1. El crecimiento de lino bajo condiciones de inducción. <ol><li> 5 &quot;macetas llenas de tierra y firme. </li><li> Tres semillas por maceta se plantan ¼ de pulgada de profundidad y el suelo firme sobre las semillas. </li><li> Las macetas se regaron con 100 ml luego de las soluciones de nutrientes apropiados <ol><li> La no inducción de control (C) las condiciones de uso una fuerza de 1 / 10 de Miracle-Gro cada semana. La condición de alta de nutrientes (NPK tratamiento) había Milagro toda su fuerza crece aplica semanalmente. Bajos de nutrientes - las plantas sólo había agua corriente aplicada a lo largo de su crecimiento. (Durrant 1971, Cullis, 1980). </li></ol></li><li> Las plantas se cultivan bajo la luz natural durante el verano. Durante el invierno se cultivan bajo las luces de sodio con un 16 / 8 horas de luz / oscuridad ciclo. </li><li> A intervalos semanales hojas y meristemas se recogen. </li><li> El material vegetal es rápido congelado en nitrógeno líquido. </li></ol> Resultados Los tres genotipos crecen en diferentes tipos de relación en función de las condiciones (Figura 1). Por lo tanto, bajo condiciones de control de la línea Pl crece mejor con L está más vigoroso que el S (Figura 1a). En bajos nutrientes (agua), S crece mejor que L o Pl (Figura 1b). En nutrientes de alta (NPK) L crece mejor que Pl que sólo crece un poco mejor que S (Figura 1c). Una comparación entre cada una de las líneas de crecimiento en los tres diferentes tratamientos se muestra en la Figura 1 d - f. Pl crece mejor en condiciones control (Figura 1d), en el mejor L en nutrientes de alto (Figura 1e) y S de manera similar en ambos nutrientes de alta y las condiciones de control (Figura 1 F). Estos datos muestran que las tres líneas se pueden diferenciar en función de su crecimiento en los tres ambientes. Es de notar que Pl crece mejor en las condiciones de control, mientras que L crece mejor en las condiciones NPK (en las que se indujo). S crece más o menos igual en las tres condiciones, es decir, no es capaz de tomar ventaja de la mejora de las condiciones de nutrientes, pero es más capaz de crecer en condiciones de nutrientes muy baja. Los parámetros de crecimiento que son relevantes para la diferenciación de las plantas incluyen la altura de la planta (y asociado con esta longitud de los entrenudos, la que es la distancia entre cada hoja), el tamaño de la hoja y el grado de ramificación. Pl. de las condiciones de control de la planta es alto con ramas y las hojas son verdes grandes y oscuros. En bajos nutrientes de la planta es muy corto, la distancia entre cada hoja también es muy corto y las hojas son de color verde pequeño y ligero. Las hojas en la punta son un verde más oscuro que los niveles inferiores de la madre. En virtud de los nutrientes de la planta alta es muy similar al que en las condiciones de control, excepto que tanto el tallo principal y las ramas laterales son más cortas que en las plantas de control. Para los grandes genotroph las plantas son muy similares a los de Pl, excepto que el crecimiento más vigoroso en menos de nutrientes de alta. Una vez más en nutrientes bajo la planta es muy pequeña y tiene hojas de color verde. El genotroph S crece de manera similar en los tres entornos, aunque las hojas son de color verde claro en los nutrientes de baja. Sin embargo, en las condiciones de nutrientes bajo la genotroph S es mucho más fuerte que cualquiera de las líneas L o Pl. 2. ARN y las extracciones de ADN a partir de los meristemas de lino y las hojas se hacen por separado. La Roche ARN total kit de preparación se utilizó para la extracción de ARN y el ADN de Qiagen DNeasy Planta de preparación kit se utilizó para la extracción de ADN. La extracción de RNA <ol><li> 3 meristemos además de algunas hojas se mueven alrededor de criovial de almacenamiento en un tubo eppendorf y se colocaron en nitrógeno líquido hasta que esté listo para ser molido. </li><li> Arena estéril se añade al tubo y el tejido es un terreno con un micropestle hasta bien. </li><li> Lisis 400 ul / tampón de unión de Roche ARN total kit de preparación, se añade y el tejido es más terreno hasta que no haya grumos visibles. </li><li> De la muestra se agita durante 15 segundos para ayudar a la lisis y luego girar durante 1 minuto a 13.000 rpm para recoger residuos de arena y cualquier. </li><li> Sobrenadante se añade a girar la columna y el resto de las instrucciones del ARN kit de preparación son seguidas como se indica. </li></ol> DNAsa tratamiento <ol><li> 1 / 10 volumen de muestra de RNA de 10X buffer DNAsa se añade. </li><li> 30 unidades de DNAsa se añade y la reacción se incuba a 37 ° C durante 30 min y 70 ° C durante 5 min. </li></ol> La transcripción inversa <ol><li> Applied Biosystems ARN a ADNc kit se utiliza según las instrucciones, la reacción se incuba a 37 ° C durante 1 hora y 95 ° C durante 5 minutos. </li></ol> El cDNA se utiliza en la PCR o por qPCR qPCR qPCR se realizó utilizando un ABI Paso Uno de los sistemas. Todos los ensayos se realizaron por triplicado en cada ejecución. El gen de la actina se utilizó como control el número de copias comola mejor limpieza de genes disponibles. <ol><li> El primer par adecuado se añadió a cada tubo en 1μl. </li><li> El cDNA se diluyó a la concentración apropiada y 9μl añadido a cada tubo </li><li> 10μl de la energía 2x SYBR Green PCR MasterMix (ABI) y se añadió a cada tubo </li><li> El programa de amplificación programa: <ul><li> 10 minutos a 95 ° C </li><li> 40 ciclos de 15 segundos a 95 ° C, 1 min a 60 ° C </li></ul> Paso de desnaturalización térmica para verificar la especificidad de amplificación </li><li> Los niveles relativos de expresión se determina por el valor de 2 (CTunknown - CTactin). </li></ol> Preparación del ADN <ol><li> Buffer AP1 de Qiagen DNeasy planta de preparación de ADN kit se añade a 6 hojas con arena estéril en un tubo de microcentrífuga. El tejido se tritura con micropestle hasta que no haya grumos visibles. </li><li> Las instrucciones del juego son seguidas como se indica. </li></ol> Resultados Amplificación por PCR a partir del ADN aislado de las hojas en varias posiciones a lo largo de la madre demuestra que la aparición de la LIS-1 se produce cuando las plantas están creciendo bajo condiciones de inducción (4). Los resultados qPCR muestran que la presencia de la LIS-1 (u otros cambios genómicos asociados con la inducción) afecta a la expresión de genes en las inmediaciones de la LIS-1 (Figura 2). Los seis genes se muestra en la Figura 2 son expresados ​​diferencialmente en Pl y S con cuatro tienen mayor expresión en el PL (sin LIS-1) y dos con una mayor expresión de S (que tiene LIS-1). Grupo 1 y 2 son los dos genes más cercano al punto de inserción de la LIS-1. La expresión de estos genes en el s genotroph grandes (que ha tenido cambios inducidos pero no tiene LIS-1) y la expresión bajo diferentes condiciones de crecimiento va a ser necesaria para determinar una relación causal entre el LIS-1 y los cambios de expresión. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Pl, L y S crecido bajo tres regímenes diferentes de nutrientes. Paneles de un - control, b - c bajo y nutrientes - NPK. d - Pl, e - S, f - L. paneles d - f de izquierda a derecha: bajos nutrientes, el control y NPK. D - Pl, e - L, M - S. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="Figura 2 pulgar" /> Figura 2. La expresión de genes alrededor del punto de inserción de la LIS-1. Gen 1 (inhibidor del crecimiento) es inmediatamente 5 &#39;del gen LIS1 y 2 (Kip relacionados dependiente de ciclina Identificación del inhibidor de la quinasa 3 &quot;de la LIS-1. Los genes de otros a lo largo del mismo andamio (~ 500kb) construido a partir de la secuencia completa del genoma de lino. Por favor, <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">haga clic aquí para ver una figura más grande</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Amplificaciones PCR del DNA extraído de las hojas de las plantas individuales de Stormont Cirrus crecido en condiciones de baja de nutrientes. Los productos de PCR fueron separados en un 2% de agarosa-TBE gel. El sitio uninserted se muestra en el panel, los dos extremos de la página insertada se muestran en los paneles B y C. Las muestras de hojas 1 a 6 fueron aislados en intervalos de una semana con una muestra de que las primeras después de la siembra.

