עבודה זו מומנה על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס (פרס חקירת אתגר הגדול לSBG), המכונים הלאומיים לבריאות מחקר (NIHR), מרכז המחקר ביו במחל מיקרוביאלית, ומחקר ברשת המקומית המקיפה NIHR. אנו מכירים בNWDA לתמיכה תשתיתית. אנו מודים לפרופ &#39;יעקב וייזר, אוניברסיטת פנסילבניה ופרופ&#39; P הרמן, אוניברסיטת ניימיכן לבידודי pneumococcal. תודה לועדת בטיחות EHPC לתמיכה ותעוץ, לכל המתנדבים להשתתפותם ומתייה Bangert ללוקח את התמונות.

1. התנדבות בחירה והקרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתנדבים בריאים מגויסים באמצעות מודעות וכרזות באתר האוניברסיטה לפי NHS המחקר והדרכת ועדת אתיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את הקריטריונים להכללת השתתפות הם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבוגרים בגילים 18-60 שנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדבר אנגלית רהוטה, והוא מסוגל לתקשר בקלות על ידי שני טלפונים סלולריים והודעות טקסט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את קריטריוני הפסילה להשתתפות הם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קשר הדוק עם אנשים בסיכון (ילדים, מבוגרי immunosuppressed, בריאות קשישים, כרונית חולה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היסטוריה הנוכחית מעשנים או משמעותי מעישון (&gt; 10 שנתי חפיסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסטמה או מחלה נשימתית אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הריון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלרגיה לפניצילין או אמוקסיצילין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעורבות שוטפת בניסוי קליני נוסף, אלא אם כן תצפית או בשלב שאינו התערבותית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין אפשרות לתת הסכמה מהדעת באופן מלא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl">ביקור סינון ראשוני, כשבוע לפני החיסון, כולל היסטוריה קלינית ממוקדת ובדיקה קלינית ממוקדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חריגות מוכרות קודם לכן נמצאה, מתנדבים יהיה נכללו במחקר והחקירה המתאימה תהיה מסודרת דרך טיפול ראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הסינון הראשוני לבקר ספירת דם מלאה מתקבלת כדי להבטיח שספירת התאים הלבנה נמצאת בטווח נורמלי לפני ביקור החיסון. שטיפת אף מבוצעת כדי לשלול נישאים pneumococcal טבעי (ראה 6.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני החיסון, מתנדב מתחנכים על הסיכונים כרוכים בהשתתפות במחקר ומסופקים עם כרוז חירום מטופל, מדחום דיגיטלי, מספרי טלפון לשעת חירום וכמובן 3 ימים של אמוקסיצילין. </li></ol> 2. הכנת חיסון המניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מניות החיסון צריך להיעשות בסביבה נקיה. את pipettes משמש רק צריך להשתמשד להכנת בידוד. כל הזכוכית וכלי פלסטיק צריכה להיות סטרילי. אנו ממליצים כי מניות חיסון תהיינה מוכנות בחדר ייעודי, באמצעות fumehood מסור וחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זני pneumococcal מחוסנים על גבי צלחת אגרה דם. צלחות מודגרת על 37 מעלות צלזיוס בלילה 2 CO 5%. היום לאחר את כל החיידקים הוא גרד מהצלחת אגרה דם ומחוסן למערכת שימור מניית חרוז. מניות חרוזים אלה משמשים להכנת מלאי חיסון. לבדוק את מלאי חרוזים לזיהום ואחידות מושבה לפני הכנת מלאי חיסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את מניית החיסון לחסן את צלחת אגרה דם עם שני חרוזים ממניות חרוז סרוטיפ pneumococcal הרצויים, מזנק כדי לכסות את כל הצלחת. דגירת צלחות על 37 מעלות צלזיוס בלילה CO 2 5%. כל incubations הנוסף יהיה להשתמש באותם תנאים אלו. גם דגירת התקשורת במהלך הלילה כדי להבטיח סטריליות Vegitone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספוגית למחרת בבוקרחצי מהצלחת, נזהר שלא להסיר כל אגר דם, ולהוסיף עד 12 מ&quot;ל של מרק Vegitone מראש מחומם. חזור על שימוש במחצית השנייה של הצלחת. השאר את שני בקבוקונים 12 מ&quot;ל ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, או עד לשינוי בעכירות מתברר, מוקדם מבין שתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12 מ&quot;ל עד 40 מ&quot;ל של מרק Vegitone מראש מחומם ומערבב היטב. חזור לבקבוקון 12 מ&quot;ל האחר. זוהי נקודת זמן = 0. הסר 100 μl לקרוא צפיפות האופטית (OD) ב 600 ננומטר. להסיר 20 μl לכימות של חיידקים על ידי יחידת מושבה להרכיב (CFU) ספירה באמצעות וריאציה של השיטה של מיילס ומייסר (M &amp; M) 7. דגירת שני הבקבוקונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לM &amp; M, לחלק צלחת אגרה דם לשישה חלקים. הוסף 180 μl של סטרילי PBS לשש בארות של צלחת גם 96 (U-תחתון). הוסף 20 μl של המרק לראש היטב ולערבב. סדרתי לדלל את דגימת השש פעמים 1:10 ולהשליך 20 μl מהבאר השישית. 