WPS è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal National Institutes of Health (CA129359), la Susan G. Komen per la Fondazione Cure (BCTR0706967), il Dipartimento della Difesa (BC084561), e la Seidman Cancer Center, mentre MKW è stata sostenuta da un borsa di studio della American Cancer Society (PF-09-120-01). Supporto aggiuntivo per questo lavoro sono state fornite dal Centro Case for Imaging Research, il Comprehensive Cancer Center, causa (P30 CA43703), e il Centro Fibrosi Cistica (P30 DK027651).

1. Espressione stabile di CMV-Driven Luciferase Renilla <ol><li> Trasfezione e selezione di una popolazione stabile clonale è il metodo preferito per l&#39;espressione di questo reporter Renilla luciferasi. Questo approccio derivano più coerente e uniforme espressione Renilla luciferasi dopo la successiva introduzione di ulteriori costrutti reporter secondarie (ad esempio, lucciola luciferasi o proteine ​​fluorescenti). </li><li> Trasfettare cellule maligne di interesse con la luciferasi espressione Renilla vettore di codifica, come pcDNA3.1-Hygro o un altro plasmide ospitare un marcatore selezionabile. </li><li> Seguendo trasfezione, posizionare i trasfettanti in una concentrazione di antibiotico ottimizzato per diversi giorni-a-settimana per facilitare l&#39;isolamento di singole colonie, che vengono successivamente isolati individualmente e sottocoltura. </li><li> Selezionare ≥ 10 singoli Renilla luciferasi che esprimono colonie per monitorare il grado di espressione Renilla. </li><li&gt; Colonie esprimono quantità elevate di Renilla luciferasi sono successivamente sottoposti ad analisi funzionale ad assicurare che i (i) caratteristiche fisiopatologiche della loro controparti parentali vengono mantenuti, e (ii) valori di espressione Renilla non deviare o cambiano nel tempo. Questi passaggi sono assolutamente essenziali per evitare di isolare e studiare le varianti clonali / devianti, e per convalidare una corretta integrazione del costrutto Renilla nel genoma. </li><li> Una volta che un trasfettante stabile è isolato e verificato, si può rimuovere la pressione selettiva ed essere certi che l&#39;espressione della luciferasi Renilla resta costante per lunghi periodi di tempo sia in vitro che in vivo. </li></ol> 2. Espressione, selezione e verifica funzionale del promotore inducibile-Driven Firefly luciferasi <ol><li> Subclonare il promotore di interesse in una PGL4-plasmide reporter luciferasi ospitare un marcatore selezionabile (ad esempio, puromycin) che è distinto da quello utilizzato per selezionare per l&#39;espressione stabile Renilla (ad esempio, igromicina). </li><li> Trasfettare cellule maligne come al punto I, e successivamente selezionare per una popolazione stabile policlonale di lucciola luciferasi-cellule che esprimono. Dato che la posizione in cui un gene relazione integra nel genoma può suscitare effetti errate sulla sua espressione e la regolazione, si raccomanda vivamente di selezionare per le popolazioni policlonali di lucciola luciferasi-cellule che esprimono al contrario di popolazioni clonali per garantire che (i) l&#39;espressione del gene reporter riflette più accuratamente quella del gene endogeno in cellule parentali, e (ii) effetti di integrazione su genica sono mediati e diminuita attraverso la popolazione cellulare eterogenea. </li><li> Le cellule maligne ingegnerizzate ad esprimere in modo stabile sia Renilla e luciferases lucciola sono indicate collettivamente come due cellule giornalista bioluminescenti, o cellule DBR. </li><li> Utilizzo &lt;tradizionaleem&gt; in vitro saggi cellulari reporter gene luciferasi, verificare che le celle DBR regolare l&#39;espressione di luciferasi di lucciola, positivamente o negativamente, in modo concorde con quella osservata in cellule parentali transitoriamente trasfettate con tali vettori. Allo stesso modo, verificare che CMV-driven espressione di Renilla non è regolata da stimoli cellulari diversi o condizioni di trattamento. </li><li> Per fare ciò, cultura DBR e cellule parentali in piastre da 24 pozzetti, e successivamente transientemente co-trasfettare cellule parentali con l&#39;originale CMV-Renilla e promotore-lucciola costrutti usati per generare cellule DBR. </li><li> In seguito, trattare DBR e transfettate cellule parentali con fattori o agenti farmacologici noti per regolare il promotore di interesse, e successivamente quantificare lucciola e luminescenza Renilla utilizzando il Kit dual Luciferase Assay Promega. </li></ol> 3. Stabilire 