אנו מודים למר Helmus לקריינות, CM Popelier, ס &#39;Ypenburg וג ווסק לקבלת סיוע טכני. מחקר זה נתמך כלכלית על ידי הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO), רויאל הולנד האקדמיה לאמנויות ולמדעים (KNAW) והארגון ליפן סטודנטים השירותים (JASSO). פרסום זו נתמכה על ידי מענק פתוח פתוח של NWO לJMK.

1. מתקן רבייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דגימות בוגרות של stagnalis Lymnaea (ל) מתרבות מעבדה כמו זו באוניברסיטת VU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על המים נמוך נחושת ב20 מעלות צלזיוס בשני מתקן הרבייה (molluscarium) וטנקים ניסיוניים, שבו יש תחלופת מים רציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מחזור האור / חושך בשעות 12: שעות 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרבייה, להאכיל כרצונך מודעת חסה נקיה מחומרי הדברת חלזונות הבוגרים, להאכיל את בני הנוער הצעירים עם TetraPhyll פתיתים (מזון לדגים). שמור על חלזונות במיכלים נפרדים על פי גילם, החל מהמוני ביצה שמונחים בתוך מסגרת זמן 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שחלזונות יוסרו מן טנקי הרבייה הם לא חזרו, כדי למנוע תופעות של שנשמר בתנאים מעט שונים, כמו גם כדי למנוע pseudoreplication. </li></ol> 2. Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את החלזונות במשך שבוע 1, ולהאכיל אותם כרצונך מודעה, על מנת להבטיח thaלא צריכים שהם זרע מלא וחנויות נוזל זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מיקרוסקופ סטריאו, צלחת לנתיחה עם סיכות, מספריים כירורגיות קטנים, מלקחיים גסים ועדינים, מזרק מיליליטר 10 מלאים עם פתרון 50 מ&quot;מ MgCl 2, מחטי הזרקה (0.3 מ&quot;מ x 13 מ&quot;מ) וכמה מגבות נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חילזון על ידי הזרקת MgCl 2 פתרון (בדרך כלל 3 מיליליטר או יותר לחלזונות בוגרים באורך קונכייה של 31.6 ± 2.1 מ&quot;מ ומשקל רטוב של 2.89 ± 0.55 ז). לחדור את הרגל עם מחט הזריקה בזווית של ° 45 ולהזריק בעדינות על ידי הפעלת לחץ ברציפות עד החילזון מרגיע ונשאר מורחב (תוך שניות). הסר את מחט הזריקה ולבדוק אם החילזון הוא מורדמים (לדוגמא, על ידי בדיקה האם רפלקס נסיגת זרוע חסר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הקליפה הבאה העקמומיות שלה על ידי שימוש במלקחיים גסים. באמצע הדרך, בעדינות לנתק את השרירים columellar מהמעטפת על ידי גירוד עם המלקחיים. בעדינות לא לעקםהוא החילזון מתוך הקונכייה שלו, הבא לכיוון המתפתל של הפגז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השבלול על הצלחת לנתיחה ולהצמיד את הקצה האחורי של כף הרגל. ואז, במקום סיכה דרך הראש ולשים קצת מתח על החילזון כדי להקל על נתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתרגום הנשי gonopore, אשר מאוחר יותר על להיות נקודת התייחסות לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות המספריים כירורגיות ומלקחיים בסדר, להפיק את החתך הראשון, בדיוק מתחת לקצה של המעטפת ולחתוך לכיוון הנשי gonopore. כאשר אחד מהלהבים &#39;המספריים נדחף מתחת לקיר הגוף, להרים אותו מעט כדי להבטיח שרק קיר הגוף, ואף אחד מהאיברים הפנימיים, הוא לחתוך. המשך חיתוך מעל gonopore לכיוון הראש ולחתוך בקו ישר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את בלוטת הערמונית (אחורי) ושלפוחית ​​זרע (קדמית). לנתח אלה בזהירות ולשמור אותם על קרח. השתמש בם כדי להפוך את פתרונות בדיקה המכילים נוזל ו / או זרע זרע. השתמש סאל Lymnaea הפיזיולוגיine (5.83 מילימול / ליטר CaCl 2 · 2H 2 O, 3.76 מילימול / ליטר MgCl 2 · 6 שעות 2 O, 42.69 מילימול / ליטר NaCl, 37.53 מילימול / ליטר KCl) כמדיום מוביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את נוזל הזרע שנמצא בלומן של בלוטת הערמונית, כמו גם את הזרע משלפוחית ​​הזרע. בהמשך לכך, להשעות את שניהם במלח בבקבוקונים נפרדים בעדינות על ידי המבטא את תוכנם והסרת רקמות האיבר עם מלקחיים. שמור על קרח ולהשתמש באותו היום. מאוחר יותר, לערבב השעיות אלה כדי ליצור פתרונות טיפול השונים. </li></ol> 3. הזרקת intravaginal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל הליך ההזרקה intravaginal, להכין פגז-תבנית סיליקון (עשה כדי להתאים את קצה הקליפה), מזרקים 1 מ&quot;מ, 10-12 צינורות סיליקון סנטימטר בקוטר של 1 מ&quot;מ, הקהו מחטי הזרקה (0.3 מ&quot;מ x 13 מ&quot;מ ), מלקחיים גסים ואותו מזרק מיליליטר 10 מלא מצוידים במחט הזרקה חדה פתרון 2 מ&quot;מ MgCl 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הזרע, צריך להוסיף לנוזל הזרע (או חלבוני נוזל זרע בודדים) בכמה טיפולים; מינון רלוונטי מבחינה ביולוגית שווה 1/3 של בלוטת ערמונית ושלפוחית ​​זרע לכל זריקה. הערה: בסעיף תוצאות הנציג (איור 1) התוצאות של ניסוי עם שלושה טיפולים שונים מוצגות: בקרה (מדיום מוביל, כלומר, מי מלח), Ovipostatin (אחד מחלבוני נוזל זרע המזוהים) לבד וOvipostatin מלוות עם זרע. בנוסף, כדי להעריך את המינון הרלוונטי מבחינה ביולוגית במינים אחרים, לקבוע את ההבדל במשקל של בלוטת הערמונית של אנשים שהזדווגו ואנשים שנותרו מבודד מבחינה מינית 16 לאחרונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר מזרקים עבור כל אחד מפתרונות הבדיקה מוכנים. ממלא כל מזרק עם פתרון אחד ולהבטיח כי אין בועות אוויר בתוכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתאים מחט זריקה קהה בכל מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרקה להשתמש 1צינור בקוטר מ&quot;מ סיליקון באורך מינימאלי של 10 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחליק בזהירות את צינור סיליקון מעל מחט הזריקה, כדי לוודא שלא לנקב את הצינור, ולהסיר את האוויר מהצינור בעדינות על ידי יישום הלחץ על המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש חילזון על ידי ביצוע אותו הפרוטוקול כמו בנקודה 2.3. הפעם לוודא שלא להזרים יותר מ 2-3 מיליליטר של 50 מ&quot;מ MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החילזון בקליפת עובש כדי לשמור אותו במצב יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאתר את נקבת gonopore, שנראה בבירור כנקודה לבנה בצד ימין של בעל חיים, קדמי לזרוע ימין וgonopore זכר (מיקום זה חל גם על מינים אחרים של חלזונות מים מתוקים). לוודא שיש גישה בלא הפרעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כדי להחזיק את קצה צינורית סיליקון ועדינות להכניס כ 2-4 מ&quot;מ של צינור סיליקון לתוך נקבת gonopore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחיל לחץ למזרק ולהזריק 0.03 מיליליטר של פתרון המבחן. חכה חצי דק &#39;אוטה כדי לאפשר את הלחץ בצינור כדי להפיץ לנקבת דרכי לפני הסרת הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את החילזון שטופל למכל הבידוד שלה, שבו ניתן לנטר אותו, ולאפשר לו להתאושש מהרדמה בטנק הניסיוני. </li></ol> 4. מבדק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל תווית חילזון לזיהוי ומדידת אורך שריונו. האחרון הוא אינדיקטור טוב לגודל, שהוא רלוונטי כאשר כימות תפוקת רבייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על כל חילזון מבודד במכל מיליליטר 460 כי הוא מחורר כדי לאפשר תחלופת מים בתוך מיכל הניסיוני. חשוב למקם את כל המכולות בכיוון הנכון, עם הנקבים בכיוון זרימת המים, כדי לאפשר תחלופת מים יעילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך המבדק, להאכיל את החלזונות באופן קבוע עם כמות סטנדרטית של חסה. השתמש אגרופן עגול, מתכת לחתוך חסה. בפרוטוקול זה דיסקי חסה של 19.6 סנטימטר 2 משמשים, המדמה אתהר הם יכולים מקסימאלי לאכול ביום אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף המוני ביצה בצד החלק של מרית ולגרד את מסת הביצה מהקיר מיכל. השתמש בצד הכף לאיסוף המוני הביצה. הערה: המוני ביצה אטומים שזה עתה הניח לא יכולים לשמש לסריקה (שהם הופכים שקופים בתוך כמה שעות לאחר הנחה). למיני מודל בפרוטוקול זה, stagnalis Lymnaea, לבדוק להמוני ביצה בכל יום, שכן הם מייצרים 2-3 המוני ביצה בשבוע. זה יכול להיות שונה במינים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את המוני ביצה שנאספו באופן דיגיטלי, באמצעות מחשב (מחשב נייד) המכיל את מנהל ההתקן של הסורק, סורק למיטה שטוח, בקנה מידה מילימטר סטנדרטי, מרית, העברת צלחות