3 10 טיפי μl מקום מן הבאר העליונה לחלקו הראשון שלצלחת אגר דם. חזור לחמש בארות האחרות. להבטיח את הצלחת יבשה לפני זה הוא הפוך ודגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת לספור את מספר המושבות מוצג בכל סעיף דילול ולהקליט. באמצעות שימוש בסעיף הדילול עם ספירה בין 30 ל 300, מחלק את מספר המושבות גלויות על ידי שלוש כדי להגיע לממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את המספר הממוצע של מושבות על ידי גורם הדילול ולאחר מכן לחלק לפי 10 (כמות הירידה של 10 μl). זה נותן CFU / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכפיל את המספר הזה ב -1000 כדי לקבל CFU / מ&quot;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 600 קריאות וכימות של חיידקי OD בשיטת M &amp; M כל שעה עד השלב מוקדם אמצע היומן הוא הגיע, OD של 0.25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע OD זו מגיעה, להוסיף גליצרול לעקר 10% לבקבוקון אחד ולהכין 1 aliquots מ&quot;ל. aliquots בחנויות ב-80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנייה מרוכזת יותר, סרכזת הבקבוקון השני ב3345 XG במשך 15 דקות ולהסיר את supernatant. Resuspend גלול ב 22.5 מ&quot;ל של Vegitonבינוני דואר ולהוסיף גליצרול 10%. הכן 1 aliquots וחנויות מ&quot;ל ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר מניות ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 48 שעות לפני ההפשרה וכימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את מלאי חיידקים קפוא בשיטת M &amp; M. לבדוק שלושה צינורות מניות בנפרד כדי להבטיח שחזור. השתמש ערך המתקבל כדי לדלל את המניות לריכוז הבידוד הרצוי במלח, כמתואר להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיסון, כמות pneumococci בבידוד מחושבת לפני ואחרי החיסון. כימות זה של חיידקים על ידי שיטת M &amp; M משמש כדי לקבוע את המספר הממוצע של pneumococci בבידוד המהווה את הזמן שנדרש כדי להשלים את כל ההליך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בידוד, מוהל לריכוז הרצוי, ולבצע כימות בשיטת M &amp; M עבור &quot;חיסון מראש&quot; הספירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במתקן למחקר הקליני שלנו זה לוקח צוות 30 דקות כדי להשלים את הליך החיסון כולה. Pnמתלי eumococcal במלח ניתן בדרך כלל לראות ספירת ירד בפרק זמן זה. כדי להסביר את זה, אנחנו הנחנו לבידוד המדולל בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ולאחר מכן לבצע &quot;שלאחר חיסון&quot; כימות של החיידקים בשיטת M &amp; M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח הממוצע של לפני ואחרי כדי לקבוע את הריכוז המחוסן הסופי. התאם את הזמן &quot;יושב&quot; על פי הפרוטוקול הקליני שלך, אבל לשמור על מרווח זמן קצר ככל האפשר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל המניות החדשות יש לשלוח למעבדת הפניה לאישור של טוהר מניות וזהות. </li></ol> 3. הכנת בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת הבידוד צריכה להתחיל 30 דקות לפני מינוי החיסון מתנדב המתוכנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את אחד צינורות המניות שבוצעו בעבר של ° C -80 המקפיא, להפשיר אותה ולסובב את הצינור בmicrocentrifuge על 17,000 XG ל3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות חמות דם אגר ב37 המעלות צלזיוס החממה. להכיןצלחת 96 גם לכימות חיידקים בשיטת M &amp; M ולהכין צינורות דילול בהתאם למינון הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant המרק מצינור centrifuged וresuspend גלול ב 1 מ&quot;ל של תמיסת מלח. צעד זה מסיר את המרק מהבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant המלוח וresuspend גלול ב 1 מ&quot;ל של תמיסת מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע סט לדילול ריכוז בידוד רצוי ולכמת בשיטת M &amp; M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הבידוד למינוי ההתנדבות ולאחר inoculating המתנדבים, חזור כימות במעבדה. תייג את הצינור עם התאריך ומינון בידוד ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח עקביות מחיסון לחיסון, חשוב להשתמש באותם pipettes וציוד מעבדה ייעודי בכל פעם. </li></ol> 4. התחסנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתנדב צריך להיות יושב בנוחות בתנוחה שכיבה למחצה. </li><li&gt; השימוש P200 פיפטה וטיפי סינון סטריליים לצייר עד 100 μl של הבידוד ולהכניס את הקצה ממש בתוך חלל האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לגרש את הבידוד על רירית האף בתנועות מעגליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה חיוני כי קצה פיפטה אינו בא במגע עם רירית האף כהפרעה בשלמות האפיתל עלול לגרום לחיידקים להיכנס לזרם הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוא גם חיוני כי הבידוד אינו ממוקם רחוק מדי בחזרה או שזה יפעל במורד הגרון, זה צריך לשכון בתוך חלל האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לnaris האחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש מתנדבים להישאר בעמדה שכיבה למחצה עבור 10 דקות ללא מרחרח או נושב האף. זה מאפשר זמן לחיידקים להתפזר על פני הרירית. </li></ol> 5. ניטור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתנדבים נמצאים במעקב יומי לאחר חיסון. זה כולל הודעת טקסט יומית נשלחה על ידי מתנדב לחוקרים לפני 2 בצהריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם טקסטילא קבל ב 2 הצהרים מתנדבים יהיה קשר כדי להבטיח / הרגשתו הטובה. אם הוא / היא לא מגיב, שאר הבשר הבא יוקצו יהיה קשר כדי להבטיח הרווחה של המתנדב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתנדב מתבקשים לדווח על כל תסמינים בדרכי נשימה עליונים בכל פגישה. צוות קליני יבקש מתנדב לתיאור הסימפטומים שלו / שלה ויודיע לי שום תלונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את האנטיביוטיקה שניתנה למתנדבים הן רק לתילקח בשלוש נסיבות: במקרה שהם אינכם חשים בטוב וקבלו הנחיות לקחת אותם על ידי צוות המחקר, אם הם נושאים pneumococcus בסוף המחקר, או אם הם אינכם חשים בטוב והצליח ליצור קשר עם צוות המחקר. מתנדב מתבקש לשמור על חבילת חירום זה איתם בכל העת במהלך המחקר ומתבקש ליצור קשר עם צוות המחקר על בסיס יומי במשך 7 הימים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צוות שלנו זמין 24/7 באמצעות מגע אחות במהלך שעתי עבודה ושני רופאים זמינים מתוך הואורס. כל שאילתות מטופלות על ידי שיחת טלפון ו / או ביקורת מיידית. הוראות זמינות להודאה מיידית וישירה למחלקת מחל מדבקות, במידת צורך. </li></ol> 6. אף Wash (NW) נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטיפות אף (NW) מתבצעות בביקור ראשוני הקרנה, כמו גם 48 שעות, 7 ו 14 ימים לאחר החיסון. שיטת NW משמשת נלקחת מNaclerio et al. 8 מתנדב באופן טבעי מאוכלס על ידי ס דלקת ריאות אינן נכלל בחיסון והמעקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתנדב יושב בנוחות ובראשו מוטה לאחור 30 מעלות מהאנך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאל מתנדב לקחת נשימה עמוקה ובלעצור את נשימתם בזמן דוחף את הלשון שלהם למעלה ואחורה על הגג של הפה. בעוד בעמדה זו, המתנדב בקש לאותת שהם מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק מלא בתמיסת מלח 20 מ&quot;ל מוכנס לתוך חלל האף הקדמי ו5 מ&quot;ל של תמיסת מלח הוא גורש. Volunteer ורוכן באופן מיידי והרחקת הנוזל על ידי נשיפה דרך אפם במהירות לתוך קערת נייר כסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה 3 פעמים נוספות, כך שכל naris כבר שטף פעמים ו20 מ&quot;ל המלא כבר בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברכה לכל הדוגמות יחד בצינור צנטריפוגה ולשלוח למעבדה בטמפרטורת חדר לעיבוד. </li></ol> 7. אף שטפי עיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הדגימות למשך 10 דקות ב3345 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant וחנות כ1 aliquots מ&quot;ל בשפופרות Eppendorf שכותרת ב-80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של STGG בינוני 9 לגלולה ומערבבת היטב. ודא שעוצמת הקול הכוללת בצינור בשלב זה נקבעה. דילול זה ישמש בחישוב CFU של עגלת NW החיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת טיפת μl 20 מתוך STGG מכיל גלולת resuspended על גבי צלחת אגרה דם המכילה גנטמיצין ופס כל הצלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם NW הוא שלאחר החיסון, להסיר 10 μl מSTGG מכיל גלולה ושימוש לכימות חיידקים בשיטת M &amp; M resuspended. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 800 μl נוסף של STGG לצינור NW ומערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 μl צלחת על גבי צלחת אגר דם ו25 μl על גבי צלחת אגרה שוקולד, נמרח כל הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלק את חיידקי הסכום הנותרים המרחפים בSTGG בינוני לתוך 2 cryovials וחנויות ב-80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס בלילה ב5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את הצלחות למחרת לpneumococcus ומזיקים פוטנציאליים אחרים בדרכי נשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pneumococci מזוהים על ידי צלחות מורפולוגיה מושבה. מושבות haemolytic אלפא עם מורפולוגיה שרטט הן תת תרבותיות על אגר דם עם דיסק optochin וטופחו במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות pneumococcal משוערות שoptochin רגישים מוכתמות גראם לאשר diplococci גראם החיובי וserotyped באמצעות Statens סרום מכון Pneuערכת motest-אטקס. </li></ol>

