وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس (جراند جائزة التحدي لاستكشاف SBG)، والمعاهد الوطنية للبحوث الصحية (NIHR)، مركز أبحاث الطب الحيوي في مجال أمراض الميكروبية، والشامل NIHR شبكة البحوث المحلية. نعترف NWDA لدعم البنية التحتية. نشكر الأستاذ J. N ايزر، جامعة ولاية بنسلفانيا والأستاذ P هيرمانز، جامعة نيميجن لعزلات المكورات الرئوية. بفضل لجنة السلامة EHPC على دعمهم وتقديم المشورة، لدينا جميع المتطوعين لمشاركتهم وماتيو Bangert لأخذ الصور.

<ol>
	<li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research.">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li><li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine.">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li><li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children.">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li><li>Wu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice.">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li><li>Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l., Collins, A., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage.">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PloS Pathogens. 8 (4), e1002622 (2012).</li><li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood.">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> The Journal of Hygiene. 38, 732-749 (1938).</li><li>Naclerio, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+release+after+nasal+airway+challenge+with+allergen.">Mediator release after nasal airway challenge with allergen.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, 597-602 (1983).</li><li>O'Brien, K. L., Nohynek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+a+WHO+working+group:+standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae.">Report from a WHO working group: standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae.</a> Pediatr. Infect. Dis J. 22, 133-140 (2003).</li><li>Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+nasopharyngeal+swab+and+nasal+wash,+using+culture+and+PCR,+in+the+detection+of+potential+respiratory+pathogens.">Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens.</a> BMC Research Notes. 4, 122 (2011).</li><li>McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage.">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

منصة EHPC لديها عدد من الاستخدامات المحتملة بما في ذلك استخدام كنموذج لقاح المخاطية وكبديل لحماية اختبار اللقاحات البروتين الرواية. هذه الطريقة تعتمد على تقنية التلقيح متسقة وعالية الجودة NW. يمكن استنساخ يكون مشكلة مع اللقاح. ونظرا لطبيعة متغير مأخوذة البكتيرية المجمدة، يمكن أن يكون من الصعب تكرار الجرعة المطلوبة. ويعتبر بمقدار النصف أو مضاعفة الجرعة المطلوبة داخل النطاق. من الأهمية بمكان أن يتم تحديد مقدار البكتيرية مباشرة قبل التلقيح والتالية، وذلك لتحديد بدقة الكمي لعدد من البكتيريا CFU. لهذا السبب قد يكون من المفيد أن التعيينات في وقت واحد حتى يحدث المتطوعين التي تحتاج الى أن تكون مستعدة واحد فقط اللقاح والطلاء الكمي القيام به قبل وبعد التلقيح يحدث ما لا يزيد عن 30 دقيقة بعيدا. طريقة NW يتطلب COOPEوالتموينية من المتطوعين وألا يكون الأسلوب الأمثل في الأطفال. إذا كان العائد أقل من 5 مل، ويمكن تكرار هذا الإجراء باستخدام ما يصل إلى 20 مل إضافية. قد يرتدي طقم أسنان تقليل العائد NW. إذا كان لديها منعت المتطوعين / الأنف المزدحمة والمالحة ينفد الأمامية بعد الإدراج، ونفخ الأنف، إدراج الحقنة أبعد قليلا إلى الوراء، وميل رأسه للخلف أكثر إذا لزم الأمر. وNW هو الاسلوب الذي يحصل على نحو أفضل مع الممارسة. وعادة ما يكون حجم بعض فقدت بذلك الهدف هو لعودة ما لا يقل عن 10 مل. إذا كان يمكن تذوق المتطوعين المالحة خلال NW ثم لم يتم الاتصال بين البلعوم الأنفي الخلفي والبلعوم مغلقة بشكل كاف لسان المتطوع. إذا المتطوع يبتلع معظم المالحة، وشرح الإجراء مرة أخرى، مع التركيز على دفع اللسان ضد سقف الفم. ثم كرر الإجراء لزيادة حجم إرجاعها. إذا كان يحتوي على NW substantالاتحاد العالمي للتعليم كمية من المخاط، فمن الأفضل لإزالته قبل الطرد المركزي. دوامة العينة وذلك لتخفيف أي شيء يمكن أن يكون منضما إلى المخاط ثم قم بإزالة أكبر قدر من القطع الكبيرة ممكن أثناء إزالة الملوحة وأقل قدر ممكن. تم إكمال عملية دراسة سابقة EHPC في الولايات المتحدة بأمان وليس لديه أحداث سلبية 11. لضمان سلامة استمرار النظام الأساسي EHPC، أنشأنا بروتوكول الطوارئ التي تقوم حول الوصول على مدار 24 ساعة لفريق البحث. يتم إعطاء المتطوعين تفاصيل الاتصال، والسماح لهم بالوصول إلى فريق البحث 24 ساعة في اليوم. يتم توفير أي رعاية الطبية اللازمة في مستشفى الجامعة الملكية ليفربول. كتدبير آخر للحماية، لجنة السلامة التي تتكون من الأطباء والعلماء من خارج مجموعة البحث يتلقى تقريرا أسبوعيا السلامة. التقرير يحتوي على جرعة البكتيريا تلقى كل متطوع وسواء تم الإبلاغ عن أي أعراض أو مرض. هذا التقرير يسمح للسلامة الأن دراسة ه نقد خارجيا دون تحيز. لجنة السلامة وتتوفر أيضا 24 ساعة في اليوم في حال من غير المحتمل حدوث طارئ.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> شركة </td><td> القط # </td></tr><tr><td> الغليسيرول </td><td> الصياد </td><td> G/0650/08 </td></tr><tr><td> 0.9٪ كلوريد الصوديوم </td><td> B. براون </td><td> 3627667 </td></tr><tr><td> مسحوق الحليب الخالي من الدسم </td><td> Fluka </td><td> 70166 </td></tr><tr><td> تريبتون الصويا مرق </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 211768 </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> BDH </td><td> 284504S </td></tr><tr><td> كولومبيا آجار الدم مع الحصان chocolated </td><td> OXOID </td><td> PB0124 </td></tr><tr><td> Pneumotest-اللاتكس مجموعة </td><td> معهد شتاتنز سيروم </td><td> 51823 </td></tr></tbody></table>