ואריחי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל מסת ביצה על צלחות העברה וחזור עד לצלחות מלאות. לאחר מכן, מורחים את המוני ביצה יבשים על מגבת נייר ולהעביר אותם על גבי אריחי הזכוכית באותו סדר כמו בצלחות העברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל כל אריח במהופך (המוני ביצה ידבקו אריחי הזכוכית) והניחו אותו בזהירות ובסורק, ממש מתחת לקנה מידת המילימטר. להחיל קצת בלחץ כדי לשטח את המוני ביצה, שתפיץ את הביצים באופן שווה, כך שהם כולם נראים לעין באותו מישור הפוקוס. התאם את האריחים עם כמות סטנדרטית של קלטת סביב שני קצוות כדי להבטיח שכל הביצים שטוחות באותה מידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ההגדרות של הסורק. חשוב להתאים את הרזולוציה למקסימום שלה, לבצע סריקה מקדימה, לחתוך את אזור העבודה, ולהתאים את הבהירות והניגודיות. סרוק את המוני ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל מסת ביצה בבקבוקון שלו שכותרתו 20 מיליליטר הזכוכית להמשך פיתוח ובקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן המים בבקיעת בקבוקונים בכל יום אחר כדי לשמור אותו מחומצן כראוי. לעשות את זה על פי מספרי גוזל וגודל לפי הסדר הבא: decanting / לשפוך את (אין גוזלים), עולה על גדותיו (תחילת בקיעה), וחילוץ מתוך המים עם טפטפת (גוזלים רבים). </li></ol> &lt;כיתת p = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. מדידה וספירה ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את ImageJ באופן חופשי, זמין תוכנת ניתוח תמונה (NIH, ארה&quot;ב) ותוסף דלפק תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ImageJ הפתוח, כמו גם תכנית גיליון אלקטרוני כדי להעביר את הנתונים ל. ואז לפתוח תמונה סרוקה של המוני ביצה בImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קנה המידה על ידי שימוש בכלי הזום כדי לנווט לקנה מידת המילימטר. קרב ולהתאים את החלון ל1 מ&quot;מ כדי למלא את המסך. לצייר קו באמצעות כלי השורה בין שני הקווים המצביעים על 1 מ&quot;מ. נווט לניתוח, וקבע בקנה מידה. בתפריט המוקפץ אפשרות האורך המדודה הופכת לגלויה, להתאים את המרחק ידוע 1 ויחידת האורך למ&quot;מ. סמן את התיבה הגלובלית, ולסגור את החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המדידות המועדפות (אורך, רוחב, היקף) על ידי ניווט לניתוח, וקבע מדידות על ידי בחירת אזור והקוטר של Feret (אורך ורוחב). לחץ על אישור כדי לאשר ולהמשיך עם דמותו מנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את הביצים, zoאום בביצה של מסת הביצה הראשונה שצריכה להיות מדודים. הזום של 800% מומלץ. לאחר מכן, באמצעות הכלי הסגלגל לצייר אליפסה בדיוק סביב הביצה, לחץ על CTRL + D כדי לצייר את ההיקף על התמונה (כדי למנוע מדידה אותה הביצה פעמיים). לאחר מכן לחץ על Ctrl + M כדי להקליט את המדד למאפיינים של סגלגל (אורך, רוחב, היקף); מסך מוקפץ נפתח בו מוצגות המדידות. הערה: השימוש בכלי אליפטי למדוד ביצים אינו חל על כל המינים. עבור מינים עם ביצים בצורה לא אחיד, השתמש בבחירות חופשי במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד כמו ביצים רבות במידת צורך ולאחר מכן שמור את האמצעים כ. גיליון xls. לחלופין, להעתיק את הנתונים ישירות לתוך גיליון עבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך לספור את הביצים בתוך מסת ביצים, על ידי שימוש בחלון הדלפק ולשים את הספירה באופן ידני לגיליון העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לספור את הביצים בודדות למסת ביצה בעזרת דלפק התוספת התא. לשם כך, לנווט לתוספות,לאחר מכן, לנתח ובחר דלפק תא. חלון דלפק התא יופיע, סמנו את &quot;לשמור על מקורית&quot; תיבה ולחץ על &#39;אתחול&#39;. חלון דלפק חדש מופיע, בחר בכלי הכוונת מסרגל הכלים ולבחור סוג דלפק בתפריט דלפק תא. לספור את הביצים על ידי לחיצה על הביצים בודדות בחלון דלפק תא. שים לב למספר הכולל ליד סוג הדלפק בתפריט דלפק תא. העתק מספר זה באופן ידני לגיליון אלקטרוני או לקבל את התוצאות על ידי לחיצה על תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן המוני ביצה מרובים בתוך אירוע נספר אחד על ידי הוספת סוגי דלפק, במידת צורך. </li></ol>