<ol>
	<li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research.">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li><li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine.">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li><li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children.">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li><li>Wu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice.">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li><li>Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l., Collins, A., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage.">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PloS Pathogens. 8 (4), e1002622 (2012).</li><li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood.">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> The Journal of Hygiene. 38, 732-749 (1938).</li><li>Naclerio, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+release+after+nasal+airway+challenge+with+allergen.">Mediator release after nasal airway challenge with allergen.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, 597-602 (1983).</li><li>O'Brien, K. L., Nohynek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+a+WHO+working+group:+standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae.">Report from a WHO working group: standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae.</a> Pediatr. Infect. Dis J. 22, 133-140 (2003).</li><li>Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+nasopharyngeal+swab+and+nasal+wash,+using+culture+and+PCR,+in+the+detection+of+potential+respiratory+pathogens.">Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens.</a> BMC Research Notes. 4, 122 (2011).</li><li>McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage.">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פלטפורמת EHPC יש מספר השימושים פוטנציאליים כוללים שימוש כמודל חיסון רירי וכפונדקאי של הגנה לבדיקת חיסוני חלבון רומן. השיטה תלויה בטכניקת הדבקה עקבית ואיכות גבוהה NW. שחזור יכול להיות בעיה עם הבידוד. בשל האופי המשתנה של aliquots החיידקים הקפואים, זה יכול להיות קשה לשכפל את המינון הרצוי. Halving או הכפלת המינון הרצוי נחשב בטווח. זה חיוני כי כימות החיידקים להיעשות מייד לפני והחיסון בא, כדי לקבוע במדויק כימות של חיידקים על ידי CFU ספירה. מסיבה זו יכולה להיות מועיל אם מינויי התנדבות מתרחשים בו זמנית, כך שרק בידוד איש צריך להיות מוכן וציפוי הכימות שנעשה לפני ואחרי החיסון קורה לא יותר מ -30 דקות זו מזו. שיטת NW דורשת coopeמנה של המתנדב, ולא הייתה שיטה אידיאלית בילדים. אם התשואה היא פחות מ 5 מ&quot;ל, ההליך ניתן לחזור על שימוש עד 20 מ&quot;ל נוסף. תותבות לובשות עשויות להפחית את תשואת NW. אם יש מתנדב אף חסום / צפוף ומלוח ואוזל anteriorly אחרי החדרה, לפוצץ את האף, הכנס את המזרק מעט רחוק יותר, והטה את הראש אחורה יותר במידת צורך. NW הוא טכניקה שמשתפרת עם תרגול. קצת נפח בדרך כלל יאבד כך המטרה היא לתשואה של לפחות 10 מ&quot;ל. אם מתנדב יכול לטעום מלוח במהלך NW אז הקשר בין לוע האף והלוע התחתון האחוריים לא נסגר כראוי על ידי לשונו של המתנדב. אם בולעת ההתנדבות רוב המלוח, להסביר את ההליך שוב, תוך שימת דגש על הדחיפה של הלשון כנגד גג הפה. ואז לחזור על התהליך כדי להגביר את עוצמת הקול חזרה. אם NW מכיל substantכמות IAL של ליחה, עדיף להסיר אותו לפני צנטריפוגה. מערבולת המדגם כדי לשחרר כל דבר שעשוי להיות קשור לליחה ולאחר מכן להסיר כמה שיותר את החתיכות הגדולות ככל האפשר תוך הסרה אשר מלוח מעט ככל האפשר. מחקר EHPC קודם בארה&quot;ב הסתיים בשלום ולא היו תופעות לוואי 11. כדי להבטיח את השלום המתמשך של פלטפורמת EHPC, הקמנו פרוטוקול חירום המבוסס סביב גישת 24 שעות לצוות המחקר. מתנדבים מקבלים פרטי התקשרות, ומאפשרים להם גישת 24 שעות לצוות המחקר ביום. כל טיפול הרפואי דרושים מסופק בבית החולים של האוניברסיטה המלכותית של ליברפול. כאמצעי נוסף להגנה, ועדת בטיחות המורכבת של רופאים ומדענים מחוץ לקבוצת המחקר מקבלת דו&quot;ח בטיחות שבועית. הדו&quot;ח מכיל את מינון החיידקים כל מתנדב קבל והאם כל סימפטומים או מחלה דווחו. דו&quot;ח זה מאפשר בטיחות של המחקר דואר שהעביר ביקורת חיצונית ללא משוא פנים. ועדת הבטיחות זמינה גם 24 שעות ביום במקרה הלא הסביר של חירום.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> חתול # </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> דיג </td><td> G/0650/08 </td></tr><tr><td> 0.9% נתרן כלוריד </td><td> B. Braun </td><td> 3627667 </td></tr><tr><td> אבקת חלב דל שומן </td><td> Fluka </td><td> 70166 </td></tr><tr><td> Tryptone סויה המרק </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 211768 </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> BDH </td><td> 284504S </td></tr><tr><td> אגר קולומביה בדם הסוס chocolated </td><td> Oxoid </td><td> PB0124 </td></tr><tr><td> Pneumotest-לטקס ערכה </td><td> Statens סרום המכון </td><td> 51823 </td></tr></tbody></table>

