אנו מודים למר Helmus לקריינות, CM Popelier, ס &#39;Ypenburg וג ווסק לקבלת סיוע טכני. מחקר זה נתמך כלכלית על ידי הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO), רויאל הולנד האקדמיה לאמנויות ולמדעים (KNAW) והארגון ליפן סטודנטים השירותים (JASSO). פרסום זו נתמכה על ידי מענק פתוח פתוח של NWO לJMK.

1. מתקן רבייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דגימות בוגרות של stagnalis Lymnaea (ל) מתרבות מעבדה כמו זו באוניברסיטת VU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על המים נמוך נחושת ב20 מעלות צלזיוס בשני מתקן הרבייה (molluscarium) וטנקים ניסיוניים, שבו יש תחלופת מים רציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מחזור האור / חושך בשעות 12: שעות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרבייה, להאכיל כרצונך מודעת חסה נקיה מחומרי הדברת חלזונות הבוגרים, להאכיל את בני הנוער הצעירים עם TetraPhyll פתיתים (מזון לדגים). שמור על חלזונות במיכלים נפרדים על פי גילם, החל מהמוני ביצה שמונחים בתוך מסגרת זמן 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שחלזונות יוסרו מן טנקי הרבייה הם לא חזרו, כדי למנוע תופעות של שנשמר בתנאים מעט שונים, כמו גם כדי למנוע pseudoreplication. </li></ol> 2. Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את החלזונות במשך שבוע 1, ולהאכיל אותם כרצונך מודעה, על מנת להבטיח thaלא צריכים שהם זרע מלא וחנויות נוזל זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מיקרוסקופ סטריאו, צלחת לנתיחה עם סיכות, מספריים כירורגיות קטנים, מלקחיים גסים ועדינים, מזרק מיליליטר 10 מלאים עם פתרון 50 מ&quot;מ MgCl 2, מחטי הזרקה (0.3 מ&quot;מ x 13 מ&quot;מ) וכמה מגבות נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חילזון על ידי הזרקת MgCl 2 פתרון (בדרך כלל 3 מיליליטר או יותר לחלזונות בוגרים באורך קונכייה של 31.6 ± 2.1 מ&quot;מ ומשקל רטוב של 2.89 ± 0.55 ז). לחדור את הרגל עם מחט הזריקה בזווית של ° 45 ולהזריק בעדינות על ידי הפעלת לחץ ברציפות עד החילזון מרגיע ונשאר מורחב (תוך שניות). הסר את מחט הזריקה ולבדוק אם החילזון הוא מורדמים (לדוגמא, על ידי בדיקה האם רפלקס נסיגת זרוע חסר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הקליפה הבאה העקמומיות שלה על ידי שימוש במלקחיים גסים. באמצע הדרך, בעדינות לנתק את השרירים columellar מהמעטפת על ידי גירוד עם המלקחיים. בעדינות לא לעקםהוא החילזון מתוך הקונכייה שלו, הבא לכיוון המתפתל של הפגז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השבלול על הצלחת לנתיחה ולהצמיד את הקצה האחורי של כף הרגל. ואז, במקום סיכה דרך הראש ולשים קצת מתח על החילזון כדי להקל על נתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתרגום הנשי gonopore, אשר מאוחר יותר על להיות נקודת התייחסות לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות המספריים כירורגיות ומלקחיים בסדר, להפיק את החתך הראשון, בדיוק מתחת לקצה של המעטפת ולחתוך לכיוון הנשי gonopore. כאשר אחד מהלהבים &#39;המספריים נדחף מתחת לקיר הגוף, להרים אותו מעט כדי להבטיח שרק קיר הגוף, ואף אחד מהאיברים הפנימיים, הוא לחתוך. המשך חיתוך מעל gonopore לכיוון הראש ולחתוך בקו ישר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את בלוטת הערמונית (אחורי) ושלפוחית ​​זרע (קדמית). לנתח אלה בזהירות ולשמור אותם על קרח. השתמש בם כדי להפוך את פתרונות בדיקה המכילים נוזל ו / או זרע זרע. השתמש סאל Lymnaea הפיזיולוגיine (5.83 מילימול / ליטר CaCl 2 · 2H 2 O, 3.76 מילימול / ליטר MgCl 2 · 6 שעות 2 O, 42.69 מילימול / ליטר NaCl, 37.53 מילימול / ליטר KCl) כמדיום מוביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את נוזל הזרע שנמצא בלומן של בלוטת הערמונית, כמו גם את הזרע משלפוחית ​​הזרע. בהמשך לכך, להשעות את שניהם במלח בבקבוקונים נפרדים בעדינות על ידי המבטא את תוכנם והסרת רקמות האיבר עם מלקחיים. שמור על קרח ולהשתמש באותו היום. מאוחר יותר, לערבב השעיות אלה כדי ליצור פתרונות טיפול השונים. </li></ol> 3. הזרקת intravaginal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל