Este trabalho foi financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates (Grande prêmio Exploração Desafio da SBG), o Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde (NIHR), Centro de Pesquisa Biomédica em Doenças Microbianas, eo NIHR Rede de Pesquisa Global Local. Reconhecemos a NWDA de apoio infra-estrutural. Agradecemos ao Prof J. N Weiser, da Universidade da Pensilvânia e Prof P Hermans, da Universidade de Nijmegen para os isolados de pneumococo. Graças ao Comitê de Segurança EHPC por seu apoio e conselho, a todos os nossos voluntários para a sua participação e Mathieu Bangert para tirar as fotos.

1. Voluntários de Seleção e Triagem <ol><li> Voluntários saudáveis ​​são recrutados por meio de anúncios de cartazes e no site da Universidade de acordo com a Pesquisa NHS e orientação Comitê de Ética. </li><li> Os critérios de inclusão para participação são: <ol><li> Adultos com idade entre 18-60 anos. </li><li> Fala fluentemente Inglês e é capaz de se comunicar facilmente por tanto o telefone móvel e mensagens de texto. </li></ol></li><li> Os critérios de exclusão para a participação são: <ol><li> O contato próximo com a indivíduos de risco (crianças, adultos imunodeprimidos, idosos, saúde crônica doente). </li><li> História de tabagismo atual fumante ou significativa (anos&gt; 10 maços). </li><li> Asma ou outras doenças respiratórias. </li><li> Gravidez. </li><li> Alergia à penicilina ou amoxicilina. </li><li> Participação atual em outro ensaio clínico, a menos observacional ou não-intervencionista fase. </li><li> Incapaz de dar consentimento plenamente informado. </li></ol></li><li>Uma visita de triagem inicial, cerca de uma semana antes da inoculação, inclui uma história focada clínica e exame clínico-alvo. </li><li> Se uma anormalidade até então desconhecida é encontrada, o voluntário será excluído do estudo e investigação apropriada será organizado através da atenção primária. </li><li> Durante a visita de rastreio inicial de uma contagem de sangue completo é obtido a assegurar que a contagem de células brancas está dentro do intervalo normal, antes da visita de inoculação. A lavagem nasal é realizada para excluir portadores de pneumococos naturais (ver 6.1). </li><li> Antes da inoculação, os voluntários são instruídos sobre os riscos envolvidos com a participação no estudo e são fornecidos com um folheto informativo de emergência, termômetro digital, números de telefone de emergência e três dias de curso de amoxicilina. </li></ol> 2. Preparação de Ações de inoculação <ol><li> Preparação dos stocks de inoculação deve ser feito num ambiente limpo. As pipetas usadas só deve ser usard para a preparação do inoculo. Todo o vidro e utensílios de plástico deve ser estéril. Nós recomendamos que os estoques de inoculação ser preparado de uma sala dedicada, utilizando um fumehood dedicado e incubadora. </li><li> Estirpes pneumocócicas são inoculadas em uma placa de ágar sangue. As placas são incubadas a 37 ° C em 5% de CO 2 durante a noite. No dia a seguir todas as bactérias é raspada da placa de agar de sangue e inoculadas em um sistema de preservação do grânulo estoque. Estes estoques de contas são utilizadas para preparação da inoculação. Teste os estoques talão de contaminação e uniformidade colônia antes de preparar um estoque de inoculação. </li><li> Para preparar o stock de inoculação, inocular uma placa de ágar de sangue com dois rebordos do pneumococos do serotipo estoque desejado grânulo, listando-se a cobrir a totalidade da placa. Incubar as placas a 37 ° C em 5% de