1. Crescimento de linho em condições induzir. <ol><li> 5 &quot;panelas são preenchidos com terra e compactado. </li><li> Três sementes por vaso são plantadas ¼ de polegada de profundidade eo solo firmado sobre as sementes. </li><li> Os potes são, então, regada com 100ml de soluções adequadas de nutrientes <ol><li> A não-indução de controle (C) condições de usar uma força de 1 / 10 º Miracle-Gro a cada semana. A condição de alta de nutrientes (NPK tratamento) tinha plena força Miracle Grow aplicados semanalmente. Baixo de nutrientes - plantas só tinha água da torneira aplicadas em todo o seu crescimento. (Durrant 1971, Cullis, 1980). </li></ol></li><li> As plantas são cultivadas sob luz natural durante o verão. Durante o inverno, são cultivadas sob luzes de sódio com um 16 / 8 horas de ciclo claro / escuro. </li><li> Em intervalos semanais, folhas e meristemas são coletados. </li><li> O material vegetal é rápido congelados em nitrogênio líquido. </li></ol> Resultados Os três genótipos diferentes crescer a taxas relativas, dependendo das condições (Figura 1). Portanto, sob condições de controle da linha Pl cresce melhor com L sendo mais vigoroso que o S (Figura 1a). Em nutrientes baixa (água), S cresce melhor do que qualquer um L ou Pl (Figura 1b). Em nutrientes de alta (NPK) L cresce melhor do Pl que só cresce ligeiramente melhor do que S (Figura 1c). A comparação entre cada uma das linhas cultivadas sob os três tratamentos diferentes é mostrado na Figura 1 d - f. Pl cresce melhor em condições de controle (Figura 1d), o melhor L em nutrientes de alta (Figura 1e) e S de forma semelhante em ambos os nutrientes de alta e as condições de controle (Figura 1f). Estes dados mostram que as três linhas podem ser diferenciados com base no seu crescimento em três ambientes. De nota é que Pl cresce melhor nas condições de controle enquanto L cresce melhor nas condições NPK (em que foi induzida). S cresce quase o mesmo em todas as três condições, isto é, não é capaz de tirar proveito da melhoria das condições de nutrientes, mas é mais capaz de crescer sob condições muito baixo de nutrientes. Os parâmetros de crescimento que são relevantes para a diferenciação das plantas incluem a altura da planta (e associado a este comprimento de entrenós, isto é a distância entre cada folha), o tamanho da folha e do grau de ramificação. Para Pl sob condições de controle da planta é de altura com ramos e as folhas são verdes grandes e escuros. De acordo com os nutrientes da planta baixa é muito curto, a distância entre cada folha é também muito curto e as folhas são verde pequeno e leve. As folhas estão na ponta verde mais escuro do que as mais abaixo do tronco. Em nutrientes de alta da planta é muito parecido com que, sob condições de controle, exceto que ambos tronco principal e os brotos laterais são mais curtos do que nas plantas controle. Para o genotroph grandes as plantas são muito semelhantes aos de Pl exceto que o crescimento mais vigoroso em nutrientes sob alta. Novamente sob os nutrientes da planta baixa é muito pequena e tem folhas verde claro. O genotroph S cresce de forma semelhante em todos os três ambientes, embora as folhas são verde claro com os nutrientes baixa. No entanto, em condições de baixa de nutrientes do genotroph S é muito mais vigorosa do que qualquer uma das linhas ou Pl L. 2. RNA e DNA extrações de meristemas de linho e as folhas são feitas separadamente. A Roche total de RNA prep kit foi usado para a extração de RNA ea Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit foi usado para a extração de DNA. Extração de RNA <ol><li> 3 meristemas além de algumas folhas em redor são movidos de cryovial armazenamento em tubos eppendorf e colocados em nitrogênio líquido até estar pronto para ser moída. </li><li> Areia estéril é adicionado ao tubo e tecidos é terra usando um micropistilo até bem. </li><li> Lise 400 ul / buffer de ligação da Roche total de RNA prep kit é adicionado e tecidos é um terreno ainda mais até que não haja aglomerações são visíveis. </li><li> Amostra é agitadas por 15 segundos para ajudar lise e, em seguida, girou durante 1 min a 13.000 rpm para recolher areia e quaisquer detritos. </li><li> Sobrenadante é adicionado a girar coluna eo restante das instruções RNA prep kit são seguidas as instruções. </li></ol> DNAse tratamento <ol><li> 10/01 volume de amostra de RNA de tampão DNAse 10X é adicionado. </li><li> 30 unidades de DNAse é adicionado ea reação é incubada a 37 ° C por 30 min e 70 ° C por 5 min. </li></ol> Transcrição Reversa <ol><li> Applied Biosystems RNA para cDNA kit é usado como por direções, a reação incubados a 37 ° C por 1 hora e 95 ° C por 5 minutos. </li></ol> O cDNA é então usada na PCR ou para qPCR qPCR qPCR foi realizada utilizando um Passo ABI Um sistema. Todos os ensaios foram realizados em triplicata em cada execução. Do gene da actina foi usado como um controle do número de cópias comoo gene housekeeping melhor disponível. <ol><li> O par de primers apropriados foi adicionado a cada tubo em 1μl. </li><li> O cDNA foi diluído para a concentração adequada e 9μl adicionado a cada tubo </li><li> 10μl do Poder 2x SYBR Green PCR MasterMix (ABI) e foi adicionado a cada tubo </li><li> O programa de amplificação programa foi: <ul><li> 10 minutos a 95 ° C </li><li> 40 ciclos de 15s a 95 ° C, 1 min a 60 ° C </li></ul> Etapa de desnaturação térmica para verificar a especificidade de amplificação </li><li> Os níveis de expressão relativa foi determinada pelo valor de 2 (CTunknown - CTactin). </li></ol> Preparação de DNA <ol><li> Tampão AP1 da Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit é adicionado a 6 folhas com areia estéril em um tubo de microcentrífuga. O tecido é chão com micropistilo até que não haja aglomerações são visíveis. </li><li> As instruções do kit são seguidas as instruções. </li></ol> Resultados A amplificação do DNA isolado a partir de folhas em várias posições ao longo do tronco demonstra que o aparecimento do LIS-1 ocorre quando as plantas estão crescendo em condições indução (4). Os resultados mostram que a qPCR presença de LIS-1 (ou outras alterações genômicas associadas com a indução) afeta a expressão de genes nas imediações da LIS-1 (Figura 2). Os seis genes mostrado na Figura 2 são diferencialmente expressos em Pl e S com quatro ter maior expressão no PL (sem LIS-1) e dois com maior expressão em S (que tem LIS-1). Painel 1 e 2 são os dois genes mais próximo do ponto de inserção de LIS-1. A expressão destes genes s na genotroph grande (que teve mudanças induzidas, mas não tem LIS-1) ea expressão sob diferentes condições de crescimento serão necessários para determinar qualquer relação causal entre LIS-1 e as mudanças de expressão. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Pl, L e S cultivadas sob três diferentes regimes de nutrientes. Painéis a - controle, b - nutrientes baixo e c - NPK. d - Pl, e - S, f - Painéis L. d - f, da esquerda para a direita: baixo nutrientes, controle e NPK. D - Pl, e - L, F - S. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="Figura 2 polegar" /> Figura expressão gênica 2. Torno do ponto de inserção do LIS-1. Gene 1 (Inibidor de crescimento) é imediatamente 5 &#39;para LIs1 eo gene 2 (Kip relacionados ciclina-dependente ID inibidor da quinase 3 &quot;da LIS-1. Os genes que as outras pessoas ao longo do mesmo andaime (~ 500kb) construído a partir do sequência completa do genoma de linho. Por favor, <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">clique aqui para ver uma figura maior</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Amplificações PCR de DNA extraído de folhas individuais de plantas de Stormont Cirrus cultivadas sob condições de baixa de nutrientes. Os produtos de PCR foram separados em 2% gel agarose-TBE. O site uninserted é mostrado no painel, as duas extremidades do site inseridos são mostrados em painéis b e c. Amostras de folhas 1-6 foram isoladas em intervalos semanais, com a amostra 1 sendo o mais antigo após a semeadura.