הליך ההזרקה intravaginal, להכין פגז-תבנית סיליקון (עשה כדי להתאים את קצה הקליפה), מזרקים 1 מ&quot;מ, 10-12 צינורות סיליקון סנטימטר בקוטר של 1 מ&quot;מ, הקהו מחטי הזרקה (0.3 מ&quot;מ x 13 מ&quot;מ ), מלקחיים גסים ואותו מזרק מיליליטר 10 מלא מצוידים במחט הזרקה חדה פתרון 2 מ&quot;מ MgCl 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הזרע, צריך להוסיף לנוזל הזרע (או חלבוני נוזל זרע בודדים) בכמה טיפולים; מינון רלוונטי מבחינה ביולוגית שווה 1/3 של בלוטת ערמונית ושלפוחית ​​זרע לכל זריקה. הערה: בסעיף תוצאות הנציג (איור 1) התוצאות של ניסוי עם שלושה טיפולים שונים מוצגות: בקרה (מדיום מוביל, כלומר, מי מלח), Ovipostatin (אחד מחלבוני נוזל זרע המזוהים) לבד וOvipostatin מלוות עם זרע. בנוסף, כדי להעריך את המינון הרלוונטי מבחינה ביולוגית במינים אחרים, לקבוע את ההבדל במשקל של בלוטת הערמונית של אנשים שהזדווגו ואנשים שנותרו מבודד מבחינה מינית 16 לאחרונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר מזרקים עבור כל אחד מפתרונות הבדיקה מוכנים. ממלא כל מזרק עם פתרון אחד ולהבטיח כי אין בועות אוויר בתוכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתאים מחט זריקה קהה בכל מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרקה להשתמש 1צינור בקוטר מ&quot;מ סיליקון באורך מינימאלי של 10 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחליק בזהירות את צינור סיליקון מעל מחט הזריקה, כדי לוודא שלא לנקב את הצינור, ולהסיר את האוויר מהצינור בעדינות על ידי יישום הלחץ על המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש חילזון על ידי ביצוע אותו הפרוטוקול כמו בנקודה 2.3. הפעם לוודא שלא להזרים יותר מ 2-3 מיליליטר של 50 מ&quot;מ MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החילזון בקליפת עובש כדי לשמור אותו במצב יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאתר את נקבת gonopore, שנראה בבירור כנקודה לבנה בצד ימין של בעל חיים, קדמי לזרוע ימין וgonopore זכר (מיקום זה חל גם על מינים אחרים של חלזונות מים מתוקים). לוודא שיש גישה בלא הפרעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כדי להחזיק את קצה צינורית סיליקון ועדינות להכניס כ 2-4 מ&quot;מ של צינור סיליקון לתוך נקבת gonopore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחיל לחץ למזרק ולהזריק 0.03 מיליליטר של פתרון המבחן. חכה חצי דק &#39;אוטה כדי לאפשר את הלחץ בצינור כדי להפיץ לנקבת דרכי לפני הסרת הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את החילזון שטופל למכל הבידוד שלה, שבו ניתן לנטר אותו, ולאפשר לו להתאושש מהרדמה בטנק הניסיוני. </li></ol> 4. מבדק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל תווית חילזון לזיהוי ומדידת אורך שריונו. האחרון הוא אינדיקטור טוב לגודל, שהוא רלוונטי כאשר כימות תפוקת רבייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על כל חילזון מבודד במכל מיליליטר 460 כי הוא מחורר כדי לאפשר תחלופת מים בתוך מיכל הניסיוני. חשוב למקם את כל המכולות בכיוון הנכון, עם הנקבים בכיוון זרימת המים, כדי לאפשר תחלופת מים יעילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך המבדק, להאכיל את החלזונות באופן קבוע עם כמות סטנדרטית של חסה. השתמש אגרופן עגול, מתכת לחתוך חסה. בפרוטוקול זה דיסקי חסה של 19.6 סנטימטר 2 משמשים, המדמה אתהר הם יכולים מקסימאלי לאכול ביום אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף המוני ביצה בצד החלק של מרית ולגרד את מסת הביצה מהקיר מיכל. השתמש בצד הכף לאיסוף המוני הביצה. הערה: המוני ביצה אטומים שזה עתה הניח לא יכולים לשמש לסריקה (שהם הופכים שקופים בתוך כמה שעות לאחר הנחה). למיני מודל בפרוטוקול זה, stagnalis Lymnaea, לבדוק להמוני ביצה בכל יום, שכן הם מייצרים 2-3 המוני ביצה בשבוע. זה יכול להיות שונה במינים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את המוני ביצה שנאספו באופן דיגיטלי, באמצעות מחשב (מחשב נייד) המכיל את מנהל ההתקן של הסורק, סורק למיטה שטוח, בקנה מידה מילימטר סטנדרטי, מרית, העברת צלחות