<ol>
	<li>Mann, T., Lutwak-Mann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Male reproductive function and semen. , (1981).</li><li>Arnqvist, G., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sexual Conflict. , (2005).</li><li>Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , (2008).</li><li>Koene, J. M., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allohormones":+A+class+of+bioactive+substances+favoured+by+sexual+selection.">Allohormones": A class of bioactive substances favoured by sexual selection.</a> Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).</li><li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects.">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).</li><li>Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+seminal+symphony:+how+to+compose+an+ejaculate.">The seminal symphony: how to compose an ejaculate.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).</li><li>Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+composition+of+male+accessory+gland+secretions+in+Anopheles+gambiae:+a+comparison+with+other+insect+vectors+of+infectious+diseases.">Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases.</a> Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).</li><li>Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Tribolium+castaneum+seminal+fluid+proteins:+identification+of+an+angiotensin-converting+enzyme+as+a+key+player+in+regulation+of+reproduction.">Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction.</a> Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).</li><li>Jarne, P., Auld, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+mix+it+up+too:+The+distribution+of+self-fertilization+among+hermaphroditic+animals.">Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals.</a> Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).</li><li>Nakadera, Y., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+strategies+in+hermaphroditic+gastropods:+conceptual+and+empirical+approaches.">Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches.</a> Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).</li><li>Chase, R., Blanchard, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+snail&#8217;s+love-dart+delivers+mucus+to+increase+paternity.">The snail&#8217;s love-dart delivers mucus to increase paternity.</a> Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).</li><li>Koene, J. M., Chase, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+reproductive+system+of+the+snail+Helix+aspersa+caused+by+mucus+from+the+love+dart.">Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart.</a> Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).</li><li>Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+suppresses+fecundity+in+the+hermaphrodite+freshwater+snail+Lymnaea+stagnalis:+a+laboratory+study.">Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study.</a> Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).</li><li>Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+egg+laying+caused+by+a+male+accessory+gland+product+opens+the+possibility+for+sexual+conflict+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite.</a> Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).</li><li>Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+rate+influences+female+reproductive+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite,+Lymnaea+stagnalis.">Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis.</a> Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).</li><li>Koene, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+accessory+gland+protein+reduces+egg+laying+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite.</a> PLoS ONE. (5), (2010).</li><li>Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receipt+of+seminal+fluid+proteins+causes+reduction+of+male+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite.">Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite.</a> Current Biology. 24, 1-4 (2014).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המובא מראה כיצד לאסוף נוזל זרע ואיך לבדוק את זה בצורה משמעותית מבחינה ביולוגית. למרות שהליך זה כאן מוצג באמצעות תמצית בלוטת הערמונית, ההשפעה של חלבון נוזל זרע מטוהר יחיד יכולה להיות גם נבדקה באותו האופן. כמובן, בבדיקות כגון זה תמיד חיוני לכלול בקרות נאותות (טיפולי דמה) כדי להבטיח שההליך ו / או בינוני הספק אינו משפיע על הפרמטרים בשאלות 14,16. באמצעות שיטה זו, שהיא כבר הראתה כי קיימת חלבון יחיד נוזל זרע, כלומר Ovipostatin, שמתווך בירידה בהטלת ביצים 14,16. חלבון זה, המיוצר בבלוטת הערמונית והועבר במהלך הזדווגות יחד עם תאי הזרע, מייצג את המרכיב הראשון המאופיין במלואו נוזל הזרע באנדרוגינוס בו זמנית ואין, עד כה, לא הראה שום דמיון לחלבונים ידועים. הממצא שOvipostaפח מפחית ייצור המוני ביצה בנמען מאשש עבודה קודמת מצביע על כך שחומרים בזרע עשויים להשפיע על הטלת ביצי 13-15. על ידי העברת סכומים רלוונטיים מבחינה ביולוגית (ראה 3.2 16), אפשר באופן משכנע להוכיח כי מדובר בחלבון נוזל זרע, ולא הנוכחות של תאי זרע עצמם, שמתווך את הירידה שנצפתה בהטלת ביצים (איור 1). בהתחשב בכך שקבלה חוזרת של נוזל זרע דרך הזדווגויות טבעיות מגדילה את ההשקעה לביצה 15, עכשיו זה הופך להיות רלוונטי מאוד לכמת פרמטרים אחרים של הטלת ביצים. הפרוטוקול הציג החברה מספק את השיטות הדרושות כדי לעשות זאת. למרות שלא נמצאה השפעה של Ovipostatin על בקיעת הצלחה של הביצים שהונחו על ידי הנמען 16, ייתכנו חלבוני נוזל זרע אחרים שיפעלו בתיאום עם חלבון זה. לפיכך, פרמטרים שצריכים לכמת בהקשר זה - בסמוך לנחת מספרי תדירות וביצה - כוללים גודל ביצה, hatcזמן הינג, פיתוח גוזל וגודל גוזל. בנוסף, אפשר להסתכל על השפעות על תהליכים אחרים נשיים מאשר הנחת ביצה, כגון אחסון זרע ושימוש, כמו גם הקצאת משאבי רבייה כלפי התפקוד הנשי וגברי 14,17. ברור שהשיטה שהוצגה היא סייע בטיפול בנושאי מעקב אלה, הן בLymnaea stagnalis ובחלזונות מים מתוקים אחרים. לסיכום, ניסויים באמצעות הצגת פרוטוקול זה שהעביר את חלבוני נוזל זרע משפיעים על ביצועי רבייה הנשיים של הנמען בהרמפרודיטים בו זמנית אלה. בהתחשב בכך שמספר מחקרים התייחסו הזה, זה עשוי להיות הרבה יותר נפוץ באופן פנימי דישון הרמפרודיטים מאשר כיום משתקף בספרות המדעית. במיוחד כאשר אחד מבין שבחירת בן זוג לפני הזדווגות ותחרות הזרע הוכחו לשחק תפקיד חשוב בהרמפרודיטים אלה 14, שhighlights הפוטנציאל של חלבוני בלוטת אבזר גבריים כגון להיבחר מיני במערכת זו. לבסוף, מחקר זה מסייע לתמיכה ברעיון הפיתוח שחלבוני נוזל זרע הם בעלי חשיבות שווה להרמפרודיטים בו זמנית כפי שהם למיני דחף מיניים נפרדים.