CO2 durante a noite. Todas as incubações adicionais irão utilizar as mesmas condições. Também incubar os meios Vegitone durante a noite para garantir a esterilidade. </li><li> O cotonete manhã seguintemeia a placa, não tendo o cuidado de remover qualquer ágar sangue, e adicionar 12 ml de pré-aquecido caldo Vegitone. Repita usando a outra metade da placa. Deixar os dois frascos de 12 ml a 37 ° C durante 2 horas ou até que uma alteração na turvação torna-se aparente, o que ocorrer primeiro. </li><li> Adicionar a 12 ml a 40 ml de caldo de pré-aquecida Vegitone e misturar completamente. Repita para o outro frasco ml 12. Este é o ponto de tempo = 0. Remover 100 ul para ler a densidade óptica (DO) a 600 nm. Remover 20 pi para a quantificação de bactérias formadoras de colónias por unidade (CFU) de contagem usando uma variação do método de Miles e Misra (M &amp; M) 7. Incubar ambos os frascos. <ol><li> Para o M &amp; M, dividir uma placa de ágar sangue em seis seções. Adicionar 180 ul de PBS estéril a seis poços de uma placa de 96 poços (fundo em U). Adicionar 20 ul de caldo para o bem de topo e misturar. Serialmente diluir a amostra 1:10 seis vezes e descartar 20 ul do poço sexto. Coloque três gotas 10 uL do bem superior na primeira seção doágar-sangue. Repetir para os cinco outros poços. Assegurar a placa é seca antes de ser invertidas e incubadas. </li><li> No dia seguinte, contar o número de colónias visíveis em cada secção de diluição e de gravação. Usando o ponto de diluição com uma contagem de entre 30 e 300, dividir o número de colónias visíveis por três, para obter uma média. </li><li> Multiplicar o número médio de colónias por o factor de diluição e, em seguida, dividir por 10 (o valor da queda de 10 uL). Isto dá UFC / ul. </li><li> Multiplicar esse número por 1000 para obter CFU / ml. </li></ol></li><li> Realize OD 600 leituras e quantificação de bactérias por M &amp; M método a cada hora até meados fase log precoce é alcançado, uma DO de 0,25. </li><li> Uma vez que isto é alcançado OD, adicionar 10% de glicerol esterilizado para um frasco e preparar alíquotas de 1 ml. Alíquotas de armazenar a -80 ° C. </li><li> A uma unidade mais concentrada, centrifugar a outra cuvete de 3.345 xg durante 15 min e remover o sobrenadante. Ressuspender o pellet em 22,5 ml de Vegitone meio e adicionar 10% de glicerol. Preparar alíquotas de 1 ml e armazenar a -80 ° C. </li><li> Deixar stocks a -80 ° C durante pelo menos 48 horas antes de descongelação e de quantificação. </li><li> Quantificar o estoque de congelados bacteriana pelo método de M &amp; M. Teste três tubos de ações individualmente para garantir a reprodutibilidade. Utilizar o valor obtido para diluir o material até a concentração desejada em solução salina de inoculo, como descrito abaixo. </li><li> Para a inoculação, a quantidade de pneumococos no inoculo é calculada antes e depois da inoculação. Esta quantificação de bactérias pelo método de M &amp; M é utilizado para determinar o número médio de pneumococos no inoculo que representa o tempo que leva a completar todo o procedimento. <ol><li> Preparar um inoculo, a diluição até à concentração desejada e realizar a quantificação pelo método de M &amp; M para o &quot;pré-inoculação&quot; count. </li><li> No nosso Centro de Pesquisa Clínica que leva a equipe de 30 minutos para completar o processo de inoculação inteiro. Pneumococcal suspensões em soro fisiológico normalmente irá mostrar uma contagem diminuída neste intervalo. Para ter em conta isto, nós Deixe o inóculo diluído à temperatura