ואריחי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל מסת ביצה על צלחות העברה וחזור עד לצלחות מלאות. לאחר מכן, מורחים את המוני ביצה יבשים על מגבת נייר ולהעביר אותם על גבי אריחי הזכוכית באותו סדר כמו בצלחות העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל כל אריח במהופך (המוני ביצה ידבקו אריחי הזכוכית) והניחו אותו בזהירות ובסורק, ממש מתחת לקנה מידת המילימטר. להחיל קצת בלחץ כדי לשטח את המוני ביצה, שתפיץ את הביצים באופן שווה, כך שהם כולם נראים לעין באותו מישור הפוקוס. התאם את האריחים עם כמות סטנדרטית של קלטת סביב שני קצוות כדי להבטיח שכל הביצים שטוחות באותה מידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ההגדרות של הסורק. חשוב להתאים את הרזולוציה למקסימום שלה, לבצע סריקה מקדימה, לחתוך את אזור העבודה, ולהתאים את הבהירות והניגודיות. סרוק את המוני ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל מסת ביצה בבקבוקון שלו שכותרתו 20 מיליליטר הזכוכית להמשך פיתוח ובקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן המים בבקיעת בקבוקונים בכל יום אחר כדי לשמור אותו מחומצן כראוי. לעשות את זה על פי מספרי גוזל וגודל לפי הסדר הבא: decanting / לשפוך את (אין גוזלים), עולה על גדותיו (תחילת בקיעה), וחילוץ מתוך המים עם טפטפת (גוזלים רבים). </li></ol> &lt;כיתת p = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. מדידה וספירה ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את ImageJ באופן חופשי, זמין תוכנת ניתוח תמונה (NIH, ארה&quot;ב) ותוסף דלפק תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ImageJ הפתוח, כמו גם תכנית גיליון אלקטרוני כדי להעביר את הנתונים ל. ואז לפתוח תמונה סרוקה של המוני ביצה בImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קנה המידה על ידי שימוש בכלי הזום כדי לנווט לקנה מידת המילימטר. קרב ולהתאים את החלון ל1 מ&quot;מ כדי למלא את המסך. לצייר קו באמצעות כלי השורה בין שני הקווים המצביעים על 1 מ&quot;מ. נווט לניתוח, וקבע בקנה מידה. בתפריט המוקפץ אפשרות האורך המדודה הופכת לגלויה, להתאים את המרחק ידוע 1 ויחידת האורך למ&quot;מ. סמן את התיבה הגלובלית, ולסגור את החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המדידות המועדפות (אורך, רוחב, היקף) על ידי ניווט לניתוח, וקבע מדידות על ידי בחירת אזור והקוטר של Feret (אורך ורוחב). לחץ על אישור כדי לאשר ולהמשיך עם דמותו מנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את הביצים, zoאום בביצה של מסת הביצה הראשונה שצריכה להיות מדודים. הזום של 800% מומלץ. לאחר מכן, באמצעות הכלי הסגלגל לצייר אליפסה בדיוק סביב הביצה, לחץ על CTRL + D כדי לצייר את ההיקף על התמונה (כדי למנוע מדידה אותה הביצה פעמיים). לאחר מכן לחץ על Ctrl + M כדי להקליט את המדד למאפיינים של סגלגל (אורך, רוחב, היקף); מסך מוקפץ נפתח בו מוצגות המדידות. הערה: השימוש בכלי אליפטי למדוד ביצים אינו חל על כל המינים. עבור מינים עם ביצים בצורה לא אחיד, השתמש בבחירות חופשי במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד כמו ביצים רבות במידת צורך ולאחר מכן שמור את האמצעים כ. גיליון xls. לחלופין, להעתיק את הנתונים ישירות לתוך גיליון עבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך לספור את הביצים בתוך מסת ביצים, על ידי שימוש בחלון הדלפק ולשים את הספירה באופן ידני לגיליון העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לספור את הביצים בודדות למסת ביצה בעזרת דלפק התוספת התא. לשם כך, לנווט לתוספות,לאחר מכן, לנתח ובחר דלפק תא. חלון דלפק התא יופיע, סמנו את &quot;לשמור על מקורית&quot; תיבה ולחץ על &#39;אתחול&#39;. חלון דלפק חדש מופיע, בחר בכלי הכוונת מסרגל הכלים ולבחור סוג דלפק בתפריט דלפק תא. לספור את הביצים על ידי לחיצה על הביצים בודדות בחלון דלפק תא. שים לב למספר הכולל ליד סוג הדלפק בתפריט דלפק תא. העתק מספר זה באופן ידני לגיליון אלקטרוני או לקבל את התוצאות על ידי לחיצה על תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן המוני ביצה מרובים בתוך אירוע נספר אחד על ידי הוספת סוגי דלפק, במידת צורך. </li></ol>