עם ההעברה, תאי זרע הם בדרך כלל מלווים בנוזל זרע מיוצר על ידי בלוטות אבזר מין זכר. בעוד כמה רכיבי שפיכה לשחק תפקידים בזרע מזין והפעלת 1, אחרים להשפיע על פיזיולוגיה נשית כדי להגדיל את ההצלחה של הפריה של תורם הזרע 2-4. השפעות אלה נבחרו במיוחד עבור, דרך ברירה מינית, כאשר מינים הוא מופקרים ביותר ויש לו אחסון זרע יעיל ועיכול זרע. בתנאים אלה, תורמי זרע להתחרות בכבדות להפריה של ביצים 5. אמנם יש ראיות בשפע מתאמים לחשיבות של חומרי נוזל זרע להצלחת הפריה ממין זכר, עדות ישירה היא יותר נדירה וכמה מחקרים התעמקו בפרטים של השינוי ו / או חומרים מעורבים 6 הפיסיולוגיים. במינים עם מינים נפרדים (כלומר, זכרים ונקבות; gonochorists) יש speci מודל חקר היטב כמהes כשזה מגיע להרכב נוזל זרע ואת ההשפעות שלהם. דוגמאות כוללות את זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster 6, יתושים המלריה, אנופלס 7 gambiae, וחיפושית הקמח האדומה, castaneum Tribolium 8. מחקרי נוזל זרע כאלה הם נדירים הרבה יותר כשמדובר במינים שהם בו זמנית hermaphroditic (כלומר, אנשים הם מבחינה פונקציונלית זכר ונקבה באותו הזמן), למרות שהמצב של רבייה זו הוא נפוץ בכל רחבי הממלכה 9 בעלי החיים. דוגמא hermaphroditic הבולטת ביותר של העברת חומר בלוטת אבזר היא כנראה הירי של מה שנקרא אהבה בחצי שבלולי היבשה 2,10, שבו החומר מועבר על ידי תורם הזרע באמצעות הזרקת מזרק 11,12, כלומר, לא יחד עם תאי הזרע. אבל יש הרבה הרמפרודיטים בו זמנית, כי העברת מוצרי בלוטת אבזר גבריים יחד עם הזרע שלהם,כגון מיני המודל משמשים כאן, הברכה הגדולה חילזון Lymnaea stagnalis. המחקרים קודמים כבר הוכיחו כי קבלת נוזל הזרע משפיעה על תפוקת הרבייה הנשית של מין זה 13-15, וכמה מחלבוני נוזל זרע המעורבים זוהו 16,17. המטרה הכללית של פרוטוקול זה, שהוא שלוחה של השיטות שדווחו בKoene אח&#39; 16, היא לבדוק את ההשפעות של חלבוני נוזל זרע על פרמטרים שונים של הטלת ביצים ברכיכות חלזון. המטרה זו מושגת על ידי נתיחה של בלוטת הערמונית (כלומר, בלוטת האבזר הגברית ייצור נוזל הזרע) של חלזונות תורם מבודדים מבחינה מינית מתרבות מעבדה סטנדרטית. שנית, הזרע של התורם נאסף משלפוחית ​​הזרע ופתרונות טיפול שונים עשויים. בהמשך לכך, חלזונות מבחן הם מורדמים וintravaginally הוזרקו פתרון מבחן (לדוגמא,תמצית בלוטת ערמונית לבד, תמצית בלוטת ערמונית עם זרע, זרע לבד, בינוני נושאת לבדה). אז חלזונות מבחן אלה במעקב במשך הימים הבאים לשבועות, בתנאים סטנדרטיים, להקליט הטלת ביצים. המוני ביצה נאספים, באופן דיגיטלי שנסרקו לספירה ומדידת פרמטרים שונים, ולאחר מכן לשים בצלוחיות אישיות לבקיעה. לאחר כשבועיים, הגוזלים נספרים ונסרקו באופן דיגיטלי. כל הסריקות, שבשני המוני ביצה וגוזלים, לאחר מכן נותחו באמצעות חבילת תוכנת ניתוח תמונה באופן חופשי, זמינה. לפרוטוקול זה משמש זן המעבדה של החילזון הגדול בריכה, stagnalis Lymnaea,, שהוא גידל באוניברסיטת VU באמסטרדם. מין זה משמש כמערכת מודל לחקר שאלות על בחירה ורבייה בהרמפרודיטים מיניות. הגודל הגדול יחסית של בעלי החיים עושה את זה באופן ניסיוני מאוד נגיש. בנוסף לכך, משום שהוא משמש כמיני מודל ברבים בדיסציפלינות iological אנחנו כבר יודעים הרבה על הביולוגיה הבסיסית של בעלי חיים אלה. שיטה זו תעזור לשאלות מחקר על תהליכים של ברירה מינית שמתווכים באמצעות חלבוני נוזל זרע באופן כללי. בנוסף, מכיוון שמדובר בהרמפרודיטים בו זמנית, זה אפשרי כדי לטפל באם חלבונים כגון לפעול בדרכים דומות ו / או שונות כפי שהם עושים במינים שבם המינים מופרדים 16,17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:85px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fish food flakes</td>
			<td style="width:85px;">TetraPhyll</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stereo microscope</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">small surgical scissors</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">coarse and fine forceps</td>
			<td style="width:85px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 Mm MgCl2</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5.83 mmol L-1 CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3.76 mmol L-1 MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">42.69 mmol L-1 NaCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">37.53 mmol L-1 KCl</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Two component Silicon</td>
			<td style="width:85px;">Sylgard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 mm syringes</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon tubing (diameter 1 mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">blunted injection needles (0.3mmx13mm)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorff</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">460-ml perforated containers</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">metal leaf puncher (19.6 cm2)</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">spatula/spoon</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(laptop) computer</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">flatbed scanner</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">millimeter scale</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">transferring plates</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass tiles</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">20 ml glass vials</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of male accessory gland products on egg laying in gastropod molluscs