<ol>
	<li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum.">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax.">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li><li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmentally+induced+adaptive+(?)+insertion+event+in+flax.">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li></ol>

Lino parece que tiene un genoma intrínsecamente inestable. Un número de variedades comerciales de las fibras de lino rápidamente se convierten en no-uniforme cuando se cultiva por unas pocas generaciones. Observaciones mismo no parece válido para el variedades de aceite de linaza. Por lo tanto, no parece haber una asociación entre la selección de calidad de la fibra y la inestabilidad del genoma. El medio ambiente inducida cambios heredables en la linaza fueron identificados a través de la investigación agronómica de las observaciones del crecimiento de la cosecha de la fibra. Estas observaciones repetibles de determinadas variaciones fenotípicas y genómica plantea la cuestión de cómo el estrés ambiental puede influir en el conjunto de reordenamientos genómicos que pueden ocurrir. La aparición repetida de LIS-1 en respuesta a ambientes particulares es compatible con esta mutación está directa o indirectamente seleccionado. El crecimiento de las líneas inducida por diversos tratamientos también indica un mejor desempeño en las condiciones inducir pertinentes. Los cambios en la expresión también se asocia con la presencia de LIS-1 indica de nuevo que esta inserción afectar al rendimiento de la planta. La presentación de vídeo ofrece un foro para la observación de los cambios en la planta fenotípica de una manera imposible de transmitir a través de material impreso tradicional.