ambiente durante 30 min e, em seguida, executar uma &quot;pós-inoculação&quot; quantificação das bactérias pelo método de M &amp; M. </li><li> Tomar a média do antes e depois de determinar a concentração final inoculado. Ajuste a &quot;sessão&quot; tempo de acordo com o protocolo clínico, mas manter o intervalo tão breve quanto possível. </li></ol></li><li> Todos os novos lotes deve ser enviado para um laboratório de referência para a confirmação da pureza e identidade de estoque. </li></ol> 3. Preparação do inóculo <ol><li> Preparação do inoculo deve começar antes de 30 min o agendamento voluntário inoculação. </li><li> Pegue um dos tubos de ações feitas anteriormente fora do congelador -80 ° C, descongele-o e girar o tubo na microcentrífuga a 17.000 xg por 3 min. </li><li> Placas de agar de sangue quente na incubadora a 37 ° C. Prepararuma placa de 96 cavidades para a quantificação de bactérias pelo método de M &amp; M e preparar tubos de diluição de acordo com a dose desejada. </li><li> Remover o sobrenadante do caldo de tubo centrifugado e ressuspender o pellet em 1 ml de solução salina. Este passo remove o caldo do inóculo. </li><li> Repetir o passo de centrifugação. </li><li> Remover o sobrenadante salina e ressuspender o sedimento em 1 ml de solução salina. </li><li> Executar conjunto de diluição para a concentração desejada de inóculo e quantificar por M &amp; M método. </li><li> Leve o inóculo para o compromisso voluntário e após a inoculação dos voluntários, repita a quantificação no laboratório. Rotular o tubo com a data e a dose de inoculo e armazenar a -80 ° C. </li><li> Para garantir a consistência da inoculação para a inoculação, é importante usar as mesmas pipetas e equipamento de laboratório dedicado a cada vez. </li></ol> 4. Inoculação <ol><li> Os voluntários devem estar sentado confortavelmente em uma posição semi-deitada. </li><li&gt; Com uma pipeta P200 e estéreis pontas com filtro elaborar 100 ul do inóculo e insira a ponta dentro da cavidade nasal. </li><li> Lentamente expelir o inoculo para a mucosa nasal, usando um movimento circular. </li><li> É fundamental que a ponta da pipeta não entra em contacto com a mucosa nasal, como uma interrupção na integridade do epitélio pode resultar em que as bactérias que entram na corrente sanguínea. </li><li> É também vital que o inóculo não é colocado muito para trás, ou ele vai correr pela garganta, que devem residir no interior da cavidade nasal. </li><li> Repita a operação para o outro naris. </li><li> Têm o voluntário permanecer na posição de semi-deitada durante 10 min sem cheirar ou assoar o nariz. Isto permite o tempo para as bactérias se dispersar através da mucosa. </li></ol> 5. Monitoramento <ol><li> Os voluntários são monitorados diariamente após inoculação. Isso inclui uma mensagem de texto enviado diariamente pelo voluntário para investigadores antes de 2 horas. </li><li> Se o texto inão é recebido por duas horas o voluntário será contactado para garantir a sua / o seu bem-estar. Se ele / ela não responder, o próximo alocado de parentes será contactado para garantir o voluntário do bem-estar. </li><li> Voluntários são convidados a relatar quaisquer sintomas do trato respiratório superior, a cada nomeação. Corpo clínico vai pedir ao voluntário para descrever suas / seus sintomas e irá acompanhar quaisquer queixas. </li><li> Os antibióticos dadas aos voluntários são só deve ser tomada em três circunstâncias: no caso de que eles estão bem e são orientados a levá-los pela equipe de pesquisa, se eles estão carregando