<ol>
	<li>Mann, T., Lutwak-Mann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Male reproductive function and semen. , (1981).</li><li>Arnqvist, G., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sexual Conflict. , (2005).</li><li>Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , (2008).</li><li>Koene, J. M., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allohormones":+A+class+of+bioactive+substances+favoured+by+sexual+selection.">Allohormones": A class of bioactive substances favoured by sexual selection.</a> Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).</li><li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects.">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).</li><li>Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seminal+symphony:+how+to+compose+an+ejaculate.">The seminal symphony: how to compose an ejaculate.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).</li><li>Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+composition+of+male+accessory+gland+secretions+in+Anopheles+gambiae:+a+comparison+with+other+insect+vectors+of+infectious+diseases.">Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases.</a> Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).</li><li>Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Tribolium+castaneum+seminal+fluid+proteins:+identification+of+an+angiotensin-converting+enzyme+as+a+key+player+in+regulation+of+reproduction.">Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction.</a> Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).</li><li>Jarne, P., Auld, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+mix+it+up+too:+The+distribution+of+self-fertilization+among+hermaphroditic+animals.">Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals.</a> Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).</li><li>Nakadera, Y., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+strategies+in+hermaphroditic+gastropods:+conceptual+and+empirical+approaches.">Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches.</a> Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).</li><li>Chase, R., Blanchard, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+snail&#8217;s+love-dart+delivers+mucus+to+increase+paternity.">The snail&#8217;s love-dart delivers mucus to increase paternity.</a> Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).</li><li>Koene, J. M., Chase, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+reproductive+system+of+the+snail+Helix+aspersa+caused+by+mucus+from+the+love+dart.">Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart.</a> Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).</li><li>Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+suppresses+fecundity+in+the+hermaphrodite+freshwater+snail+Lymnaea+stagnalis:+a+laboratory+study.">Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study.</a> Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).</li><li>Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+egg+laying+caused+by+a+male+accessory+gland+product+opens+the+possibility+for+sexual+conflict+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite.</a> Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).</li><li>Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+rate+influences+female+reproductive+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite,+Lymnaea+stagnalis.">Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis.</a> Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).</li><li>Koene, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+accessory+gland+protein+reduces+egg+laying+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite.</a> PLoS ONE. (5), (2010).</li><li>Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receipt+of+seminal+fluid+proteins+causes+reduction+of+male+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite.</a> Current Biology. 24, 1-4 (2014).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המובא מראה כיצד לאסוף נוזל זרע ואיך לבדוק את זה בצורה משמעותית מבחינה ביולוגית. למרות שהליך זה כאן מוצג באמצעות תמצית בלוטת הערמונית, ההשפעה של חלבון נוזל זרע מטוהר יחיד יכולה להיות גם נבדקה באותו האופן. כמובן, בבדיקות כגון זה תמיד חיוני לכלול בקרות נאותות (טיפולי דמה) כדי להבטיח שההליך ו / או בינוני הספק אינו משפיע על הפרמטרים בשאלות 14,16. באמצעות שיטה זו, שהיא כבר הראתה כי קיימת חלבון יחיד נוזל זרע, כלומר Ovipostatin, שמתווך בירידה בהטלת ביצים 14,16. חלבון זה, המיוצר בבלוטת הערמונית והועבר במהלך הזדווגות יחד עם תאי הזרע, מייצג את המרכיב הראשון המאופיין במלואו נוזל הזרע באנדרוגינוס בו זמנית ואין, עד כה, לא הראה שום דמיון לחלבונים ידועים. הממצא שOvipostaפח מפחית ייצור המוני ביצה בנמען מאשש עבודה קודמת מצביע על כך שחומרים בזרע עשויים להשפיע על הטלת ביצי 13-15. על ידי העברת סכומים רלוונטיים מבחינה ביולוגית (ראה 3.2 16), אפשר באופן משכנע להוכיח כי מדובר בחלבון נוזל זרע, ולא הנוכחות של תאי זרע עצמם, שמתווך את הירידה שנצפתה בהטלת ביצים (איור 1). בהתחשב בכך שקבלה חוזרת של נוזל זרע דרך הזדווגויות טבעיות מגדילה את ההשקעה לביצה 15, עכשיו זה הופך להיות רלוונטי מאוד לכמת פרמטרים אחרים של הטלת ביצים. הפרוטוקול הציג החברה מספק את השיטות הדרושות כדי לעשות זאת. למרות שלא נמצאה השפעה של Ovipostatin על בקיעת הצלחה של הביצים שהונחו על ידי הנמען 16, ייתכנו חלבוני נוזל זרע אחרים שיפעלו בתיאום עם חלבון זה. לפיכך, פרמטרים שצריכים לכמת בהקשר זה - בסמוך לנחת מספרי תדירות וביצה - כוללים גודל ביצה, hatcזמן הינג, פיתוח גוזל וגודל גוזל. בנוסף, אפשר להסתכל על השפעות על תהליכים אחרים נשיים מאשר הנחת ביצה, כגון אחסון זרע ושימוש, כמו גם הקצאת משאבי רבייה כלפי התפקוד הנשי וגברי 14,17. ברור שהשיטה שהוצגה היא סייע בטיפול בנושאי מעקב אלה, הן בLymnaea stagnalis ובחלזונות מים מתוקים אחרים. לסיכום, ניסויים באמצעות הצגת פרוטוקול זה שהעביר את חלבוני נוזל זרע משפיעים על ביצועי רבייה הנשיים של הנמען בהרמפרודיטים בו זמנית אלה. בהתחשב בכך שמספר מחקרים התייחסו הזה, זה עשוי להיות הרבה יותר נפוץ באופן פנימי דישון הרמפרודיטים מאשר כיום משתקף בספרות המדעית. במיוחד כאשר אחד מבין שבחירת בן זוג לפני הזדווגות ותחרות הזרע הוכחו לשחק תפקיד חשוב בהרמפרודיטים אלה 14, שhighlights הפוטנציאל של חלבוני בלוטת אבזר גבריים כגון להיבחר מיני במערכת זו. לבסוף, מחקר זה מסייע לתמיכה ברעיון הפיתוח שחלבוני נוזל זרע הם בעלי חשיבות שווה להרמפרודיטים בו זמנית כפי שהם למיני דחף מיניים נפרדים.

