פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את התהליך שבו מגוון רחב יותר של חלבונים מבשר מופרדים, כולל בני משפחה TGF-beta, מומרים לחלבונים פעילים בעקבות מחשוף פרוטאוליטי. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מספק שיטות מהירות וזולות מאוד כדי להשיג מוצר מחשוף TGF-בטא מרוכז מאוד ב vivo במצב חזותי. ראשית, לאחר ההזרקה ביום שלמחרת, להסיר פתרון Ficoll וכל עוברים מתים או גוססים, ולאחר מכן לשטוף את העוברים פעם או פעמיים עם MBS ותרבות העוברים ב- MBS על הספסל בטמפרטורת החדר או ב 16 מעלות צלזיוס באינקובטור כדי להאט את ההתפתחות.
מחממים ומושכים את נימי הזכוכית לנקודה עדינה באמצעות פולר מיקרופיפט עם ההגדרות הרצויות. באמצעות מלקחיים, קליפ את קצה מחט משך. כדי למנוע סתימה, פתיחת מחט השאיפה blastocele צריך להיות גדול יותר מחט microinjection.
הכנס את מחט השאיפה למחזיק המחט המחובר למיקרו-מנג'ר וחבר את מחזיק המחט למיקרו-מניפולטור. מניחים עוברים בשלבי גסטרולה מוקדמים עד בינוניים במגש הזרקה או צלחת ממולאים ב- MBS. הכנס את המחט מתחת לפני השטח של העובר ליד עמוד החיות.
לחץ על כפתור המילוי על המיקרו-נג'ר תוך התבוננות במחט ובעובר באמצעות מיקרוסקופ ניתוח. במשך כמה שניות, רמת הנוזל הצלול עולה במחט והעובר מתמוטט והופך קרוט. פעימה את כפתור ההזרקה פעם אחת או יותר כדי להוציא כל חומר לבן מעונן שנכנס למחט המכילה פסולת או פרוטאזים.
כדי לזהות את מוצרי המחשוף על חיסונים, לשאוף את נוזל blastocele של 10 עד 20 עוברים או יותר בהתאם לנוגדן. פיפטה מיקרוליטר אחד של מים ללא גרעין על חתיכת פרפין שהונחה על מגש ההזרקה. תטביעו את המחט בטיפת המים ולחצו על כפתור ההזרקה כדי להפיג את נוזל הבלסטוזל למים.
לחלופין, כדי להוציא את הנוזל ישירות על parafilm ולמנוע ממנו לשטח החוצה, דופק את כפתור ההזרקה כדי לגרש את הנוזל תחת לחץ נמוך יותר. מעבירים את נוזל הבלסטוצל שנקטף לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי על קרח ומוסיפים מים ללא גרעין כדי להתאים את הנפח הסופי ל-30 מיקרוליטרים. כדי לזהות חלבונים מבשר TGF-beta, להעביר את נוזל blastocele מדולדל עוברים לצינור נפרד על קרח.
הסר MBS עודף ולהוסיף 200 microliters של חוצץ lysate עובר צונן מראש. כדי להומוגניזציה מלאה של העוברים, פיפטה למעלה ולמטה 10 עד 20 פעמים עד שלא יישארו גושים. צנטריפוגות העוברים הומוגניים במיקרוצנטריפוגה בקירור ב 10, 000 פעמים G במשך 10 דקות, ולאחר מכן להסיר 160 microliters של supernatant באמצעות פיפטה P200 ולהעביר צינור חדש על קרח, נזהר כדי למנוע את חלבוני החלמון הלבן ופסולת תאית אחרת במחצית התחתונה של הצינור.
חזור על המיקרו-צנטריפוגה פעם אחת והעבר 128 מיקרוליטרים של הסופר-נט-נט הצלול לצינור חדש על הקרח. בשלב זה, עובר נקי lysates ואת נוזל blastocele שנאסף ניתן לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס כל עוד תרצה. Deglycosylate החלבונים המבקעים הקיימים בנוזל blastocele שונה דרך רשת טרנס-Golgi עם PNGase F על ידי ביצוע הוראות היצרן.
המוצרים deglycosylated היה נודד כמו להקה מרוכזת יותר על ג'לים SDS, אשר יכול לסייע בזיהוי מדויק. כדי להעריך את מונומרים שבר פרודומיין וחלבונים נפתחים blastocele ו lysate, לנתח את החלבונים בתנאים מופחתים על ידי הוספת חמישה microliters של הפחתת 4X חוצץ מדגם ל 15 מיקרוליטרים בנוזל blastocele ו 15 microliters של ליסאט עובר מובהר. כדי להעריך את היווצרותם של ליגנדים הומודימריים או הטרודימריים מאופקים ב- blastocele, לנתח את החלבונים בתנאים שאינם מצמצמים על ידי הוספת חמישה מיקרוליטרים של חיץ מדגם 4X שאינו מפחית ל -15 המיקרוליטרים הנותרים של נוזל הבלסטוצ'ל, ואז לחמם אותו במשך חמש דקות ולהניח אותו על קרח.
לאחר שימוש בפרוטוקול זה, החלבונים הופרדו על ידי SDS-PAGE והחיסון נבדק עם נוגדנים שזיהו את תג האפיטופ של מיק. בתנאים המצטמצמים, בlysates מעוברים מבטאים רק Bmp4 או Bmp7, להקה אחת המתאימה מונומרים Bmp4 מבקע ולהקה נודדת איטית יותר המתאימה מונומרים Bmp7 שנבקעו זוהו. שתי הלהקות התגלו בעוברים המביעים את Bmp4 ו-Bmp7.
כאשר החלבונים הופרדו בתנאים שאינם מצמצמים, הלהקה ההטרודימרית הבוגרת היחידה של Bmp4 ו-7 של ניידות ביניים התגלתה יחד עם כמות זעירה של הומודימר Bmp4 בעוברים המבטאים במשותף את Bmp4 ו- Bmp7. היווצרות הטרודימר Bmp4 ו- Bmp7 נצפתה גם כאשר רמות החלבון Bmp7 היו גבוהות. עם זאת, במקרה זה, עודף Bmp7 יצר homodimers ועוברים שיתוף ביטא Bmp4 ו Bmp7.
תוצאות אלה הראו כי Bmp4 ו 7 מעדיפים ליצור הטרודימרים כאשר התבטאו במשותף בעוברים קסנופוס laevis. בניסוי זה, איסוף blastocele טהור הוא הצעד החשוב ביותר אשר דורש ניסיון טיפול מחט מדויק. אז פשוט תמשיך לנסות ולתקן שגיאות.
הליך זה בודק אם הטרודימרים BMP טופס אילו חומצות אמינו חשובות לכך. השלב הבא, עכבר knockin יכול להיווצר לשאול אם חומצות אמינו אלה חשובים מבחינה תפקודית במהלך התפתחות היונקים.