pneumococo no final do estudo, ou se eles são mal e não conseguiu contatar a equipe de pesquisa. O voluntário é encorajado a manter este pacote de emergência com eles em todos os momentos durante o estudo e é contactar a equipe de pesquisa em uma base diária para os próximos 7 dias. </li><li> Nossa equipe está disponível 24/7 com o contato enfermeira durante as horas de trabalho e dois médicos disponíveis de hours. Todas as consultas são tratados por chamada telefónica e / ou revisão imediata. Provisões estão disponíveis para admissão imediata e direta a uma ala de Doenças Infecciosas, se necessário. </li></ol> 6. Nasal Wash (NW) Procedimento <ol><li> Lavagens nasais (NW) são realizados a uma visita de rastreio inicial, bem como 48 horas, 7 e 14 dias pós-inoculação. O método utilizado é tomado NW de Naclerio et al. Oito voluntários naturalmente colonizado por S. pneumoniae são excluídos da inoculação e acompanhamento. </li><li> O voluntário está sentado confortavelmente ea cabeça inclinada para trás 30 ° com a vertical. </li><li> Peça ao voluntário para tomar uma respiração profunda e segurar a respiração enquanto empurrando a sua língua para cima e para trás, contra o céu da boca. Enquanto nessa posição, o voluntário é convidado a indicar que eles estão prontos. </li><li> A seringa cheia com 20 ml de solução salina é inserido no espaço nasal anterior e 5 ml de solução salina é expelido. O volunteer então se inclina para frente imediatamente e expulsa o fluido por exalar rapidamente através de seu nariz em uma bacia de alumínio. </li><li> Repetir este procedimento 3 vezes mais, de modo que cada naris foi lavado duas vezes e os 20 ml cheio tiver sido utilizado. </li><li> Piscina de todas as amostras em conjunto num tubo de centrífuga e envie para o laboratório à temperatura ambiente durante o processamento. </li></ol> 7. Nasal Wash Processamento <ol><li> Centrifugar as amostras durante 10 min a 3.345 x g. </li><li> Remover o sobrenadante e armazenada como alíquotas de 1 ml em tubos Eppendorf marcados à temperatura de -80 ° C. </li><li> Adicionam-se 100 ul de meio STGG 9 do pellet e misture bem. Certifique-se de que o volume total dentro do tubo neste ponto é determinado. Esta diluição será usada para calcular o CFU de uma carruagem NW positivo. </li><li> Placa de queda de 20 ul da STGG contendo o sedimento ressuspenso para uma placa de agar de sangue contendo gentamicina e raia a placa inteira. <ol><li> Se o NW é pós-inoculação, 10 ul de remover o STGG contendo o sedimento ressuspenso e utilização para a quantificação de bactérias por M &amp; M método. </li></ol></li><li> Adicione mais 800 ul de STGG ao tubo NW e misture bem. </li><li> Ul placa 25 sobre uma placa de agar de sangue e de 25 ul numa placa de ágar de chocolate, listando a placa inteira. </li><li> Dividir as bactérias em suspensão numa quantidade restante STGG médio em 2 criotubos e armazenar a -80 ° C. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C durante a noite em 5% de CO 2. </li><li> Examine as placas no dia seguinte para pneumococo e outros patógenos respiratórios potenciais. </li><li> Os pneumococos são identificados em placas por meio da morfologia de colónias. Colónias hemolíticas com morfologia alfa relator são sub-cultivadas em agar de sangue, com um disco de optoquina e incubadas durante a noite. </li><li> Presumíveis colónias de pneumococos que são optoquina sensíveis são Gram para confirmar diplococos Gram positiva e sorotipadas usando o Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit. </li></ol>

