Aufreinigungsprotokolls ist IACUC Ausschusses Genehmigung des Verfahrens erforderlich. <ol><li> Bereiten Sie die folgenden: <ul><li> 15 ml von 1 mg / ml C / D-Lösung in DMEM. Filter mit 0,22 um Spritzenfilter und warm bis 37 ° C. </li><li> 50 ml konische Röhrchen mit 15 ml DMEM, speichern auf Eis </li><li> Isolation Media (IM) mit 20% FBS und 1x Penicillin / Streptomycin in DMEM </li><li> 2% Gelatine. Mix 2 g Rinder-Gelatine mit 100 ml Wasser dd, Autoklaven 15 Minuten und lagern bei 4 ° C. Warm bis 37 ° C vor der Beschichtung TC Flaschen zu verflüssigen. </li></ul></li><li> Anesthetize drei 6-8 Tage alte Jungtiere mit einer IP-Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Prüfen Sie die Wirksamkeit der Anästhesie und sezieren Tiere eins nach dem anderen, wie folgt: Pin Welpen an Bord, genießen die Haut mit 70% Ethanol und entfernen Sie die Haut vor den Brustbereich mit einer sterilen Schere Dissektion. Excise den Brustkorb zu Lungen freizulegen. </li><li> Aseptisch Verbrauchsteuern einzelnen Lungenlappen, man aufpassen, nicht zu sezieren die Bronchien und sichtbare Bindegewebe in der Lunge. Kombinieren Sie alle Lunge in eiskaltem DMEM. Euthanize die Welpen. </li><li> Arbeiten in der TC Kapuze, entfernen Lungenlappen aus DMEM, in einem 100 mm TC Schüssel und saugen überschüssiges DMEM. </li><li> Mit einer sterilen Schere, Hackfleisch das Gewebe fein schneiden ~ 100 mal. Transfer zum 15 ml warmes C / D-Lösung für die enzymatische Verdauung. Inkubieren 45 Minuten bei 37 ° C auf einem Rotator. </li><li> In den TC Haube absaugen verdaute Gewebe Suspension in eine 20 ml Spritze mit 14 g Kanüle befestigt und verreiben Klumpen in einer einzigen Zellsuspension, mindestens 12 mal. </li><li> Pass das Gewebe Suspension durch ein 70 um Zellsieb und waschen Sie das Sieb mit 15 ml IM, um die Verdauung zu stoppen. </li><li> Pellet Zellsuspension durch Zentrifugation bei 400x g für 5 Minuten. </li><li> Saugen Sie den Überstand und Pellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS. </li><li> Transfer Zellsuspension 5 ml Rundboden-Röhrchen aus Polystyrol und fügen 22,5 ul anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierte Dynabeads. Tumble bei Raumtemperatur für 12 Minuten. </li><li> Coat einer T75-Kolben mit 2 ml 2% Gelatine und saugen überschüssige Gelatine. Lassen Gelatine innerhalb der TC Haube für etwa 30 Minuten vor dem Beschichten Zellen trocknen. </li><li> Nach bead Inkubation abgeschlossen ist (Schritt 2,10), Zellsuspension in drei gleich große Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt und Halterung an der MPC. </li><li> Wenn die Perlen haben sedimentiert mit dem MPC (~ 1 min), sammeln Überstand entfernen Rohr von MPC, waschen Perlen mit ca. 1 ml 0,1% BSA / PBS und dann remount auf der MPC. </li><li> Wiederholen Sie waschen viermal (insgesamt 5 Wäschen) </li><li> Resuspendieren Perlen in 1 ml VascuLife mit ENGS-Mv Leben Factors Kit und 1x Penicillin / Streptomycin (VL) pro Röhrchen gut mischen. </li><li> Platte auf einem vorbeschichteten T75 Kolben und bringen Gesamtvolumen in jedem Kolben bis 10 ml mit VL. </li><li> Ändern Medien am folgenden Tag, lassen Sie 1 Tag voller Wachstum und ändern Sie dann die Hälfte der Medien jeden zweiten Tag. Wenn die Zellen&gt; 70-80% konfluent oder mehr (in der Regel nach 3-4 Tagen der Kultur) sind, können sie mit anti-ICAM-2 Dynabeads sortiert werden. </li></ol> 3. Vorbereitung anti-ICAM-2-Antikörper-konjugierte Dynabeads <ol><li> Anti-ICAM-2-Antikörper-konjugierte Dynabeads werden verwendet, um weiter zu reinigen Zellen, die mit anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierte Dynabeads und kultiviert, bis