<ol>
	<li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum.">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax.">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li><li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmentally+induced+adaptive+(?)+insertion+event+in+flax.">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Linho parece ter um genoma inerentemente instável. Um certo número de variedades de linho de fibra comercial rapidamente se tornar não-uniforme, quando cultivada por algumas gerações. As mesmas observações não parecem verdadeiras para as variedades de linho de óleo. Portanto, parece haver uma associação entre a seleção para qualidade da fibra e da instabilidade do genoma. O ambientalmente induzida mudanças hereditárias em linho foram originalmente identificados através da investigação das observações agronômicas do crescimento da safra de fibra. Estas observações específicas repetível de variações fenotípicas e genômica levanta a questão de como o estresse ambiental pode influenciar o conjunto de rearranjos genômicos que podem ocorrer. O aparecimento repetido de LIS-1 em resposta a ambientes particulares é consistente com essa mutação ser direta ou indiretamente selecionado. O crescimento das linhas induzidas por vários tratamentos também indica um melhor desempenho nas condições indução relevantes. As mudanças na expressão também associada com a presença de LIS-1 novamente indica que essa inserção afetar o desempenho da planta. A apresentação de vídeo oferece um fórum para observar as mudanças fenotípicas da planta de uma forma impossível de transmitir através de material impresso tradicional.