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	<li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research.">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li><li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine.">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li><li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children.">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li><li>Wu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice.">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li><li>Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l., Collins, A., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage.">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PloS Pathogens. 8 (4), e1002622 (2012).</li><li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood.">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> The Journal of Hygiene. 38, 732-749 (1938).</li><li>Naclerio, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+release+after+nasal+airway+challenge+with+allergen.">Mediator release after nasal airway challenge with allergen.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, 597-602 (1983).</li><li>O'Brien, K. L., Nohynek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+a+WHO+working+group:+standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae.">Report from a WHO working group: standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae.</a> Pediatr. Infect. Dis J. 22, 133-140 (2003).</li><li>Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+nasopharyngeal+swab+and+nasal+wash,+using+culture+and+PCR,+in+the+detection+of+potential+respiratory+pathogens.">Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens.</a> BMC Research Notes. 4, 122 (2011).</li><li>McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage.">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A plataforma EHPC tem um número de utilizações potenciais, incluindo o uso como um modelo de vacina da mucosa e como um substituto da protecção para teste de vacinas de proteínas novos. O método depende de uma técnica de inoculação consistente e de alta qualidade NW. Reprodutibilidade pode ser um problema com o inóculo. Devido à natureza variável das alíquotas congeladas bacterianas, que podem ser difíceis de replicar a dose desejada. Uma redução para metade ou dobrar a dose desejada é considerada dentro do alcance. É fundamental que a quantificação de bactérias ser feito imediatamente antes e após a inoculação, a fim de determinar com precisão a quantificação de bactérias por contagem de CFU. Por esta razão, pode ser útil, se os compromissos voluntários ocorrem simultaneamente, de modo que apenas um inoculo precisa ser preparado e o revestimento de quantificação feito antes e após a inoculação ocorre não mais do que 30 min. O método requer a NW Cooperação do voluntário e não seria um método ideal em crianças. Se o rendimento é inferior a 5 ml, o procedimento pode ser repetido usando-se a um extra de 20 ml. Uso de próteses podem reduzir o rendimento NW. Se o voluntário tem um nariz entupido / congestionado ea solução salina está se esgotando anteriormente após a inserção, assoar o nariz, insira a seringa um pouco mais para trás, e inclinar a cabeça para trás mais, se necessário. O NW é uma técnica que fica melhor com a prática. Algum volume será geralmente perdido para o objectivo é que o retorno de pelo menos 10 ml. Se o voluntário pode saborear fisiológica durante a NW então a conexão entre a nasofaringe e orofaringe posterior não tem sido adequadamente fechado pela língua do voluntário. Se a maioria dos voluntários engole da salina, explicar o procedimento novamente, enfatizando a empurrar a língua contra o céu da boca. Em seguida, repita o procedimento para aumentar o volume retornado. Se a NW contém uma substantial quantidade de muco, o melhor é removê-lo antes da centrifugação. Vortex a amostra, de modo a soltar qualquer coisa que possa ser ligado ao muco e, em seguida, remover o máximo dos pedaços grandes quanto possível, durante a remoção, como solução salina pouco quanto possível. Um estudo anterior EHPC nos EUA foi concluída com segurança e sem eventos adversos 11. Para garantir a segurança permanente da plataforma EHPC, temos um conjunto de um protocolo de emergência, que é baseada em torno de acesso 24 horas para a equipe de pesquisa. Voluntários recebem detalhes de contato, permitindo-lhes o acesso à equipe de pesquisa 24 horas por dia. Qualquer assistência médica necessária é fornecida no Royal Liverpool University Hospital. Como medida adicional de proteção, um comitê de segurança composto por médicos e cientistas de fora do grupo de pesquisa recebe um relatório de segurança semanal. O relatório contém a dose bacteriana cada voluntário recebeu e se algum dos sintomas ou doença foram notificados. Este relatório permite a segurança do diaestudo e de ser criticado externamente sem viés. O comitê de segurança também estão disponíveis 24 horas por dia, no caso improvável de uma emergência.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Cat # </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> G/0650/08 </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio a 0,9% </td><td> B. Braun </td><td> 3627667 </td></tr><tr><td> Leite desnatado em pó </td><td> Fluka </td><td> 70166 </td></tr><tr><td> Triptona soja caldo </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211768 </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> BDH </td><td> 284504S </td></tr><tr><td> Agar Columbia com sangue de cavalo chocolated </td><td> Oxoid </td><td> PB0124 </td></tr><tr><td> Pneumotest-latex kit </td><td> Statens Serum Institut </td><td> 51823 </td></tr></tbody></table>

