1. Das Wachstum der Flachs unter induzierenden Bedingungen. <ol><li> 5 &quot;Töpfe mit Erde gefüllt und bestätigt. </li><li> Drei Samen pro Topf gepflanzt ¼ Zoll tief und der Boden gefestigt über die Samen. </li><li> Die Töpfe werden dann mit 100 ml der entsprechenden Nährlösungen getränkt <ol><li> Die nicht-induzierende Kontrolle (C) Bedingungen mit einem 1 / 10 th Stärke Miracle-Gro jede Woche. Der hohe Nährstoffgehalt Zustand (NPK-Behandlung) war voller Stärke Miracle Wachsen angewandt wöchentlich. Low Nährstoff - Pflanzen hatten nur Leitungswasser während ihres Wachstums eingesetzt. (Durrant 1971, Cullis 1980). </li></ol></li><li> Die Pflanzen sind unter natürlichem Licht im Sommer gewachsen. Im Winter sind sie unter Natrium-Lampen mit einer 16 / 8 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus entwickelt. </li><li> In wöchentlichen Abständen Blätter und Meristeme gesammelt werden. </li><li> Das Pflanzenmaterial ist schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren. </li></ol> Ergebnisse Die drei Genotypen wachsen bei unterschiedlichen relativen Preise abhängig von den Bedingungen (Abbildung 1). Deshalb unter Kontrollbedingungen der Pl Linie wächst am besten mit L als kräftiger als S (Abbildung 1a). Bei schwachem Nährstoffe (Wasser), wächst S besser als entweder L oder Pl (Abb. 1b). Unter hohem Nährstoffgehalt (NPK) L wächst besser als Pl, die wächst nur geringfügig besser als S (Abbildung 1c). Ein Vergleich zwischen den einzelnen Linien unter den drei unterschiedlichen Behandlungen gewachsen ist in Abbildung 1 d gezeigt - f. Pl wächst am besten unter Kontrollbedingungen (Abbildung 1d), L am besten unter hohen Nährstoffgehalt (Abbildung 1e) und S ebenfalls sowohl unter hohen Nährstoff-und Kontrollbedingungen (Abbildung 1f). Diese Daten zeigen, dass die drei Linien auf der Grundlage ihres Wachstums unter den drei Umgebungen unterschieden werden können. Zu beachten ist, dass Pl besten wächst unter der Kontrolle Bedingungen während L wächst am besten unter der NPK Bedingungen (unter denen es induziert wurde). S wächst etwa die gleiche in allen drei Bedingungen, das heißt, es ist nicht in der Lage, die Vorteile der verbesserten Nährstoff-Bedingungen stattfinden, sondern ist besser in der Lage, unter sehr nährstoffarmen Bedingungen wachsen. Das Wachstum Parameter, die für die Differenzierung der Pflanzen sind auch die Höhe der Pflanze (und damit verbunden die Internodienlänge, dass der Abstand zwischen jedem Blatt ist), das Blatt Größe und dem Grad der Verzweigung. Für Pl unter Kontrollbedingungen der Anlage ist groß mit Niederlassungen und die Blätter sind groß und dunkelgrün. Bei schwachem Nährstoffe der Pflanze sehr kurz ist, ist der Abstand zwischen jedem Blatt auch sehr kurz und die Blätter sind klein und hellgrün. Die Blätter an der Spitze sind dunkler grün als die weiter unten den Stamm. Unter hohem Nährstoffe der Pflanze sehr ähnlich sieht, dass unter Kontrolle, außer dass beide den Hauptstamm und die Seitentriebe kürzer als in der Kontroll-Pflanzen sind. Für die große genotroph die Pflanzen sehen sich sehr ähnlich zu denen von Pl, außer dass das stärkste Wachstum in unter hohem Nährstoffe. Auch bei geringen Nährstoffe der Pflanze ist sehr kurz und hat hellgrüne Blätter. Die S genotroph wächst ähnlich wie in allen drei Umgebungen, obwohl die Blätter leichter grün sind unter den niedrigen Nährstoffe. Doch in den nährstoffarmen Bedingungen der S genotroph ist viel kräftiger als die beiden Pl oder L-Linien. 2. RNA-und DNA-Extraktion aus Flachs Meristeme und Blätter sind separat erfolgen. Die Roche-Gesamt-RNA prep Kit wurde für die RNA-Extraktion und die Qiagen DNeasy Plant DNA Prep Kit wurde für die DNA-Extraktionen verwendet. RNA-Extraktion <ol><li> 3 Meristeme sowie einige umliegende Blätter sind von der Lagerung Kryoröhrchen in Eppendorf-Röhrchen bewegt und platziert in flüssigem Stickstoff bis zur fertig geschliffen werden. </li><li> Sterile Sand ist zu Röhrchen gegeben und Gewebe unter Verwendung einer Mikropistill bis gut. </li><li> 400 ul Lyse / Bindungspuffer aus Roche Gesamt-RNA prep Kit zugegeben und Gewebe wird weiter an Boden, bis