<ul><li> Sementes de linho do original variedade Cirrus Stormont denotado Pl e genotrophs L e S. </li><li> 5 &quot;panelas </li><li> envasamento solo </li><li> Miracle-Gro </li><li> estufa </li><li> Lâmpadas de sódio de alta pressão </li><li> Nitrogênio líquido </li><li> Argamassa e pilões </li><li> Micropestles e tubos de microcentrífuga </li><li> Termociclador </li><li> Agarose equipamentos de eletroforese em gel </li><li> Imagem digital de instalação </li><li> StepOne qPCR módulo </li><li> Qiagen DNeasy Plant DNA prep kit </li><li> Applied Biosystems RNA para cDNA kit </li><li> Roche total de RNA prep kit </li></ul>

environmentally induced heritable changes in flax

Algumas variedades de linho respondem ao estresse de nutrientes, modificando seu genoma e estas modificações podem ser herdadas por várias gerações. Também associados a essas alterações genômicas são hereditárias 1,2 variações fenotípicas. A variedade de linho Stormont Cirrus (Pl) quando cultivados sob três diferentes condições de nutrientes pode permanecer induzível (nas condições de controle), ou tornar-se estavelmente modificado para tanto o genotroph grande ou pequena pelo crescimento sob condições de alta ou baixa de nutrientes, respectivamente. As linhas resultantes do crescimento inicial em cada uma dessas condições parecem crescer melhor quando cultivadas sob as mesmas condições nas gerações posteriores, nomeadamente a linha Pl cresce melhor sob o tratamento controle, indicando que as plantas crescem sob ambos os nutrientes de alta e baixa estão sob stress. Uma das alterações genômicas que estão associados com a indução de mudanças hereditárias é o aparecimento de um elemento de inserção (LIS-1) 3, 4, enquanto as plantas estão crescendo sob o estresse de nutrientes. Com relação a este evento de inserção, a variedade de linho Stormont Cirrus (Pl) quando cultivados sob três diferentes condições de nutrientes pode permanecer inalterada (nas condições de controle), têm a inserção aparecem em todas as plantas (em nutrientes baixa) e ter esse transmitida para a próxima geração, ou a inserção (ou partes dela) aparecer, mas não são transmitidos através das gerações (com nutrientes de alta) 4. A frequência do aparecimento dessa inserção indica que ele está sob seleção positiva, que também é consistente com a resposta de crescimento em gerações subseqüentes. Folhas ou meristemas colhidas em vários estágios de crescimento são usadas para DNA e RNA de isolamento. O RNA é usado para identificar a variação na expressão associada ao crescimento ambientes diversos e / ou t ele presença / ausência de LIS-1. O DNA isolado é usado para identificar as plantas em que a inserção ocorreu.

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Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Crescendo algumas variedades de linho com resultados de tensão de nutrientes em variações genômicas dentro de um subconjunto do genoma e da variação fenotípica. A inserção complexo em um local específico está associado com o crescimento sob vários regimes de nutrientes e com mudanças na expressão gênica em torno deste site.

Ambientalmente induzido mudanças hereditárias em Linho

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

environmentally-induced-heritable-changes-in-flax

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K visualizações.  Case Western Reserve University. Crescendo algumas variedades de linho com resultados de tensão de nutrientes em variações genômicas dentro de um subconjunto do genoma e da variação fenotípica. A inserção complexo em um local específico está associado com o crescimento sob vários regimes de nutrientes e com mudanças na expressão gênica em torno deste site.

Vídeo: Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biologia

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Métodos única molécula para acompanhar as alterações nas propriedades elásticas bicamada

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Alterações na morfologia da glândula mamária e risco de câncer de mama em ratos

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Monitoramento de mudanças na estrutura Equilibrium RNA por &quot;peroxidativo&quot; e &quot;oxidativo&quot; Footprinting Radical Hidroxila

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Floral-Dip Transformação de linho (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Para gerar Transgênicos Progênies com uma alta taxa de Transformação

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...