konfluenten ausgewählt wurden. Dieses Verfahren wird durchgeführt, wie für anti-PECAM-1-Antikörper-konjugierte Dynabeads (1, oben) beschrieben, außer dass anti-Maus-ICAM-2 (CD-102)-Antikörper anstelle von anti-PECAM-1-Antikörper verwendet. </li><li> Anti-ICAM-2-Antikörper-konjugierte Dynabeads können bei 4 ° C gelagert werden biszu 1 Monat. </li></ol> 4. Sortieren Mauslunge Endothelzellen mit anti-ICAM-2 Dynabeads <ol><li> Coat T75 Zellkulturflasche mit 2% Gelatine. </li><li> Saugen Sie das Medium aus dem konfluenten T75 Kolben mit Zellen und wäscht mit 8 ml PBS. </li><li> Absaugen PBS, 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA und lassen Zellen lösen (ca. 5 Minuten). Tippen Sie auf Flaschen leicht zu Hilfe Abnehmen. </li><li> Wenn die Zellen abgelöst haben, fügen Sie 2 ml IM zu Trypsin und kratzen Zellen zu hemmen, um alle verbleibenden adhärenten Zellen zu lösen. Transfer Zellsuspension auf eine 15 ml Tube und Spin-Down für 5 min bei 400x g </li><li> Saugen Sie die Medien und resuspendieren Zellpellet in 2 ml 0,1% BSA / PBS. </li><li> Transfer in ein 5 ml Polystyrol Rundboden-Röhrchen und fügt 10 ul anti-ICAM-2 Dynabeads. Tumble für 12 Minuten bei RT. </li><li> Split Zellsuspension in zwei 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und montieren auf MPC. </li><li> Saugen Sie den Überstand nach Perlen für 1 Minute haben eingehalten werden. Entfernen Rohre von MPC und resuspendieren jedes Röhrchen in 1 ml 0,1% BSA / PBS. Montieren Sie auf MPC. </li><li> Wiederholen Sie waschen viermal (insgesamt 5 Wäschen). </li><li> Resuspendieren jedes Röhrchen mit 1 ml VL und führen Sie eine Zellzahl. </li><li> Platte Zellen bei 250-350K-Zellen pro T25 Kolben und / oder 750K-1 Millionen Zellen pro T75 Kolben. </li><li> Bringt Volumen 5 ml VL in T25 Flaschen und 10 ml in T75 Flaschen. </li><li> Ändern Medien jeden zweiten Tag. Die Zellen können für Experimente verwendet werden, wenn Kultur erreicht etwa 80% Konfluenz, in der Regel in 2-3 Tagen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse In der Regel nach 6-7 Tagen ab dem ersten Vorbereitung der Zellen, sind wir in der Lage, etwa 1,2 zu erhalten - 1,5 x 10 6 pulmonalen Endothelzellen aus drei 6-8 Tage alte Jungtiere. Zellen zeigen typische &quot;Kopfsteinpflaster&quot; Morphologie unter Lichtmikroskopie und zeigen, VE-Cadherin (CD144)-Färbung bei Zell-Zell-Verbindungen, die charakteristisch für Endothelzellen (Abbildung 1) ist. Mehrheit der MLECs ausdrückliche VE-Cadherin und VEGFR2 wie durch FACS-Analyse (Abbildung 2) gezeigt. Normalerweise benutzen wir sie für Experimente innerhalb von zwei Wochen nach der ersten MLEC Isolation. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Mikroskopische Analyse von konfluenten MLEC Monoschicht. (A) Lichtmikroskopische Bild zeigt Kopfsteinpflaster Morphologie der kultivierten Zellen typisch für Endothelzellen. Uniform runde Gebilde in den perinukleären Bereich von vielen Zellen befindet sich die magnetischen Beads für MLEC Isolierung verwendet. (B) Endothelial-spezifische VE-Cadherin an der Zell-Zell-Verbindungen wie gezeigt mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie lokalisiert. Bar ist repräsentativ für 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2 FACS-Analyse von kultivierten MLECs mit Antikörpern, die spezifisch für Endothel-spezifischen Markern versehen:. VE-Cadherin (CD144) oder VEGFR2, wie angeklagt, von Phycoerythrin-konjugierten sekundären Antikörper folgte, bestätigt endothelial Identität der isolierten MLECs. Rote Linie zeigt Isotyp-spezifische Steuerung, zeigt grüne Linie anti-VE-Cadherin-oder Anti-VEGFR2 - spezifischen IgG-.