keine Klumpen zu sehen sind. </li><li> Die Probe wird gevortext, 15 Sek. lang um Lyse Hilfe und dann versponnen für 1 min bei 13.000 rpm, um Sand und alle Ablagerungen sammeln. </li><li> Der Überstand wird hinzugefügt, um Spalte Spin und den Rest der RNA prep Kit Anweisungen befolgt werden, wie verwiesen. </li></ol> DNAse Behandlung <ol><li> 1 / 10 RNA-Probe von 10X DNAse-Puffer zugegeben. </li><li> 30 Einheiten DNAse zugegeben und die Reaktion wird bei 37 ° C für 30 min und 70 ° C für 5 min. </li></ol> Reverse Transkription <ol><li> Applied Biosystems RNA zu cDNA-Kit ist nach Richtungen, Reaktion bei 37 ° C für 1 Stunde und 95 ° C für 5 Minuten. Verwendet </li></ol> Die cDNA wird dann in PCR oder für die qPCR eingesetzt qPCR qPCR wurde mit einem ABI Step One-System. Alle Assays wurden in dreifacher Ausführung auf jedem Lauf durchgeführt. Die Aktin-Gen wurde als Kopienzahl Kontrolle verwendetdie besten verfügbaren Housekeeping-Gen. <ol><li> Die entsprechende Primerpaar wurde zu jedem Röhrchen in 1μl aufgenommen. </li><li> Die cDNA wurde auf die geeignete Konzentration und 9μl verdünnt hinzugefügt, um jedes Rohr </li><li> 10 &amp;mgr; l der 2x Power SYBR Green PCR Mastermix (ABI) und wurde in jedes Röhrchen gegeben </li><li> Das Programm Verstärkung Programm war: <ul><li> 10 Minuten bei 95 ° C </li><li> 40 Zyklen von 15sec bei 95 ° C, 1 min bei 60 ° C </li></ul> Thermische Denaturierung der Amplifikation Spezifität zu überprüfen </li><li> Die relative Expression wurden durch den Wert von 2 (- CTactin CTunknown) bestimmt. </li></ol> DNA-Präparation <ol><li> Buffer AP1 von Qiagen DNeasy Plant DNA Prep Kit ist auf 6 Blätter mit sterilem Sand in einem Mikrozentrifugenröhrchen aufgenommen. Das Gewebe wird mit Mikropistill Boden, bis keine Klumpen zu sehen sind. </li><li> Das Kit Anweisungen befolgt werden, wie verwiesen. </li></ol> Ergebnisse PCR-Amplifikation von DNA aus Blättern an verschiedenen Positionen entlang der Stammzellen isoliert zeigt, dass das Erscheinungsbild der LIS-1, während die Pflanzen unter induzierenden Bedingungen (4) wachsen auftritt. Der qPCR Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit von LIS-1 (oder anderen genomischen Veränderungen mit der Induktion verbunden) die Expression von Genen beeinflusst in unmittelbarer Nähe der LIS-1 (Abbildung 2). Die sechs Gene in Abbildung 2 dargestellt sind alle unterschiedlich in Pl und S mit vier mit höheren Ausdruck in PL (ohne LIS-1) und zwei mit höheren Ausdruck in S (was LIS-1 haben) ausgedrückt. Panel 1 und 2 sind die beiden Gene am nächsten an der Einfügemarke der LIS-1. Die Expression dieser Gene s in den großen genotroph (die Änderungen bewogen hatte, aber nicht LIS-1) und die Expression unter verschiedenen Wachstumsbedingungen wird benötigt, um eine kausale Beziehung zwischen LIS-1 und der Gesichtsausdruck verändert sich zu bestimmen. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Pl, L und S unter drei verschiedenen Nährstoffen Regimes geworden. Panels a - Kontrolle, b - geringe Nährstoffe und c - NPK. d - Pl, e - S, f - L. Panels d - f von links nach rechts: low Nährstoffe, Kontrolle und NPK. D - Pl, e - L, F - S. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="Abbildung 2 Daumen" /> Abbildung 2. Genexpression um die Ansatzstelle des LIS-1. Gene 1 (Inhibitor des Wachstums) wird sofort 5 &#39;LIS1 und das Gen 2 (Kip-bezogene Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitor-ID 3 &quot;des LIS-1. Die anderen Gene sind alle auf dem gleichen Gerüst (~ 500kb) aus dem eingebauten komplette Flachs Genomsequenz. Bitte <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">klicken Sie hier, um eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. PCR Amplifikationen von DNA aus einzelnen Blättern von Pflanzen von Stormont Cirrus unter nährstoffarmen Bedingungen angebaut extrahiert. Die PCR-Produkte wurden auf einem 2% Agarose-TBE-Gel aufgetrennt. Die uninserted Standort Gremium wird gezeigt, sind die beiden Enden des eingefügten Seiten in Panels b und c gezeigt Blattproben von 1 bis 6 wurden in wöchentlichen Abständen mit Probe 1 wird frühestens nach der Aussaat isoliert.