experimental human pneumococcal carriage

Transporte pneumocócica experimental humano (EHPC) é cientificamente importante porque nasofaríngea dos Streptococcus pneumoniae é a fonte principal de transmissão e o pré-requisito de doença invasiva. Um modelo de transporte permitirá a determinação precisa dos correlatos imunológicos de proteção, o efeito da imunização de transporte e o efeito da pressão de acolhimento sobre o patógeno no nicho da nasofaringe. Além disso, os métodos de detecção de transporte útil em estudos epidemiológicos, incluindo estudos de vacinas, podem ser comparados. Visar Nosso objetivo é desenvolver uma plataforma EHPC que é um método seguro e útil reprodutível, que poderia ser usado para baixo-selecionar candidatos vacinas pneumocócicas romance com a prevenção de transporte como um substituto de imunidade da vacina induzida. Ele vai trabalhar para testes de vacinas candidatas e descrições dos mecanismos subjacentes EHPC e proteção da vacina a partir carriage 1. Atuais vacinas conjugadas contra o pneumococo proteger as crianças contra a doença invasiva, embora novas vacinas são urgentemente necessários, como a atual vacina não confere proteção ideal contra os não-bacteriémica pneumonia e não houve evidência de substituição sorotipo com vacinas sorotipos não 2-4. Método Nós inocular com S. pneumoniae em suspensão em 100 uL de soro fisiológico. A segurança é um factor importante no desenvolvimento do modelo de EHPC e é conseguido através de um rastreio de voluntários intensivos e monitorização. Um comitê de segurança composto por médicos e cientistas que são independentes do estudo fornece feedback objetivo em uma base semanal. O inóculo bacteriano é padronizado e exige que nenhum produto de origem animal são inoculados em voluntários (à base de vegetais mídia e salinas). As doses necessárias para a colonização (10 4 -10 5) são muito mais baixos than aqueles usados ​​em modelos de animais (10 7) 5. Detecção de portador de pneumococos é reforçada por um elevado volume (de preferência&gt; 10 ml) lavagem nasal que é relativamente livre de muco. Este protocolo irá lidar com as partes mais importantes do protocolo, por sua vez. Estes são: (a) seleção de voluntários, (b) a preparação do inóculo pneumocócica, (c) a inoculação, (d) acompanhar e (e) a detecção de transporte. Resultados Nosso protocolo atual tem sido seguro em mais de 100 voluntários em uma gama de doses usando dois diferentes sorotipos bacterianos 6. Um estudo utilizando doses variando S. pneumoniae 6B e 23F está actualmente a ser realizado para determinar a dose óptima para o transporte de inoculação de 50%. A taxa prevista de 50% de transporte permite que o modelo EHPC ter alta sensibilidade para a eficácia da vacina com números de estudo de pequenas dimensões.

Temos experiência de inocular 159 pessoas, dos quais 35 têm realizado pneumococo. A dose mais baixa que conseguida com o uso de transporte serotipo 6B era 11100 ufc/100 ul por naris, a dose mais elevada foi de 313.000 ufc/100 ul por naris. A dose mais baixa que conseguimos com o uso de transporte 23F sorotipo foi 9000 ufc/100 ul por naris, a dose mais elevada foi 84.500 ufc/100 ul por naris. Nosso método de avaliação de transporte é uma lavagem nasal, escolhido por um estudo recente 10 mostrou que 91% dos voluntários encontrou lavagem nasal para ser mais confortável do que swab de nasofaringe, a lavagem nasal também foi mais fácil detectar patógenos por meio de cultura microbiológica. Flora microbiana recuperados em placas de ágar sangue inoculados com NW pode ser variável e difícil de ler. A gentamicina é usado na primeira placa de ágar de sangue para seleccionar para pneumococo. A placa de agar de chocolate e a placa de ágar de sangue segundo são utilizados para detectar caminho respiratória outro potencialOgens que podem ajudar ou dificultar a colonização pneumocócica. Um exemplo de uma placa de agar de sangue inoculadas com NW que é fácil de ler é mostrado na Figura 1A, com uma placa de difícil contendo vários tipos de flora é mostrado na Figura 1b. A cada nomeação voluntários foram solicitados a descrever os sintomas do trato respiratório superior, se presente, e comparações entre portadores e não-portadores foram destaque. Das 145 pessoas recentemente inoculados com o pneumococo, 28 queixaram-se de sintomas (Tabela 1). Oito deles eram portadores, 20 não eram. Os sintomas mais comuns eram não específicas sintomas nasais (Tabela 1). Dos casos em que não foram relatados sintomas sistêmicos, como febre e / ou mal-estar, nenhuma das investigações realizadas mostraram evidência de doença pneumocócica e os sintomas eram compatíveis com a infecção viral concomitante, exceto em um caso de amigdalite. Dois positiv pneumocócicavoluntários de e foram tratados com antibióticos. Se queixou de dor de garganta e dor de ouvido e, depois de se encontrar com o médico do estudo, foi aconselhado a tomar antibióticos como precaução. O outro voluntário foi diagnosticado clinicamente com amigdalite. Todos os voluntários tiveram resolução rápida dos sintomas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" /> Figura 1. Placa de agar de sangue inoculadas com NW. Placas de agar de sangue inoculadas com NW pode ser difícil de ler. 1a é um exemplo de uma placa que é fácil de ler com pneumococos claramente visível. 1b é uma placa com vários co-colonizadoras flora tornando mais difícil detectar se pneumococo está presente. <table border="1"><tbody><tr><td> Os sintomas </td><td></td><td> Transporte (n = 32) </td><td> Não Transporte (n = 112) </td></tr><tr><td> Todossintomas </td><td></td><td> 24% </td><td> 18% </td></tr><tr><td> Sistêmico </td><td> Febre </td><td> 3% </td><td> 4% </td></tr><tr><td></td><td> * Mal-estar </td><td> 9% </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Local </td><td> Orelhas </td><td> 9% </td><td> 3% </td></tr><tr><td></td><td> Nariz </td><td> 0 </td><td> 10% </td></tr><tr><td></td><td> Garganta </td><td> 12% </td><td> 3% </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Caracterização de voluntários relataram sintomas seguindo S. pneumoniae 6B inoculação. Todas as reclamações foram analisadas pelo comitê de segurança externa e, após investigações completas, sem sintomas foram atribuídos à doença pneumocócica. Os sintomas mais comuns foram dor de garganta, nariz e recheado síndrome gripal.