עם ההעברה, תאי זרע הם בדרך כלל מלווים בנוזל זרע מיוצר על ידי בלוטות אבזר מין זכר. בעוד כמה רכיבי שפיכה לשחק תפקידים בזרע מזין והפעלת 1, אחרים להשפיע על פיזיולוגיה נשית כדי להגדיל את ההצלחה של הפריה של תורם הזרע 2-4. השפעות אלה נבחרו במיוחד עבור, דרך ברירה מינית, כאשר מינים הוא מופקרים ביותר ויש לו אחסון זרע יעיל ועיכול זרע. בתנאים אלה, תורמי זרע להתחרות בכבדות להפריה של ביצים 5. אמנם יש ראיות בשפע מתאמים לחשיבות של חומרי נוזל זרע להצלחת הפריה ממין זכר, עדות ישירה היא יותר נדירה וכמה מחקרים התעמקו בפרטים של השינוי ו / או חומרים מעורבים 6 הפיסיולוגיים. במינים עם מינים נפרדים (כלומר, זכרים ונקבות; gonochorists) יש speci מודל חקר היטב כמהes כשזה מגיע להרכב נוזל זרע ואת ההשפעות שלהם. דוגמאות כוללות את זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster 6, יתושים המלריה, אנופלס 7 gambiae, וחיפושית הקמח האדומה, castaneum Tribolium 8. מחקרי נוזל זרע כאלה הם נדירים הרבה יותר כשמדובר במינים שהם בו זמנית hermaphroditic (כלומר, אנשים הם מבחינה פונקציונלית זכר ונקבה באותו הזמן), למרות שהמצב של רבייה זו הוא נפוץ בכל רחבי הממלכה 9 בעלי החיים. דוגמא hermaphroditic הבולטת ביותר של העברת חומר בלוטת אבזר היא כנראה הירי של מה שנקרא אהבה בחצי שבלולי היבשה 2,10, שבו החומר מועבר על ידי תורם הזרע באמצעות הזרקת מזרק 11,12, כלומר, לא יחד עם תאי הזרע. אבל יש הרבה הרמפרודיטים בו זמנית, כי העברת מוצרי בלוטת אבזר גבריים יחד עם הזרע שלהם,כגון מיני המודל משמשים כאן, הברכה הגדולה חילזון Lymnaea stagnalis. המחקרים קודמים כבר הוכיחו כי קבלת נוזל הזרע משפיעה על תפוקת הרבייה הנשית של מין זה 13-15, וכמה מחלבוני נוזל זרע המעורבים זוהו 16,17. המטרה הכללית של פרוטוקול זה, שהוא שלוחה של השיטות שדווחו בKoene אח&#39; 16, היא לבדוק את ההשפעות של חלבוני נוזל זרע על פרמטרים שונים של הטלת ביצים ברכיכות חלזון. המטרה זו מושגת על ידי נתיחה של בלוטת הערמונית (כלומר, בלוטת האבזר הגברית ייצור נוזל הזרע) של חלזונות תורם מבודדים מבחינה מינית מתרבות מעבדה סטנדרטית. שנית, הזרע של התורם נאסף משלפוחית ​​הזרע ופתרונות טיפול שונים עשויים. בהמשך לכך, חלזונות מבחן הם מורדמים וintravaginally הוזרקו פתרון מבחן (לדוגמא,תמצית בלוטת ערמונית לבד, תמצית בלוטת ערמונית עם זרע, זרע לבד, בינוני נושאת לבדה). אז חלזונות מבחן אלה במעקב במשך הימים הבאים לשבועות, בתנאים סטנדרטיים, להקליט הטלת ביצים. המוני ביצה נאספים, באופן דיגיטלי שנסרקו לספירה ומדידת פרמטרים שונים, ולאחר מכן לשים בצלוחיות אישיות לבקיעה. לאחר כשבועיים, הגוזלים נספרים ונסרקו באופן דיגיטלי. כל הסריקות, שבשני המוני ביצה וגוזלים, לאחר מכן נותחו באמצעות חבילת תוכנת ניתוח תמונה באופן חופשי, זמינה. לפרוטוקול זה משמש זן המעבדה של החילזון הגדול בריכה, stagnalis Lymnaea,, שהוא גידל באוניברסיטת VU באמסטרדם. מין זה משמש כמערכת מודל לחקר שאלות על בחירה ורבייה בהרמפרודיטים מיניות. הגודל הגדול יחסית של בעלי החיים עושה את זה באופן ניסיוני מאוד נגיש. בנוסף לכך, משום שהוא משמש כמיני מודל ברבים בדיסציפלינות iological אנחנו כבר יודעים הרבה על הביולוגיה הבסיסית של בעלי חיים אלה. שיטה זו תעזור לשאלות מחקר על תהליכים של ברירה מינית שמתווכים באמצעות חלבוני נוזל זרע באופן כללי. בנוסף, מכיוון שמדובר בהרמפרודיטים בו זמנית, זה אפשרי כדי לטפל באם חלבונים כגון לפעול בדרכים דומות ו / או שונות כפי שהם עושים במינים שבם המינים מופרדים 16,17.