experimental human pneumococcal carriage

التجريبية النقل المكورات الرئوية الإنسان (EHPC) مهم علميا لنقل البلعوم من المكورات على حد سواء هو المصدر الرئيسي للنقل والشرط المسبق للمرض الغازية. وهناك نموذج النقل تسمح بتحديد دقيق لليرتبط المناعية للحماية، وأثر تحصين النقل وتأثير ضغط المضيف على الممرض في محراب البلعوم. مزيد من أساليب الكشف النقل مفيدة في الدراسات الوبائية، بما في ذلك دراسات اللقاح، يمكن مقارنة. هدف ونحن نهدف إلى تطوير منصة EHPC هذا هو وسيلة آمنة ومفيدة للتكرار التي يمكن أن تستخدم لتحديد أسفل اللقاحات المرشحة المكورات الرئوية الرواية مع منع النقل كبديل للحصانة اللقاح التي يسببها. فإنه سيتم العمل على اختبار اللقاحات المرشحة وصفا لآليات التي تقوم عليها EHPC وحماية اللقاح من carriaجنرال الكتريك 1. لقاحات المكورات الرئوية الحالية ضد حماية الأطفال من الأمراض الغازية على الرغم من أن هناك حاجة ماسة لقاحات جديدة باسم لقاح الحالي لا يمنح الحماية الأمثل ضد غير bacteraemic الالتهاب الرئوي وكان هناك دليل على استبدال النمط المصلي مع المنظمات غير قاح الأنماط المصلية 2-4. طريقة نحن مع تطعيم S. علقت الرئوية في 100 ميكرولتر من المياه المالحة. سلامة هو عامل رئيسي في تطوير نموذج EHPC ويتحقق من خلال فحص مكثفة ورصد المتطوعين. لجنة السلامة التي تتكون من الأطباء والعلماء التي هي مستقلة عن الدراسة تقدم تعليقات موضوعية على أساس أسبوعي. واللقاح الجرثومي هو موحدة ويتطلب أن يتم تلقيح أية منتجات حيوانية إلى المتطوعين (ذات أصل نباتي وسائل الإعلام والمالحة). الجرعات المطلوبة لاستعمار (10 4 -10 5) هي أقل بكثير ثان تلك المستخدمة في النماذج الحيوانية (10 7) 5. الكشف عن المكورات الرئوية النقل تتعزز وحدة عالية (مثالي&gt; 10 مل) غسل الأنف وهذا هو المخاط نسبيا الحرة. وهذا البروتوكول تعامل مع أهم أجزاء من بروتوكول بدوره. هذه هي (أ) اختيار المتطوعين، (ب) إعداد اللقاح المكورات الرئوية، التلقيح (ج) و (د) متابعة و (ه) الكشف عن النقل. النتائج كان لدينا بروتوكول الحالية آمنة في أكثر من 100 متطوع في مجموعة من الجرعات باستخدام النمطين المصليين البكتيرية المختلفة 6. دراسة الجرعة تتراوح باستخدام S. حاليا الرئوية 6B و23F تجرى لتحديد الجرعة المثلى للنقل التلقيح 50٪. وهناك معدل توقع 50٪ من النقل تسمح للنموذج EHPC أن يكون حساسية عالية للنجاعة اللقاح مع أعداد دراسة صغيرة.