באופן פנימי דישון בעלי חיים, נוזל זרע הוא הוסיף בדרך כלל לתאי הזרע, יחד ויוצרים את הזרע או שפיכה. חוץ מזרע מזין והפעלה, הרכיבים בנוזל הזרע יכולים גם להשפיע על פיזיולוגיה נשית כדי להגדיל את ההצלחה הפריה של תורם הזרע. בעוד שמחקרים רבים דיווחו על תופעות כאלה במין עם מינים נפרדים, מעט מחקרים עסקו זה בבעלי החיים בו זמנית hermaphroditic. פרוטוקול וידאו זה מציג שיטה ללמוד השפעות של נוזל זרע בחלזונות, באמצעות חילזון בו זמנית hermaphroditic מים מתוקים, stagnalis Lymnaea חילזון הברכה הגדול, כמו אורגניזם מודל. בעוד ההליך מוצג באמצעות תמציות בלוטת ערמונית שלמות, רכיבים בודדים (כלומר, חלבונים, פפטידים, ותרכובות אחרות) של נוזל הזרע, ניתן לבדוק באותו אופן. השפעות של קבלת רכיבי שפיכה בנחת ביצה ניתן לכמת במונחים של תדירות של הטלת ביצים והערכות עדינות יותר של ביצועי רבייה נשיים כגון מספרי ביצה בתוך כל המוני ביצה. תוצאות מראות כי חלבוני נוזל זרע משפיעים על פלט רבייה נשי באנדרוגינוס בו זמנית זו, המדגיש את החשיבות שלהם לברירה מינית.