<table><tbody><tr><td>Fish food flakes</td><td>TetraPhyll</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small surgical scissors</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coarse and fine forceps</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.83 mmol/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.76 mmol/L MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>42.69 mmol/L NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37.53 mmol/L KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two component Silicon</td><td>Sylgard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing (diameter 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td><td>Eppendorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>460 ml perforated containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal leaf puncher (19.6 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatula/spoon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Laptop) computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flatbed scanner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millimeter scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferring plates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tiles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml glass vials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

באופן פנימי דישון בעלי חיים, נוזל זרע הוא הוסיף בדרך כלל לתאי הזרע, יחד ויוצרים את הזרע או שפיכה. חוץ מזרע מזין והפעלה, הרכיבים בנוזל הזרע יכולים גם להשפיע על פיזיולוגיה נשית כדי להגדיל את ההצלחה הפריה של תורם הזרע. בעוד שמחקרים רבים דיווחו על תופעות כאלה במין עם מינים נפרדים, מעט מחקרים עסקו זה בבעלי החיים בו זמנית hermaphroditic. פרוטוקול וידאו זה מציג שיטה ללמוד השפעות של נוזל זרע בחלזונות, באמצעות חילזון בו זמנית hermaphroditic מים מתוקים, stagnalis Lymnaea חילזון הברכה הגדול, כמו אורגניזם מודל. בעוד ההליך מוצג באמצעות תמציות בלוטת ערמונית שלמות, רכיבים בודדים (כלומר, חלבונים, פפטידים, ותרכובות אחרות) של נוזל הזרע, ניתן לבדוק באותו אופן. השפעות של קבלת רכיבי שפיכה בנחת ביצה ניתן לכמת במונחים של תדירות של הטלת ביצים והערכות עדינות יותר של ביצועי רבייה נשיים כגון מספרי ביצה בתוך כל המוני ביצה. תוצאות מראות כי חלבוני נוזל זרע משפיעים על פלט רבייה נשי באנדרוגינוס בו זמנית זו, המדגיש את החשיבות שלהם לברירה מינית.