<ol>
	<li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum.">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax.">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li><li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmentally+induced+adaptive+(?)+insertion+event+in+flax.">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li></ol>

Flachs scheint ein instabiles Genom haben. Eine Reihe von kommerziellen Faserflachs Sorten schnell ungleichmäßig, wenn für ein paar Generationen gewachsen. Die gleichen Beobachtungen scheinen nicht zu halten für die Öl-Flachssorten wahr. Deshalb scheint es einen Zusammenhang zwischen der Wahl für Faserqualität und Genominstabilität werden. Die umweltbedingten vererbbare Veränderungen in Flachs wurden ursprünglich durch die Untersuchung der agronomischen Beobachtungen des Wachstums der Faser Ernte identifiziert. Diese wiederholbare Beobachtungen von spezifischen phänotypischen und genomische Varianten stellt sich die Frage, wie ökologische Belastung kann die Suite von genomischen Umlagerungen, die auftreten können beeinflussen. Das wiederholte Auftreten von LIS-1 in Reaktion auf bestimmte Umgebungen steht im Einklang mit dieser Mutation, die direkt oder indirekt gewählt. Das Wachstum der Linien durch verschiedene Behandlungen induzierten zeigt auch eine verbesserte Leistung im Rahmen der einschlägigen induzierenden Bedingungen. Die Veränderungen in der Expression auch mit der Anwesenheit von LIS-1 wieder verbunden zeigt, dass diese Insertion-Anlage die Leistung beeinträchtigen. Die Video-Präsentation bietet ein Forum zur Beobachtung der Pflanzen phänotypische Veränderungen in einer Art und Weise unmöglich, durch traditionelle gedruckte Material zu vermitteln.

<ul><li> Leinsamen der ursprünglichen Stormont Cirrus Vielfalt bezeichnet Pl und die genotrophs L und S. </li><li> 5 &quot;Töpfe </li><li> Blumenerde </li><li> Miracle-Gro </li><li> Gewächshaus </li><li> Natriumdampf-Hochdrucklampen Lichter </li><li> Flüssiger Stickstoff </li><li> Mörser und Stößel </li><li> Micropestles und Mikrozentrifugenröhrchen </li><li> Thermocycler </li><li> Agarosegelelektrophorese Ausrüstung </li><li> Digital Imaging-Setup </li><li> StepOne qPCR-Modul </li><li> Qiagen DNeasy Plant DNA Prep Kit </li><li> Applied Biosystems RNA zu cDNA-Kit </li><li> Roche Gesamt-RNA prep kit </li></ul>