experimental human pneumococcal carriage

מרכבת pneumococcal אנושית ניסויית (EHPC) היא חשובה מבחינה מדעית כי כרכרת אף ולוע של Streptococcus pneumoniae היא המקור העיקרי להעברת מחלה והתנאי המוקדם של מחלה פולשנית. מודל של מרכבה יאפשר קביעה מדויקת של הקורלציה של הגנה החיסונית, ההשפעה המחסנת של עגלה ואת ההשפעה של לחץ על מארח הפתוגן בנישת האף והלוע. יתר על כן, שיטות איתור עגלה שימושי במחקרים אפידמיולוגיים, כולל מחקרי חיסון, ניתן להשוות. מטרה אנו שואפים לפתח פלטפורמה שEHPC היא שיטה לשחזור בטוחה ושימושית שיכולים לשמש לחיסוני pneumococcal רומן מועמד למטה בחרו במניעת מרכבה כפונדקאית של חסינות מושרה חיסון. זה יפעל לבדיקה של חיסונים מועמדים ותיאורים של מנגנוני הגנה והחיסון EHPC מcarria1 ge. חיסונים המצומד כנגד זרם pneumococcus להגן על ילדים מפני מחלה פולשנית למרות חיסונים חדשים יש צורך דחוף כחיסון הנוכחי אינו מעניק הגנה אופטימלית נגד דלקת ריאות שאינן bacteraemic ויש כבר ראיות להחלפת סרוטיפ עם זנים שאינם חיסון 2-4. שיטה אנחנו מחסנים עם ס דלקת ריאות תלויה ב100 μl של תמיסת מלח. בטיחות היא גורם מרכזי בהתפתחותו של מודל EHPC ומושגת באמצעות הקרנת מתנדב נמרץ וניטור. ועדת בטיחות המורכבת של רופאים ומדענים שאינם תלויים מהמחקר מספקת משוב אובייקטיבי על בסיס שבועי. בידוד החיידקים הוא סטנדרטי ודורש שלא מוצרים מן החי מחוסנים למתנדבים (מדיה מבוססת ירקות ומלוחים). המנות שנדרשות להתישבות (10 4 -10 5) נמוכים בהרבה than אלו המשמשים במודלים של בעלי חיים (10 7) 5. גילוי מרכבת pneumococcal מוגבר על ידי נפח גבוה (רצוי&gt; 10 מ&quot;ל) לשטוף אף שהוא יחסית ריר חופשי. פרוטוקול זה יעסוק בחלקים החשובים ביותר של הפרוטוקול בתורו. אלה (א) בחירה מתנדב, (ב) הכנת הבידוד pneumococcal, (ג) חיסון, (ד) ומעקב (ה) גילוי מרכבה. תוצאות הפרוטוקול הנוכחי שלנו כבר בטוח בלמעלה מ 100 מתנדב במגוון של מינונים באמצעות שני זני חיידקים שונים 6. מחקר החל מינון באמצעות ס דלקת הריאות 6B ו23F כיום נערכים כדי לקבוע את מינון החיסון האופטימלי להובלה 50%. שיעור 50% חזה בכרכרה יאפשר מודל EHPC יש רגישות גבוהה ליעילות חיסון עם מספרי לימוד קטנים.

אנחנו ניסיון יש inoculating 159 אנשים, מתוכם 35 בצעו pneumococcus. המינון הנמוך ביותר שהשגנו עגלה עם שימוש סרוטיפ 6B היה 11,100 CFU/100 μl לnaris, המינון הגבוה ביותר היה 313.000 CFU/100 μl לnaris. המינון הנמוך ביותר שהשגנו עגלה עם שימוש 23F סרוטיפ היה 9000 CFU/100 μl לnaris, המינון הגבוה ביותר היה 84,500 CFU/100 μl לnaris. שיטת הערכת כרכרה שלנו היא שטיפת אף, נבחרה כי מחקר שנערך לאחרונה הראה כי 10 91% ממתנדבים מצאו שטיפת אף להיות יותר נוח מספוגית אף ולוע; שטיפת