<ol>
	<li>Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+endothelial+cell+in+tissue+culture.">The human endothelial cell in tissue culture.</a> Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).</li><li>Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+murine+heart+and+lung+endothelial+cells+for+in+vitro+model+systems.">Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems.</a> Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+I.+Structure,+function,+and+mechanisms.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. 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Commun. 281, 827-834 (2001).</li><li>Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+murine+inguinal+and+epididymal+adipose+tissues.">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues.</a> J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).</li><li>Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. 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A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+heart-derived+endothelial+and+smooth+muscle+cell+cultures:+isolation,+cloning+and+characterization.">Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization.</a> Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).</li><li>Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture.">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li><li>Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C., Vansluys, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+angiogenesis,+endothelial+migration,+proliferation,+and+MAPK+signaling+in+Rap1b-deficient+mice.">Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice.</a> Blood. 111, 2647-2656 (2008).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch Medical College of Wisconsin IACUC Ausschuss unter-Protokoll AUA # 00001206 eingestellt durchgeführt.

Mikrovaskulären ECs haben sich als nützliches Modell in vielen Bereichen der vaskulären Biologie und sind vermutlich mehrere physiologisch relevanten Studie (zB Angiogenese) als weitgehend untersucht HUVECs 3. Zuvor wurde berichtet, dass mikrovaskuläre Endothelzellen aus Niere, Herz, Haut, Netzhaut, Gehirn, Gliome, Fettgewebe und auch Lunge 2, 4-7, 10, 11 erzielt werden kann. Allerdings ist eine konsistente und zuverlässige Methode zur Isolierung von mikrovaskulären ECs weiterhin erforderlich. Das hier vorgestellte Verfahren ist eine Modifikation eines bereits veröffentlichten Protokoll 2, es unterscheidet sich von den meisten veröffentlichten Verfahren durch die Nutzung der Welpen anstelle von erwachsenen Tieren. Dies ist entscheidend für die Isolierung Erfolg als Zellen von jungen Tieren eine höhere Verbreitung Potential haben und Kulturen aus ihren Geweben stammen in der Regel höhere Anzahl der Zellen zu erhalten. Eine Woche alten Tiere scheinen optimal zu sein, aber jüngere Mäuse (4 Tage alten) können ebenfalls verwendet werden. Auch können höhere oder niedrigere Anzahl von Jungtieren bei Bedarf verwendet werden, wie wir schon bei der Isolierung MLECs von einem Welpen haben erfolgreich. Doch während die Skalierung nach oben oder unten die Isolierung Prozess muss Zelle Plattierungsdichte bleiben unverändert, wie dies auch von entscheidender Bedeutung für die Zellproliferation. Die 2-Schritt-Reinigungsverfahren MLECs mit magnetischen Beads konjugiert erste anti-PECAM-1 und als anti-ICAM-2-Antikörper ist viel effizienter bei der Gewinnung von reinem EG Kulturen als die zuvor beschriebenen einstufigen Reinigungsverfahren. Dieses Protokoll entfällt die Notwendigkeit, sehr aufwändige manuelle Techniken, Gradientenzentrifugation und weniger effizient FACS-Sortierung für das Verwerfen kontaminierenden Zellen wie Fibroblasten, Blutzellen und Zellen der glatten Muskulatur zu verwenden. Die daraus resultierende MLEC Bevölkerung kann für die in vitro Analyse der angiogenen Reaktion, Gefäßpermeabilität und Leukozyten-Transmigration, Wundheilung sowie biochemische Untersuchung von Signalwegen verwendet werden. Falls erforderlich, kann MLECs auf verschiedenen Oberflächen wie Fibronektin oder Gelatine-beschichtete Deckgläser für Immunfluoreszenz oder Elektroden-Arrays für die trans-endothelialen Widerstand (TER) Messungen beschichtet werden. Die erhaltenen Ergebnisse können direkt an die Phänotypen in vivo, was besonders wichtig ist im Zusammenhang mit der wachsenden Zahl von Knockout und transgene Mauslinien beobachtet verglichen werden. Die erfolgreiche Umsetzung dieses Verfahrens zur in vitro Analyse von zellulären Mechanismen, die Mängel in vivo zu beobachten, wurde bereits 12 dargestellt.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15032-13</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11223-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>14G cannula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>1482516N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309661</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>A7030-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>anti-rat IgG Dynabeads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>110.35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Particle Concentrator (MPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>123-21D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>553369</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>553326</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase/Dispase (C/D)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11097113001</td>
<td>100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro Mediatech</td>
<td>10-013-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Skin Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>#G9391-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lifeline Cell Technology</td>
<td>LL0004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.05% Trypsin/EDTA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>25-052-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer 70 &mu;m nylon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tissue culture flask 75 cm2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TPP</td>
<td>90076</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice

Endothelzellen stellen einen nützlichen Forschung Modell in vielen Bereichen der vaskulären Biologie. Seit der ersten Isolierung 1, haben menschliche Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) gezeigt werden, bequem, leicht zu beschaffen und Kultur, und damit sind die am häufigsten untersuchten Endothelzellen. Doch für die Forschung an Prozessen wie Angiogenese, Permeabilität oder viele andere konzentriert, sind mikrovaskuläre Endothelzellen (ECs) eine viel physiologisch relevante Modell-2-Studie. Darüber hinaus ECs isoliert von Knockout-Mäusen ein nützliches Werkzeug für die Analyse von Protein-Funktion ex vivo. Verschiedene Ansätze zu isolieren und Kultur mikrovaskulären ECs unterschiedlicher Herkunft sind bisher 3-7 berichtet worden, aber konsequente Isolierung und Kultivierung von reinem ECs immer noch ein großes technisches Problem in vielen Laboratorien. Hier bieten wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll auf eine zuverlässige und relativ einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung Mauslunge Endothelzellen (MLECs). Bei diesem Ansatz Lungengewebe von 6 erhalten - bis 8-Tage alte Jungtiere zunächst in Stücke geschnitten wird, verdaut mit Kollagenase / Dispase (C / D)-Lösung und verteilt mechanisch in den Single-Zellsuspension. MLECS aus Zellsuspension unter Verwendung einer positiven Selektion mit anti-PECAM-1-Antikörper, konjugiert mit Dynabeads mit Hilfe eines Magnetic Particle Concentrator (MPC). Solche gereinigten Zellen auf Gelatine-beschichteten Gewebekultur (TC) Schalen kultiviert, bis sie konfluent geworden. Zu diesem Zeitpunkt werden die Zellen weiter gereinigt mit Dynabeads gekoppelt anti-ICAM-2 Antikörpers. MLECs mit diesem Protokoll erhaltenen weisen einen Pflasterstein Phänotyp, wie visualisiert Phasenkontrast-Lichtmikroskopie und ihre endothelialen Phänotyp bestätigt wurde mittels FACS-Analyse mit anti-VE-Cadherin-8 und anti-VEGFR2 9 Antikörper und Immunfluoreszenzfärbung von VE-Cadherin. In unseren Händen, das Zwei-Schritt-Isolierung Verfahren konsistent und zuverlässig liefert eine reine Population von MLECs, die weiter kultiviert werden können. Diese Methode ermöglicht es Forschern, die Vorteile der wachsenden Zahl von Knockout-und transgenen Mäusen direkt in vivo Studien korrelieren mit den Ergebnissen von in vitro Experimenten an isolierten MLECs durchgeführt zu nehmen und so dazu beitragen, die molekularen Mechanismen der vaskulären Phänotypen in vivo beobachtet zu offenbaren.

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Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von murinen pulmonalen Endothelzellen. Dieses Verfahren umfasst mechanische und enzymatische Lungengewebe Dissoziation sowie eine 2-Schritt-Reinigungsverfahren mit anti-PECAM-1 und anti-ICAM-2-Antikörper, konjugiert an magnetische Kügelchen, die eine reine Endothelzellen Bevölkerung meist mikrovaskuläre Herkunft produziert.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

47.0K Aufrufe.  BloodCenter of Wisconsin. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von murinen pulmonalen Endothelzellen. Dieses Verfahren umfasst mechanische und enzymatische Lungengewebe Dissoziation sowie eine 2-Schritt-Reinigungsverfahren mit anti-PECAM-1 und anti-ICAM-2-Antikörper, konjugiert an magnetische Kügelchen, die eine reine Endothelzellen Bevölkerung meist mikrovaskuläre Herkunft produziert.

Serie: Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Isolation der Lungenarterie glatten Muskelzellen aus neugeborenen Mäusen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Generation und Kultur der Blut Outgrowth Endothelzellen aus menschlichen peripheren Blut-

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Isolation und Kultur der primären Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...