<ul><li> Las semillas de lino de la variedad original de Stormont Cirrus denota Pl y genotrophs la L y S. </li><li> 5 &quot;ollas </li><li> tierra para macetas </li><li> Miracle-Gro </li><li> invernadero </li><li> Luces de alta presión de sodio </li><li> Nitrógeno líquido </li><li> Mortero y morteros </li><li> Micropestles y tubos de microcentrífuga </li><li> Termociclador </li><li> Gel de agarosa al equipo de electroforesis </li><li> Configuración de la imagen digital </li><li> StepOne qPCR módulo </li><li> Qiagen DNeasy la planta de preparación de ADN kit </li><li> Applied Biosystems ARN kit de cDNA </li><li> Roche ARN total kit de preparación </li></ul>

environmentally induced heritable changes in flax

Algunas variedades de lino responden al estrés de nutrientes mediante la modificación de su genoma y estas modificaciones pueden ser heredadas a través de muchas generaciones. También se asocia con estos cambios genómicos son heredables 1,2 variaciones fenotípicas. La variedad de lino Stormont Cirrus (Pl) cuando se cultivan bajo tres condiciones diferentes de nutrientes puede seguir siendo inducible (en las condiciones de control), o ser modificado de forma estable ya sea a la genotroph grande o pequeño por el crecimiento en condiciones de nutrientes de alta o baja, respectivamente. Las líneas que resultan del crecimiento inicial en cada una de estas condiciones parece que crecen mejor cuando se cultivan en las mismas condiciones en las generaciones posteriores, sobre todo la línea de Pl. crece mejor en el tratamiento de control que indica que las plantas que crecen en los alimentos, tanto de alta y baja se encuentran bajo el estrés. Uno de los cambios genómicos asociados con la inducción de cambios heredables es la aparición de un elemento de inserción (LIS-1) 3, 4, mientras que las plantas están creciendo bajo el estrés de nutrientes. Con respecto a este evento de inserción, el lino variedad Stormont Cirrus (Pl) cuando se cultivan bajo tres condiciones diferentes de nutrientes puede permanecer sin cambios (en las condiciones de control), que la inserción aparece en todas las plantas (en nutrientes bajo) y han transmitido esta a la siguiente generación, o la inserción (o partes de él), pero no parece ser transmitido de generación en generación (en los alimentos de alto) 4. La frecuencia de la aparición de esta inserción indica que está bajo la selección positiva, que también es consistente con la respuesta de crecimiento en las generaciones posteriores. Hojas o meristemas cosechan en las distintas etapas de crecimiento se utilizan para el ADN y el aislamiento de ARN. El ARN se utiliza para identificar las variaciones en la expresión asociada con el crecimiento de diversos ambientes y / o L a presencia / ausencia de LIS-1. El ADN aislado se utiliza para identificar las plantas en las que la inserción se ha producido.

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Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

El cultivo de algunas variedades de lino en los resultados de estrés de nutrientes en la variación genómica dentro de un subconjunto del genoma y la variación fenotípica. Un complejo de inserción en un sitio específico se asocia con un crecimiento bajo diferentes regímenes de nutrientes y con los cambios en la expresión génica en torno a este sitio.

Inducidas por factores ambientales cambios heredables en lino

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

environmentally-induced-heritable-changes-in-flax

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K vistas.  Case Western Reserve University. El cultivo de algunas variedades de lino en los resultados de estrés de nutrientes en la variación genómica dentro de un subconjunto del genoma y la variación fenotípica. Un complejo de inserción en un sitio específico se asocia con un crecimiento bajo diferentes regímenes de nutrientes y con los cambios en la expresión génica en torno a este sitio.

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un ensayo de conducta para medir la capacidad de respuesta de pez cebra a cambios en la intensidad de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Investigación

Biología

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Métodos de una sola molécula para vigilar los cambios en las propiedades elásticas bicapa

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Los cambios en la morfología de la glándula mamaria y el riesgo de cáncer de mama en ratas

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Seguimiento de los cambios de equilibrio en la estructura del ARN por &quot;peroxidación&quot; y &quot;oxidativo&quot; Huella de radicales hidroxilo

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

La reprogramación de células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando el vector retroviral con las buenas prácticas agrarias

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Medición inducida glutatión-Alimentación Respuesta en Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Floral-Dip transformación de lino (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Para generar transgénicos progenies con una alta tasa de Transformación

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Seguimiento de cambios inducidos por fármacos en los receptores post-internalización Trata de Análisis Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...