האף הייתה גם סיכוי גבוהה יותר לזהות פתוגנים באמצעות תרבות מיקרוביולוגית. פלורה של חיידקים שנמצאה על צלחות אגרו דם מחוסן עם NW יכולה להיות משתנית וקשה לקריאה. גנטמיצין משמש בצלחת אגרה הדם הראשונה לבחירה לpneumococcus. הצלחת אגרה שוקולד והצלחת אגרו דם 2 המשמשים לאיתור נתיב נשימה פוטנציאלי אחרogens שעשויה לעזור או להפריע קולוניזציה pneumococcal. דוגמה של צלחת אגרה דם מחוסן עם NW שהוא קל לקריאה מוצגת באיור 1 א; צלחת קשה המכילה סוגים רבים של צמחייה מוצגת באיור 1b. בכל מתנדבי מינוי התבקשו לתאר כל תסמינים בדרכי נשימה עליונים, אם קיים, והשוואה בין ספקי תקשורת וספקים שאינם הייתה מודגשת. מבין 145 האנשים מחוסנים לאחרונה עם pneumococcus, 28 התלוננו על תסמינים (טבלה 1). שמונה מתוכם היו נישאים, 20 לא היו. התסמינים השכיחים ביותר היו תסמיני אף שאינם ספציפיים (טבלה 1). מהמקרים שבם דווחו תסמינים מערכתיים, כולל חום ו / או תחושת חולי, אף אחת מהחקירות שבוצעו הראה עדות למחלה ותסמיני דלקת ריאות היו עקבית עם זיהום ויראלי במקביל למעט במקרה אחד של דלקת שקדים. שתי positiv pneumococcalמתנדבי דואר טופלו באנטיביוטיקה. אחד התלונן על כאבי גרון וכאבי אוזניים, ולאחר פגישה עם רופא המחקר, המליץ ​​לו לקחת אנטיביוטיקה כאמצעי זהירות. מתנדב האחרים אובחן קליני עם דלקת שקדים. כל המתנדבים היו החלטה מהירה של תסמינים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" /> איור 1. צלחת אגרה דם מחוסן עם NW. הצלחות אגרו דם מחוסן עם NW יכולות להיות קשות לקריאה. 1a הוא דוגמה לצלחת שהיא קל לקריאה עם pneumococci נראה בבירור. 1b הוא צלחת עם המון צמחיית שיתוף מיישבת שהופך אותו יותר קשה לזהות אם pneumococci הוא הווה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תסמינים </td><td></td><td> מרכבה (n = 32) </td><td> לא מרכבה (n = 112) </td></tr><tr><td> כלתסמינים </td><td></td><td> 24% </td><td> 18% </td></tr><tr><td> מערכתי </td><td> חום </td><td> 3% </td><td> 4% </td></tr><tr><td></td><td> * מועקה </td><td> 9% </td><td> 4% </td></tr><tr><td> מקומי </td><td> אוזניים </td><td> 9% </td><td> 3% </td></tr><tr><td></td><td> אף </td><td> 0 </td><td> 10% </td></tr><tr><td></td><td> גרון </td><td> 12% </td><td> 3% </td></tr></tbody></table> טבלת 1. אפיונו של המתנדב דיווח על תסמינים בעקבות ס דלקת ריאות 6B חיסון. כל התלונות נבדקות על ידי ועדת הבטיחות החיצונית, ובעקבות חקירות מלאות, אין לו סימפטומים יוחסו למחלת דלקת ריאות. התסמינים השכיחים ביותר היו כאב גרון, אף ממולאים ומחל דמויית שפעת.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Human Pneumococcal Carriage at JoVE.com