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Experimental Human Pneumococcal Carriage

Transporte pneumocócica Experimental humano oferece um modelo natural de transporte e um modelo potencial para uso no desenvolvimento de vacinas. Esta técnica é útil mas complexo e envolve o risco clínico através da introdução de um agente patogénico para um ser humano. Nós desenvolvemos um protocolo detalhado.

Transporte pneumocócica experimental humana

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

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JoVE Journal

Medicine

15.4K visualizações.  Liverpool School of Tropical Medicine. Transporte pneumocócica Experimental humano oferece um modelo natural de transporte e um modelo potencial para uso no desenvolvimento de vacinas. Esta técnica é útil mas complexo e envolve o risco clínico através da introdução de um agente patogénico para um ser humano. Nós desenvolvemos um protocolo detalhado.

Vídeo: Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Ensaio Metástase Experimental

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Medicina

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Geração Experimental de Carcinoma Associado fibroblastos (FAC) de Fibroblastos Humanos mamária

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Transplante de Células-tronco em um In vitro Modelo de isquemia / reperfusão Simulated

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Procedimento para safenas humanas Veias<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão e reforço externo

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

Caracterização do tecido depois de um novo método de desagregação para a pele Micro-enxertos Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensional Cultura alginato-talão de células humanas adenoma pituitário

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in reproductive medicine. In the past, the study of reproductive system development in rodents has been based on one-time histological examination of excised tissues. Recently, with the development of high-resolution transabdominal ultrasound, high-quality sonography can now be performed to evaluate the reproductive organs of rats, allowing a new method for studying the reproductive system. Images were obtained using a high-resolution ultrasonographic system. Gynecological ultrasonography was performed on 28 eight-week-old non-pregnant rats and 5 pregnant Sprague-Dawley rats. We describe how to recognize organs of the reproductive system and associated structures in typical views during different phases of the estrus cycle. Color flow Doppler was used to measure uterine artery blood flow and evaluate uterine blood flow pattern changes during different stages of pregnancy. We have demonstrated that ultrasound exploration is a useful method for evaluating changes in internal reproductive organs. Its use raises the possibility of conducting additional experiments, including medical or surgical procedures, and provides the ability to monitor sonographic changes to internal organs without sacrificing animals.

This manuscript describes the utility of ultrasound performed on female rats to design experimental models for reproductive and gynecological investigation. A step-by-step explanation of how to perform ultrasonographic evaluation is shown.

Ultrasonografia em investigações de reprodução Experimental em ratos

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.