4T1 tumori mammari primari <ol><li> Metastatiche cellule di carcinoma mammario che 4T1ri trovato ad agenti patogeni roditori mancanza avventiziale sono stati progettati per esprimere stabilmente un CMV-driven luciferasi Renilla (pcDNA3.1-CMV-Renilla luciferasi-igrometrico) e un SBE-driven lucciola luciferasi (pGL4.2-SBE-lucciola luciferasi-puro) come descritto sopra. Attecchimento ortotopico di questi risultati cellule del cancro della mammella nella formazione di metastasi spontanee principalmente nei polmoni. </li><li> Cellule 4T1 non dovrebbe essere permesso di raggiungere la confluenza durante la loro propagazione nei sistemi di tessuti tradizionali a 2 dimensioni della cultura, e dovrebbero essere diversi passaggi il giorno prima del loro inoculazione in vivo. </li><li> Cellule 4T1 dovrebbe essere dissociate mediante tripsinizzazione, accuratamente lavati in terreni di coltura, e diluito in PBS ad una concentrazione di 2x10 5 cellule / ml e immediatamente conservati in ghiaccio. </li><li> Femmina BALB / c (4-6 settimane) devono essere anestetizzati con una dose di induzione del 3% isoflurano e mantenuto sotto anestesia ad una dose di 1% isoflurano. Preparare il sito di iniezione con il tampone70% di alcol isopropilico. Utilizzando una pinza, afferrare e sollevare delicatamente il 4 pad inguinale mammaria. Con cautela, inserire un ago calibro 27,5 lato smussata e iniettare nel tappetino grasso mammario direttamente sotto il capezzolo, facendo attenzione a non spingere l&#39;ago nella cavità addominale. Rilasciare la ghiandola e iniettare lentamente 50 ml di sospensione cellulare (1x10 4 cellule) nel tampone grasso mammario. </li></ol> 4. Iniziale Imaging doppio luminescente <ol><li> Immediatamente dopo l&#39;attecchimento cellule 4T1 sul tampone grasso mammario e mentre i topi sono ancora anestetizzati, iniettare 100 pl di Coelenterazine RediJect nella vena caudale laterale. Questa è la concentrazione del substrato ottimale raccomandato dal fornitore e meglio tollerata dall&#39;animale. </li><li> Porre immediatamente il mouse all&#39;interno del cono naso isoflurano all&#39;interno del sistema-200 IVIS immagini e acquisire un&#39;immagine 0,5-1 minuti luminescente. Efficienza tra iniezione e acquisizione dell&#39;immagine è molto importante, in quanto il segnaleper la luciferasi Renilla scende precipitosamente ~ 30 secondi dopo l&#39;iniezione. Posizionare il mouse di nuovo nella sua gabbia e permettono di recuperare per ≥ 1 ora, che assicura che qualsiasi residuo di segnale luciferasi Renilla ha dissipato e che il mouse ha pienamente recuperato dalla anestesia. </li><li> Somministrare 150 mg / kg di D-luciferina sale di potassio mediante iniezione IP e attendere 5 minuti. Questa è la concentrazione ottimale di D-luciferina, che fornisce un segnale stabile luminescente per 5-15 minuti dopo l&#39;iniezione in animali da esperimento. Anestetizzare il mouse usando isoflourane e sostituire nel IVIS-200, avendo cura di posizionare l&#39;animale in una posizione molto simile, relative all&#39;acquisizione originale Renilla. L&#39;intensità complessiva di questo segnale lucciola dipenderà l&#39;attività del promotore di interesse, e, come tale, visualizzando l&#39;attività della luciferasi di lucciola possono richiedere lunghi tempi di acquisizione. </li><li> Utilizzando il software Living IVIS immagine impostata sulla modalità &quot;fotoni&quot;, stabilire values sia per il Renilla e acquisizioni lucciola come mezzo per stabilire rapporti di luminescenza relativa linea di base (RLR). </li></ol> 5. Longitudinale luminescente Imaging <ol><li> Cellule 4T1 sono molto aggressivi, in modo tale che l&#39;inoculazione di 1x10 4 cellule porta normalmente alla formazione del tumore palpabile entro 1 settimana, e alla letalità dell&#39;animale entro 4-5 settimane. 4T1 tumori hanno una intrinseca propensione ulcerate nella settimana 4. La crescita e il mantenimento dei tumori ulcerati può richiedere a parte l&#39;approvazione IACUC. Gli studi del tumore 4T1 indicate nel presente documento sono stati approvati dal IACUC presso la Case Western Reserve University. </li><li> Come descritto sopra, i topi deve essere iniettato settimanalmente con Coelenterazine RediJect per monitorare la crescita tumorale e metastasi generale, nonché con D-luciferina per monitorare pathway-specifici di segnalazione durante le varie fasi di sviluppo del tumore. Fare attenzione di volta in volta per garantire il segnale Renilla luciferasi è completamente dissipata