איור 1 מציג את האחוז של בעלי חיים להטיל ביצים לאחר הזרקת intravaginal של או חומר השליטה (מי מלח), Ovipostatin, או Ovipostatin מלווה עם זרע. N = 15 עבור כל טיפול; לראות Koene אח&#39; 16 לפרטים ונתונים סטטיסטיים (מקור: איור 3 מKoene אח&#39; 2010, PLoS ONE.).. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. השפעת Ovipostatin בייצור המוני ביצה של Lymnaea stagnalis. הגרף מראה את האחוז של בעלי חיים להטיל ביצים לאחר הזרקת intravaginal של או חומר השליטה (מי מלח), Ovipostatin, או Ovipostatin מלווה עם זרע. N = 15 עבור כל טיפול; לראות Koene et al. פרטים 2010 ונתונים סטטיסטיים. להדפיס מחדש באישור Koene אח&#39; 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs at JoVE.com

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

השפעה של זכר אבזר בלוטת מוצרים בהטלת ביצים ברכיכות חלזון

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

effect-male-accessory-gland-products-on-egg-laying-gastropod

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Video: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

שיטה לא פולשנית ל<em&gt; באתרו</em&gt; קביעת ההצלחה זיווג בלובסטרים אמריקאים נקבה (<em&gt; Americanus Homarus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Environment

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

קבלת ביצים Xenopus laevis נקבות

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. It is formed by two proteinaceous sublayers that are tightly associated and formed by distinct female reproductive organs. Both structures are assumed to have their own functional specificities, which remain to be defined. To characterize the function of proteins composing each sublayer, the first challenge is to establish the conditions that would allow for the mechanical separation of these two intricate layers, while limiting any structural damage. The second step is to optimize the experimental conditions to facilitate protein solubilization from these two sublayers, for subsequent biochemical analyses. The efficiency of this approach is assessed by analyzing the protein profile of each sublayer by Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), which is expected to be distinct between the two structures. This two-step procedure remains simple; it requires classical biochemical equipment and reagents; and is compatible with further in-depth proteomics. It may also be transposed to other avian eggs for comparative biology, knowing that the structure and the composition of the perivitelline layer has been shown to have species-specific features. In addition, the non-denaturing conditions developed for sublayers separation (step 1) allow their structural analyses by scanning and transmission electron microscopy. It may also constitute the initial step for subsequent protein purification to analyze their respective biological activities and 3D structure, or to perform further immunohistochemical or functional analyses. Such studies would help to decipher the physiological function of these two sublayers, whose structural and functional integrities are determinant criteria of the reproductive success.

This article reports a simple method to isolate the outer and inner perivitelline sublayers of chicken eggs while minimizing structural alteration and to optimize protein solubilization of each sublayer for proteomic analyses.

הפרדה מכנית וסלוביליזציה של חלבון של שכבות המשנה החיצוניות והפנימיות של פריוויטלין מביצי חן

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...

Biochemistry

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, respectively, play essential roles in embryonic development and adult homeostasis. Members of the Tgf&#223; family are made as inactive precursors that dimerize and fold within the endoplasmic reticulum. The precursor is subsequently cleaved into ligand and prodomain fragments. Although only the dimeric ligand can engage Tgf&#223; receptors and activate downstream signaling, there is growing recognition that the prodomain moiety contributes to ligand activity. This article describes a protocol that can be used to identify cleavage products generated during activation of Tgf&#223; precursor proteins. RNA encoding Tgf&#223; precursors are first microinjected into X. laevis embryos. The following day, cleavage products are collected from the blastocoele of&#160;gastrula stage embryos and analyzed on Western blots. This protocol can be completed relatively quickly, does not require expensive reagents and provides a source of concentrated Tgf&#223; cleavage products under physiologic conditions.