environmentally induced heritable changes in flax

Einige Flachs Sorten Nährstoff Stress reagieren, indem Sie ihr Genom und diese Änderungen können über viele Generationen vererbt werden. Auch bei diesen genomischen Veränderungen verbunden sind vererbbare phänotypische Variationen 1,2. Der Flachs Vielzahl Stormont Cirrus (Pl), wenn sie unter drei verschiedenen Nährstoffen Bedingungen angebaut werden entweder bleiben induzierbarer (unter der Kontrolle Bedingungen), oder werden stabil geändert, um die große oder kleine genotroph durch das Wachstum bei hohen oder niedrigen Nährstoff-Bedingungen jeweils entweder. Die Linien, die sich aus der anfänglichen Wachstum unter jeder dieser Bedingungen scheinen besser wachsen, wenn unter den gleichen Bedingungen in den nachfolgenden Generationen gewachsen, vor allem die Pl Linie wächst am besten unter der Kontrolle der Behandlung darauf hinweist, dass die Pflanzen sowohl unter den hohen und niedrigen Nährstoffe unter sich Stress. Einer der genomischen Veränderungen, die mit der Induktion von vererbbaren Veränderungen verbunden sind, ist das Auftreten von ein Einsatzelement (LIS-1) 3, 4, während die Pflanzen unter den Nährstoff Stress wächst. Im Hinblick auf diese Insertion, der Flachs Vielzahl Stormont Cirrus (Pl), wenn sie unter drei verschiedenen Nährstoffen Bedingungen angebaut werden entweder unverändert bleiben (unter der Kontrolle Bedingungen), die Einfügung in alle Pflanzen erscheinen (bei geringen Nährstoffen) und haben diese übertragen an die nächste Generation, oder das Einfügen (oder Teile davon) erscheinen, aber nicht über Generationen (unter hohem Nährstoffe) 4 übertragen werden. Die Häufigkeit des Auftretens dieser Einfügung zeigt an, dass es unter positiver Selektion, die auch im Einklang mit dem Wachstum Reaktion in den nachfolgenden Generationen ist. Blätter oder Meristeme in den verschiedenen Stadien des Wachstums geerntet werden für die DNA-und RNA-Isolierung verwendet. Die RNA wird verwendet, um Unterschiede in der Expression mit den verschiedenen Wachstums-Umgebungen und / oder t er Anwesenheit / Abwesenheit von LIS-1 assoziiert zu identifizieren. Die isolierte DNA wird verwendet, um die Anlagen, in denen das Einsetzen aufgetreten identifizieren.

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Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Wachsende etwas Flachs Sorten unter Nährstoff-Stress führt zu genomischen Variation innerhalb einer Teilmenge der Genom-und phänotypische Variation. Eine komplexe Insertion an einem bestimmten Ort ist mit einem Wachstum unter verschiedenen Nährstoffe Regimes und mit Veränderungen in der Genexpression um diese Site verknüpft ist.

Umweltfreundliche Induced vererbbare Veränderungen in Flax

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

environmentally-induced-heritable-changes-in-flax

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Aufrufe.  Case Western Reserve University. Wachsende etwas Flachs Sorten unter Nährstoff-Stress führt zu genomischen Variation innerhalb einer Teilmenge der Genom-und phänotypische Variation. Eine komplexe Insertion an einem bestimmten Ort ist mit einem Wachstum unter verschiedenen Nährstoffe Regimes und mit Veränderungen in der Genexpression um diese Site verknüpft ist.

Serie: Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Forschung

Biologie

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Änderungen der Brustdrüsen Morphologie und Breast Cancer Risk in Ratten

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Überwachung Equilibrium Veränderungen im RNA-Struktur von &quot;peroxidativer&quot; und &quot;Oxidativer &#39;Hydroxylradikal Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Floral-Dip Transformation von Flachs (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;), Um Transgene Progenies mit hoher Umwandlungsrate generieren

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...