prima dell&#39;acquisizionedel segnale di luciferasi di lucciola. </li><li> Come tumori 4T1 sviluppare e progresso, acquisizioni Renilla luciferasi sono normalizzati ai valori iniziali Renilla misurate al momento della inoculazione delle cellule tumorali come mezzo per normalizzare e monitorare la crescita del tumore primario. Ancora più importante, del calcolo dei valori RLR nel tempo stabilirà la regolazione temporale dei singoli sistemi di segnalamento relativi alla crescita e progressione tumorale. </li><li> Overt metastasi polmonari si manifestano entro 3-4 settimane dopo l&#39;attecchimento delle cellule 4T1 sul tampone grasso mammario. Confrontando i valori RLR polmonari rispetto a quelli calcolati per il tumore primario stabilisce la regolazione spaziale dei singoli sistemi di segnalamento relativi alla crescita tumorale e metastasi. </li></ol> 6. Doppio Imaging Bioluminescent di due tipi di cellule unici in un singolo animale <ol><li> Ingegnere un seno linea di cellule di cancro per stabilmente espressione CMV-driven luciferasi Renilla come descritto sopra. Ripetere questaprocesso di progettazione con CMV-driven luciferasi di lucciola in una seconda distinta linea di cellule di cancro al seno. </li><li> Qui ci mista Renilla luciferasi cellule esprimenti 4T1 con loro e non metastatici isogenico lucciola luciferasi-esprimenti controparti 4T07 10, 11. Rapporti variabili di queste popolazioni miste di cellule di cancro al seno sono successivamente iniettato nel grasso mammario pad come descritto sopra. </li><li> Subito acquisire sia lucciola e Renilla immagini luciferasi di stabilire iniziale RLRs rappresentante di una determinata miscela cellulari inoculate. </li><li> Longitudinale di imaging bioluminescente dual visualizzerà ed i cambiamenti nella composizione cellulare all&#39;interno del tumore primario, nonché l&#39;metastasi spazio-temporale di ciascun derivato cancro al seno rispetto alla crescita e progressione tumorale. </li><li> In alternativa, le singole cellule di cancro al seno popolazioni possono essere inoculati in posizioni diverse nel topo (cioè destra e sinistra addominali cuscinetti di grasso mammario)per valutare le influenze sistemiche queste due popolazioni presentano uno sull&#39;altro durante varie fasi di crescita tumorale e metastasi. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Un punto di forza duale di imaging bioluminescenti sta nel fatto che ogni immagine è internamente coerente e controllata, in modo tale che i segnali continui derivati ​​dalla funzione di tumore primario come metrica importante per misurare il successo o il fallimento complessivo di ciascun Renilla e acquisizione lucciola. Questo aspetto della procedura di imaging è particolarmente importante durante acquisizioni dell&#39;attività di Renilla luciferasi, il cui Coelenterazine substrato è altamente sensibile all&#39;ossidazione che provoca la sua capacità di auto-luminescenza. La figura 1A mostra un esempio di questo effetto collaterale, che si manifesta immediatamente come non specifici segnali luminescenti derivati ​​dal tratto intestinale non, il tumore primario stabilito. In genere, questi segnali non specifica Coelenterazine transpirseguente indirizzo e non iniezioni endovenose di questo substrato Renilla luciferasi. Tuttavia, una volta robusti primarie derivate da tumori segnali Renilla sono stati ottenuti (Figura 1B, immagine di sinistra), è sicuro di procedere a catturare pathway misurazioni specifiche segnalazione derivati ​​da immagini di luciferasi di lucciola (Figura 1B, pannello di destra), la cui D-luciferina substrato è molto stabile a seguito di iniezione IP e produce livelli trascurabili di sfondo auto-luminescenza. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3245/3245fig1.jpg" /> Figura 1. Acquisire Renilla lucciola e-derivato immagini bioluminescenti per calcolare in RLRs vivo. (A) Un esempio di iniezione fallito IV di Coelenterazine conseguente segnale aspecifico dal tratto intestinale. Cerchio e PT indicare la posizione approssimativa del tumore primitivo. (B) Un acquisto Renilla di successo di un topo che porta un tumore primario e 4T1 pmetastasi ulmonary (pannello di sinistra; 4wk dopo l&#39;attecchimento cuscinetto adiposo). L&#39;acquisizione corrispondente lucciola permette di calcolare RLRs sia dal tumore primario e delle sue metastasi polmonari. (C) Rappresentazione grafica del tumore primario e delle metastasi polmonari RLRs calcolata da topi mostrato nel pannello B (n = 4).