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

When Transforming Growth Factor &#223; family precursor proteins are ectopically expressed in Xenopus laevis embryos, they dimerize, get cleaved and are secreted into the blastocoele, which begins at the late blastula to early gastrula stage. We describe a method for aspirating cleavage products from the blastocoele cavity for immunoblot analysis.

ניתוח של שינוי גורם גדילה ß מוצרי מחשוף משפחתי מופרש לתוך Blastocoele של קסנופוס laevis עוברים

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Developmental Biology

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט<em&gt; תסיסנית</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neuroscience

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

שני סוגים של מבחני עבור Chemoattraction גילוי זרע צפרדע

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

הר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; כלת שיטה עבור חלזון הרכיכות<em&gt; Stagnalis Lymnaea</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels (Bivalvia: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater mussels are among the most imperiled organisms in the world, but information about early larval (glochidial) development and brooding periods is still lacking for many species. Previous studies have focused on the complex life history stage when female mussels are ready to parasitize host fish, but few studies have focused on the brooding period and timing of larval development. The protocol described here allows researchers to non-lethally evaluate the state of gravidity for female mussels. The results of this study show that this method does not affect a female mussel&rsquo;s ability to stay gravid or become gravid again after sampling has been performed. The advantage of this method may permit its use on federally threatened or endangered species or other populations of high conservation concern. This protocol can be adapted for use on both preserved or live individuals and was tested on a variety of mussel species. The database provided is a repository for a breadth of information on timing of reproductive habits and will facilitate future freshwater mussel research, conservation, and recovery efforts.

Standardizing a Non-Lethal Method for Characterizing the Reproductive Status and Larval Development of Freshwater Mussels Bivalvia: Unionida

Freshwater mussel conservation is dependent on monitoring reproductive patterns and processes of species. This study standardizes a non-lethal protocol for sampling gill contents, characterizing larval development, and providing a digital repository for data collected. This protocol-database package will be an important tool for mussel researchers in recovery of imperiled species.

סטנדרטיזציה של שיטה שאינה קטלנית לאפיון מעמד הרבייה והתפתחות הזחל של מולים מים מתוקים (ביובלויה: Unionida)

Actively monitoring the timing, development, and reproductive patterns of endangered species is critical when managing for population recovery. Freshwater ...

Eyestalk Ablation to Increase Ovarian Maturation in Mud Crabs

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the induction of ovarian maturation is important to meet the consumer demand for mature mud crabs and hasten seed production. Eyestalk ablation is an effective tool to enhance ovarian maturation in mud crabs. However, there is no standard protocol for the eyestalk ablation of mud crabs. In this study, two eyestalk ablation techniques are described: cauterization (the use of hot metal to ablate the eyestalk of an anesthetized crab) and surgery (the removal of the eyestalk using surgical scissors). Before eyestalk ablation, sexually mature females (CW &#62; 86 mm) were anesthetized using an ice bag (&#8722;20 &#176;C) with seawater. When the water temperature reached 4 &#176;C, the ice bag was removed from the water. Flowing seawater (ambient temperature: 28 &#176;C) was used for recovery from the anesthesia immediately after eyestalk ablation. Mortality did not occur during or after the process of eyestalk ablation. The eyestalk ablation protocol presented here accelerated the ovarian maturation of the mud crabs.

Two eyestalk ablation protocols (i.e., cauterization and surgery&#160;approaches) were performed on anesthetized female crabs. The eyestalk ablation of mud crabs hastened the ripening of ovaries without decreasing the survival rate.

אבלציה של דיבור עיניים להגברת התבגרות השחלות בסרטני בוץ

Mud crabs (Scylla spp.) are commercially important crustacean species that can be found throughout the Indo-West Pacific region. During culture, the ...

Drosophila Male Accessory Gland Dissection: A Method to Isolate Secondary Cells

Source: Immarigeon, C., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60218/" target="_blank">A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the dissection of the accessory glands from male flies and shows an example in which the isolated gland will be dissociated into a single cell suspension.

דרוזופילה דיסקציה של בלוטת האביזר הגברי: שיטה לבידוד תאים משניים

Source: Immarigeon, C., et al. A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands. J. Vis. Exp. (2019).
...

השפעה של זכר אבזר בלוטת מוצרים בהטלת ביצים ברכיכות חלזון

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיטה לא פולשנית ל