لدينا خبرة بتلقيح 159 شخصا، منها 35 قامت المكورات الرئوية. كان أقل جرعة حققنا النقل مع استخدام النمط المصلي 6B 11100 CFU/100 ميكرولتر في المنخر، وكان أعلى جرعة 313،000 CFU/100 ميكرولتر في المنخر. كان أقل جرعة حققنا النقل مع استخدام النمط المصلي 23F 9000 CFU/100 ميكرولتر في المنخر، وكان أعلى جرعة 84500 CFU/100 ميكرولتر في المنخر. أسلوبنا في تقييم النقل هو غسل الأنف، لأن اختيار دراسة حديثة أظهرت أن 10 91٪ من المتطوعين وجدت غسل الأنف لتكون أكثر راحة من مسحة البلعوم، وغسل الأنف وكان أيضا أكثر عرضة للكشف عن مسببات الأمراض باستخدام ثقافة الميكروبيولوجية. يمكن استرداد النباتات الجرثومية على لوحات أجار الدم تلقيح مع NW يكون متغير ويصعب قراءتها. يتم استخدام الجنتاميسين على لوحة أجار الدم لتحديد أول من المكورة الرئوية. وتستخدم لوحة أجار أجار الشوكولاته والدم وحة ثانية لكشف مسار الجهاز التنفسي الأخرى المحتملةogens التي قد تساعد أو تعوق الاستعمار المكورات الرئوية. ويرد مثال على لوحة أجار الدم تلقيح مع NW التي هي سهلة لقراءة الشكل 1A في؛ يظهر لوحة تحتوي على أنواع عديدة من الصعب من النباتات في الشكل 1B. في كل المتطوعين وطلب تعيين لوصف أي أعراض الجهاز التنفسي العلوي، إذا كان موجودا، وسلط الضوء مقارنات بين شركات الطيران وشركات النقل غير. الشعب تلقيح 145 مؤخرا مع المكورة الرئوية، اشتكى 28 من أعراض (الجدول 1). وكان ثمانية من هذه الناقلات والعشرين لم تكن. وأكثر الأعراض شيوعا الأعراض غير النوعية الأنف (الجدول 1). من الحالات التي تم الإبلاغ عن وجود الأعراض الشاملة، بما في ذلك الحمى و / أو الشعور بالضيق، وأظهرت أيا من التحقيقات التي دليلا على مرض المكورات الرئوية وأعراض تتفق مع التهاب فيروسي المتزامنة إلا في حالة واحدة من التهاب اللوزتين. اثنين ايجابيات المكورات الرئويةوعولج بالمضادات الحيوية المتطوعين ه. اشتكى أحد التهاب الحلق وآلام الأذن، وبعد لقاء مع الطبيب دراسة، وأبلغت إلى تناول المضادات الحيوية كإجراء وقائي. تم تشخيص المتطوعة الأخرى سريريا مع التهاب اللوزتين. كان جميع المتطوعين حل سريع لهذه الأعراض. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" /> الشكل 1. أجار الدم وحة تلقيح مع NW. لوحات أجار الدم تلقيح مع NW يمكن أن يكون من الصعب قراءتها. 1A مثال على لوحة التي هي سهلة لقراءة مع المكورات الرئوية واضحة للعيان. 1B هو لوحة مع الكثير من شارك في استعمار النباتات مما يجعله أكثر يصعب اكتشاف إذا المكورات الرئوية موجودا. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الأعراض </td><td></td><td> النقل (ن = 32) </td><td> لا النقل (ن = 112) </td></tr><tr><td> جميعالأعراض </td><td></td><td> 24٪ </td><td> 18٪ </td></tr><tr><td> النظامية </td><td> حمى </td><td> 3٪ </td><td> 4٪ </td></tr><tr><td></td><td> * الشعور بالضيق </td><td> 9٪ </td><td> 4٪ </td></tr><tr><td> محلي </td><td> آذان </td><td> 9٪ </td><td> 3٪ </td></tr><tr><td></td><td> أنف </td><td> 0 </td><td> 10٪ </td></tr><tr><td></td><td> حنجرة </td><td> 12٪ </td><td> 3٪ </td></tr></tbody></table> الجدول 1. ذكرت توصيف المتطوعين الأعراض التالية S. 6B الرئوية التلقيح. تم استعراض جميع الشكاوى المقدمة من لجنة السلامة الخارجية، وبعد تحقيقات كاملة، ونسبت أي أعراض للمرض المكورات الرئوية. وأكثر الأعراض شيوعا التهاب الحلق، محشوة الأنف ومرض شبيه بالإنفلونزا.