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	<li>Wetterwald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cancer+metastasis+to+bone+marrow:+a+mouse+model+of+minimal+residual+disease.">Optical imaging of cancer metastasis to bone marrow: a mouse model of minimal residual disease.</a> Am. J. Pathol. 160, 1143-1153 (2002).</li><li>Wendt, M. K., Drury, L. J., Vongsa, R. A., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+CXCL12+Expression+Induces+Anoikis+in+Colorectal+Carcinoma+Cells.">Constitutive CXCL12 Expression Induces Anoikis in Colorectal Carcinoma Cells.</a> Gastroenterology. 135, 508-508 (2008).</li><li>Wendt, M., Schiemann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+the+focal+adhesion+complex+prevents+oncogenic+TGF-beta+signaling+and+metastasis.">Therapeutic targeting of the focal adhesion complex prevents oncogenic TGF-beta signaling and metastasis.</a> Breast Cancer Research. 11, R68-R68 (2009).</li><li>Korpal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transforming+growth+factor-beta+signaling+dynamics+and+therapeutic+response+in+breast+cancer+bone+metastasis.">Imaging transforming growth factor-beta signaling dynamics and therapeutic response in breast cancer bone metastasis.</a> Nat Med. , (2009).</li><li>Giampieri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility.">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li><li>Giampieri, S., Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+illuminates+transforming+growth+factor+beta+signaling+switches+during+metastasis.">Intravital imaging illuminates transforming growth factor beta signaling switches during metastasis.</a> Cancer Res. 70, 3435-3439 (2010).</li><li>DeNardo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4(+)+T+cells+regulate+pulmonary+metastasis+of+mammary+carcinomas+by+enhancing+protumor+properties+of+macrophages.">CD4(+) T cells regulate pulmonary metastasis of mammary carcinomas by enhancing protumor properties of macrophages.</a> Cancer Cell. 16, 91-102 (2009).</li><li>Wyckoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Paracrine+Loop+between+Tumor+Cells+and+Macrophages+Is+Required+for+Tumor+Cell+Migration+in+Mammary+Tumors.">A Paracrine Loop between Tumor Cells and Macrophages Is Required for Tumor Cell Migration in Mammary Tumors.</a> Cancer Res. 64, 7022-7029 (2004).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+self-seeding+by+circulating+cancer+cells.">Tumor self-seeding by circulating cancer cells.</a> Cell. 139, 1315-1326 (2009).</li><li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor.">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).</li><li>Wendt, M. K., Smith, J. A., Schiemann, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+facilitates+epidermal+growth+factor-dependent+breast+cancer+progression.">Transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition facilitates epidermal growth factor-dependent breast cancer progression.</a> Oncogene. 29, 6485-6498 (2010).</li><li>Hawkins, E., Unch, J., Murhpy, N., Vidugiriene, J., Scurria, M., Klaubert, D., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+Light,+No+Lysis.">Bright Light, No Lysis.</a> Measuring Renilla Luciferase Luminescence in Living Cells. , (2005).</li><li>Roncali, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+device+for+real-time+bioluminescence+imaging+in+moving+rodents.">New device for real-time bioluminescence imaging in moving rodents.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054035-054035 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il potere assoluto di tecniche di imaging bioluminescenti risiede nella loro capacità di quantificare la crescita tumorale e metastasi in complessi studi longitudinali, che qui coinvolto l&#39;uso di cellule 4T1 cancro al seno aggressivi. Poiché queste procedure contare sulla integrazione stabile di due costrutti reporter luciferasi, queste tecniche possono essere prontamente adattato e tradotto in altre linee cellulari tumorali di varia latenze tumorali metastatiche e capacità. Simile ai risultati mostrati qui, calcolando RLRs specifici all&#39;interno lentamente sviluppare tumori primari e delle loro metastasi eventuali permette di identificazione in tempo reale spazio-temporale di specifici eventi di segnalazione che traspaiono durante la progressione metastatica di tumori indipendentemente dalla durata di latenza. Previa identificazione di eventi promotore specifico normativi, è importante accise sia del tumore primario e delle sue metastasi per l&#39;esecuzione di immunoistochimica standard e differenziazionel analisi di espressione genica di verificare regolamento analogo del gene endogeno e / o proteine. Tecnicamente parlando, la sfida principale della doppia analisi bioluminescenti sta nella durata relativamente breve dei segnali Renilla luciferasi. Come tale, questa tecnica di imaging richiede significativa ottimizzazione della procedura di iniezione vena della coda, così come l&#39;imaging immediato di singoli animali iniettati, un processo che richiede tempo e relativo piuttosto inefficiente per l&#39;imaging luciferasi di lucciola. Recentemente, Promega introdotto &quot;Viviren&quot;, che rappresenta un secondo substrato di luciferasi generazione i cui siti di ossidazione sono bloccati da esterificazione finché questa iscrizione molecola guadagni in cellule, a questo punto la molecola è rapidamente deesterificata. Collettivamente, questo substrato romanzo riduce efficacemente auto-luminescenza e aspecifici modifica e / o degradazione accoppiato Renilla indotta auto-luminescenza 12. In tal modo, questa nuova renillun substrato di luciferasi produce brillanti segnali luminescenti, tuttavia, i costi eccessivi connessi con l&#39;acquisizione e l&#39;uso di &quot;Viviren&quot; hanno fornito relativamente pochi gli studi necessari per valutare l&#39;utilità generale di questo substrato in due analisi bioluminescenti. Infine, la sensibilità di qualsiasi saggio di bioluminescenza è criticamente dipendente dalla camera CCD operante ad acquisire singole unità leggere. Infatti, come queste tecnologie migliorano, si prevede un punto nel futuro in cui la nostra capacità di visualizzare complesse reazioni bioluminescenti luce-mediate possono trasparire in modo efficiente in animali liberi in movimento 13.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> pGL4.2-Puro [luc2 / Puro] Vector </td><td> Promega </td><td> E6751 </td></tr><tr><td> Glomax Mult-idection sistema </td><td> Promega </td><td></td></tr><tr><td> IVIS serie 200 </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Duale luciferasi giornalista sistema Assay </td><td> Promega </td><td> E1960 </td></tr><tr><td> Rediject coelenterazina-h </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 760506 </td></tr><tr><td> D-Luciferin K-Sale </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td></tr></tbody></table>