איור 1 מציג את האחוז של בעלי חיים להטיל ביצים לאחר הזרקת intravaginal של או חומר השליטה (מי מלח), Ovipostatin, או Ovipostatin מלווה עם זרע. N = 15 עבור כל טיפול; לראות Koene אח&#39; 16 לפרטים ונתונים סטטיסטיים (מקור: איור 3 מKoene אח&#39; 2010, PLoS ONE.).. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. השפעת Ovipostatin בייצור המוני ביצה של Lymnaea stagnalis. הגרף מראה את האחוז של בעלי חיים להטיל ביצים לאחר הזרקת intravaginal של או חומר השליטה (מי מלח), Ovipostatin, או Ovipostatin מלווה עם זרע. N = 15 עבור כל טיפול; לראות Koene et al. פרטים 2010 ונתונים סטטיסטיים. להדפיס מחדש באישור Koene אח&#39; 2010 PLoS ONE 5:. E10117.

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs at JoVE.com

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

השפעה של זכר אבזר בלוטת מוצרים בהטלת ביצים ברכיכות חלזון

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

effect-male-accessory-gland-products-on-egg-laying-gastropod

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K Views.  VU University. This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Video: Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

מדידת ההשפעות של חיידקים על<em&gt; ג Elegans</em&gt; התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

הר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; כלת שיטה עבור חלזון הרכיכות<em&gt; Stagnalis Lymnaea</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

השפעה של זכר אבזר בלוטת מוצרים בהטלת ביצים ברכיכות חלזון

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video