Experimental Human Pneumococcal Carriage

מרכבת pneumococcal אנושית ניסויית מציעה מודל טבעי של קרון ומודל פוטנציאל לשימוש בפיתוח חיסון. טכניקה זו היא יקרה עדיין מורכבת וכרוכה בסיכון קליני על ידי החדרת הפתוגן לאדם. פתחנו פרוטוקול מפורט.

תובלת pneumococcal אנוש ניסויית

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K Views.  Liverpool School of Tropical Medicine. מרכבת pneumococcal אנושית ניסויית מציעה מודל טבעי של קרון ומודל פוטנציאל לשימוש בפיתוח חיסון. טכניקה זו היא יקרה עדיין מורכבת וכרוכה בסיכון קליני על ידי החדרת הפתוגן לאדם. פתחנו פרוטוקול מפורט.

Video: Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

גרורה ניסויית Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

הדור ניסויית של קרצינומה-Associated Fibroblasts (CAFs) מ Fibroblasts החלב אנוש

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

נוהל saphenous אדם הוורידים<em&gt; Ex Vivo</em&gt; זלוף וחיצוני חיזוק

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

אפיון רקמות לאחר שיטה חדשה חלוקה לעור מיקרו שתלי הדור

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology have been developed and utilized in vivo, they are limited in terms of allowing single cell resolution and continuous longitudinal recordings. Because of the transparency of the cornea, the anterior chamber of the eye (ACE) in mice is well suited to study human and mouse pancreatic islet cell biology. Here is a description of how this approach can be used to perform continuous longitudinal recordings of grafting and revascularization of individual human islet grafts. Human islet grafts are inserted into the ACE, using NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mice as recipients. This allows for the investigation of the expansion of recipient versus donor cells and the contribution of recipient cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft. Further, a step-by-step approach for image analysis and quantification of the islet volume or segmented vasculature and islet capsule forming recipient cells is outlined.

The goal of this protocol is to continuously monitor the dynamics of the human pancreatic islet engraftment process and the contributing host versus donor cells. This is accomplished by transplanting human islets into the anterior chamber of the eye (ACE) of an NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mouse recipient followed by repeated 2-photon imaging.

אורכי בהדמיית Vivo וכמת של השתלת אי הלבלב האנושי ותורם תאים מארחים בתא העין הקדמית

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...