in vivo dual substrate bioluminescent imaging

La nostra comprensione di come e quando il cancro al seno cellule di transito stabiliti tumori primari a siti metastatici è aumentato ad un ritmo eccezionale, in quanto l&#39;avvento di in vivo bioluminescenti tecnologie di imaging 1-3. Infatti, la possibilità di individuare e quantificare la crescita tumorale longitudinalmente in una singola coorte di animali a completamento dello studio rispetto a sacrificare singoli gruppi di animali in momenti specifici test ha rivoluzionato come i ricercatori indagare metastasi del cancro al seno. Purtroppo, le attuali metodologie esclude la valutazione in tempo reale dei cambiamenti critici che traspaiono in sistemi di segnalazione cellulare, come cellule di carcinoma mammario (i) evolvono all&#39;interno tumori primari, (ii) la diffusione in tutto il corpo, e (iii) ricomincino programmi proliferative in siti di lesione metastatica. Tuttavia, i recenti progressi nel campo dell&#39;imaging bioluminescente rendono ora possibile quantificare contemporaneamente spatiotempor specificoAl cambiamenti nell&#39;espressione genica in funzione dello sviluppo e progressione tumorale metastatica mediante l&#39;uso di due reazioni luminescenza substrato. Per farlo, i ricercatori approfittiamo per due enzimi che producono luce luciferasi isolati dalla lucciola (Fotino pyralis) e mare pansy (reniformis Renilla), entrambi i quali reagiscono a substrati si escludono a vicenda, che in precedenza facilitato il loro ampio utilizzo in cellula in vitro -saggi del gene reporter 4. Qui mostriamo l&#39;utilità in vivo di questi due enzimi tali che una reazione luminescenza segna specificamente le dimensioni e la posizione di un tumore sviluppo, mentre la seconda reazione luminescente serve come mezzo per visualizzare lo stato di attivazione di specifici sistemi di segnalazione durante fasi distinte di tumore e metastasi sviluppo. Pertanto, gli obiettivi di questo studio sono due volte. In primo luogo, verranno descritti i passi necessari per la costruzione di doppia bioluminescente linea cellulare giornalistas, oltre a quelle necessarie per facilitarne l&#39;uso nel visualizzare la regolazione spazio-temporale dell&#39;espressione genica durante fasi specifiche della cascata metastatica. Utilizzando il modello 4T1 di metastasi del cancro al seno, si dimostra che l&#39;attività in vivo di un elemento sintetico Smad Binding (SBE) promotore è stato ridotto drasticamente in metastasi polmonari rispetto a quella misurata nel tumore primario 4-6. Recentemente, metastasi tumore al seno ha dimostrato di essere regolata da cambiamenti all&#39;interno del microambiente tumorale primaria e stroma reattivo, comprese quelle che si verificano in fibroblasti e cellule immunitarie infiltranti 7-9. Così, il nostro secondo obiettivo sarà quello di dimostrare l&#39;utilità della doppia tecniche bioluminescenti nel monitoraggio della crescita e la localizzazione di due popolazioni di cellule uniche nutriti all&#39;interno di un singolo animale durante la crescita del cancro al seno e metastasi.