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Human Pneumococcal Carriage at JoVE.com

Experimental Human Pneumococcal Carriage

التجريبية النقل المكورات الرئوية الإنسان تقدم نموذجا الطبيعية النقل ونموذج محتمل لاستخدامها في تطوير اللقاحات. هذه التقنية هي قيمة بعد معقدة وتنطوي على مخاطر السريرية من خلال تقديم الممرض إلى الإنسان. قمنا بتطوير بروتوكول مفصلة.

التجريبية النقل المكورات الرئوية الإنسان

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K Views.  Liverpool School of Tropical Medicine. التجريبية النقل المكورات الرئوية الإنسان تقدم نموذجا الطبيعية النقل ونموذج محتمل لاستخدامها في تطوير اللقاحات. هذه التقنية هي قيمة بعد معقدة وتنطوي على مخاطر السريرية من خلال تقديم الممرض إلى الإنسان. قمنا بتطوير بروتوكول مفصلة.

Video: Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

الفحص التجريبي الإنبثاث

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

الجيل التجريبية للسرطان ، المرتبطين بها الخلايا الليفية (مقاهي) من الخلايا الليفية الثديية البشرية

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

زرع الخلايا الجذعية في في المختبر مقلد نقص التروية / إعادة إشباع الخلايا النموذجي

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

إجراءات الصافن عروق الإنسان<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الإرواء والتعزيز الخارجي

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لدراسة هرمون العمل في الثدي البشري

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

توصيف الأنسجة بعد طريقة جديدة تصنيفها فيما يتعلق الجلد الصغرى الطعوم الجيل

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

ثلاثي الأبعاد الثقافة الجيني حبة من خلايا الإنسان ورم الغدة النخامية

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

المتقدمة التصوير من الرئة صاروخ موجه الخلايا الليمفاوية البشرية في التجريبية في نموذج فيفو للالتهاب التحسسي استناداً إلى ورقة الخفيفة الميكروسكوب

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology have been developed and utilized in vivo, they are limited in terms of allowing single cell resolution and continuous longitudinal recordings. Because of the transparency of the cornea, the anterior chamber of the eye (ACE) in mice is well suited to study human and mouse pancreatic islet cell biology. Here is a description of how this approach can be used to perform continuous longitudinal recordings of grafting and revascularization of individual human islet grafts. Human islet grafts are inserted into the ACE, using NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mice as recipients. This allows for the investigation of the expansion of recipient versus donor cells and the contribution of recipient cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft. Further, a step-by-step approach for image analysis and quantification of the islet volume or segmented vasculature and islet capsule forming recipient cells is outlined.

The goal of this protocol is to continuously monitor the dynamics of the human pancreatic islet engraftment process and the contributing host versus donor cells. This is accomplished by transplanting human islets into the anterior chamber of the eye (ACE) of an NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mouse recipient followed by repeated 2-photon imaging.

الطولية في التصوير فيفو و الكم من تطعيم جزيرة البنكرياس الإنسان والخلايا المضيفة المساهمة في غرفة العين الأمامية

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...