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In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Qui si descrivono i metodi per costruire, visualizzare e quantificare le reazioni bioluminescenti sia lucciola e Renilla enzimi luciferasi espressi in cellule metastatiche di cancro al seno durante la loro crescita e le metastasi<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo doppio substrato Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

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In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

15.4K Views.  Case Western Reserve University. Qui si descrivono i metodi per costruire, visualizzare e quantificare le reazioni bioluminescenti sia lucciola e Renilla enzimi luciferasi espressi in cellule metastatiche di cancro al seno durante la loro crescita e le metastasi In vivo.

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Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are administered specifically to the liver to induce a localised liver tumour, via mobilisation of the spleen and splitting into two, leaving intact the vascular pedicle for each half of the spleen. Lewis lung carcinoma cells that constitutively express the firefly luciferase gene (luc1) are inoculated into one hemi-spleen which is then resected 10 minutes later. The other hemi-spleen is left intact and returned to the abdomen. Liver tumour growth can be monitored by bioluminescence imaging using the IVIS whole body imaging system. Quantitative imaging of tumour growth using IVIS provides precise quantitation of viable tumour cells. Tumour cell death and necrosis due to drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This mouse model allows for investigating the mechanisms underlying metastatic tumour-cell survival and growth and can be used for the evaluation of therapeutics of liver metastasis. 

This article describes a procedure for the induction of orthotopic bioluminescent liver tumours in mice, and subsequent analysis of tumour growth confined to the liver using live whole body luminescence imaging.

Bioluminescent modello murino epatica Tumori

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

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Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health disorders such as chronic wounds. We report the development of a dual-mode imaging system for non-invasive and non-contact imaging of cutaneous tissue oxygenation and vascular function. The imaging system integrated an infrared camera, a CCD camera, a liquid crystal tunable filter and a high intensity fiber light source. A Labview interface was programmed for equipment control, synchronization, image acquisition, processing, and visualization. Multispectral images captured by the CCD camera were used to reconstruct the tissue oxygenation map. Dynamic thermographic images captured by the infrared camera were used to reconstruct the vascular function map. Cutaneous tissue oxygenation and vascular function images were co-registered through fiduciary markers. The performance characteristics of the dual-mode image system were tested in humans.

A dual-mode imaging system was developed for non-contact assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function.

Dual-mode Imaging di ossigenazione dei tessuti cutanei e di funzione vascolare

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Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Impianto intracranica con 3D successivi In Vivo Bioluminescent Imaging dei gliomi Murine

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotassica impianto intracranico e<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent di xenotrapianti di tumori in un sistema modello del mouse di Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

In vivo imaging dell&#39;angiogenesi tumorale mediante fluorescenza confocale Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Bioluminescente modello ortotopico di cancro al pancreas Progressione

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI per il tracciamento cellulare

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

Simulazione pancreatica neuroplasticità:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neurone Plasticità Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequenziale<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemioterapia-indotta vascolare Tossicità - in tempo reale<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...