فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور هاريس برنت لتقديم مراجعة نقدية للمخطوطة. وأجريت هذه الدراسات في لومباردي الشامل للسرطان مركز التشريح والأنسجة الموارد المشتركة التي يتم بدعم جزئي من المعاهد الوطنية للصحة / NCI منحة P30-CA051008. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو المعاهد الوطنية للصحة.

1. البناء من البقعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ملغ من الأبقار مصل الزلال (BSA) إلى 1 مل الأنسجة بمناسبة الصبغة في 15 مل أنبوب مخروطي أو 2 مل microfuge أنبوب ودوامة لمدة 1 دقيقة أو حتى يذوب تماما. ملاحظة: للحصول على هذا البروتوكول، واستخدام الكيمياء الحيوية العلمية BSA. في حين لم يتم اختبارها درجات ودرجات نقاء أخرى، فإنه من المتوقع أن الصف ونقاء لن يكون لها تأثير كبير على نجاح الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة 9 هيدروكسي مل جل معالجة الاغاروز في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل في الميكروويف في السلطة بنسبة 30٪ لمدة 10 ثانية بزيادات حتى ذاب جل تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين هلام المعالجة ذاب ومحلول الصبغة-BSA في واحد 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وتخلط جيدا مع ماصة. دوامة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب مخروطي الشكل في الثلاجة لبضع ساعات أو حتى الصلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام طويلة، رقيقة، ملعقة معدنية أو التحقيق لاطلاق سراح جل المكونات الملونة بلطف من أنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مشرط أو شفرة حلاقة لCUر جل المكونات بالعرض إلى 5 مم أبواب سميكة. إزالة نهايات مدورة وتتخلص من النفايات (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المقاطع جل المكونات شقة في أشرطة الأنسجة وعقد في 70٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة. تغيير الحل الايثانول 70٪ كل 2-4 ساعة لا يقل عن 3 تغييرات على مدى فترة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العملية يدويا الأقسام هلام من خلال سلسلة الايثانول (1 ساعة لكل: 70٪ من الإيثانول و 80٪ من الإيثانول و 95٪ من الإيثانول، و 100٪ من الإيثانول (التغييرات 3X)، ثم واضحة في تطهير حل 3X لمدة 1 ساعة لكل منهما (على سبيل المثال، والهيدروكربونات الأليفاتية ( الزايلينات بديل)) استخدمت في هذا البروتوكول، الزايلينات مقبولة أيضا)، والتسلل مع البارافين المنصهر (3X لمدة 1 ساعة لكل منهما)، إما يدويا أو في processer الأنسجة. ملاحظة: قبل الجفاف الكامل في الإيثانول بنسبة 100٪، وصبغ قد تسرب من المكونات هلام التي يمكن أن تؤثر على الأنسجة الأخرى والسائل الكواشف في معالج النسيج الآلي. كما ينصح بشدة من هذا القبيل، الإماهة اليدوي، وتجهيز ولكن الآلي هو من الأجهزةفعالية حليف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين عدة أقسام هلام معالجتها باستخدام البارافين العادي تضمين المنهجية (الشكل 2B). السماح لبنات لتبرد وتتصلب ثم يأتي إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إبرة الجلد لكمة من الحجم المطلوب لإزالة النوى بقعة من الأقسام هلام جزءا لا يتجزأ حتى يتم استنفاد كتلة (الشكل 2C). قد توفر كتلة واحدة تصل إلى 20 × 2 مم 2 النوى. تخزين النوى في منطقة باردة. استخدام الجلد لكمة في هذا البروتوكول أنظر الشكلين، 1.5 مم (أرقام 1D، و2D) أو 2 مم (أرقام 1B، 1C، و2C). </li></ol> 2. استخدام المواقع لبنات الشرق غير المحتشدة- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء رسم تخطيطي التوجه الأنسجة للإشارة إلى مواقع وهويات كل من قطعة نسيج الفردية لتكون جزءا لا يتجزأ معا المطلوب، وموقع الفور. ملاحظة: الرسم البياني التوجه الأنسجة هو مخطط يتضح أن يشمل عمواقع hysical من كل قطعة نسيج المسمى مع معرفات وموقع الفور. ويمكن أن تنشأ إلكترونيا أو يمكن أن تكون مرسومة باليد. يجب إنشاء الرسم البياني باستخدام أي أسلوب يناسب فني وباحث استخدام المنتج النهائي. هذه الخريطة ستكون بمثابة دليل للباحث بحيث عينات يمكن التعرف عليها بسهولة أثناء التحليل المجهري. خريطة المستخدمة في هذا البروتوكول ومرسومة باليد. وهو يصور كتلة النسيج والزجاج المجهر الشريحة مع كل قطعة من النسيج وبقعة المرسومة، وصفت في نفس موقف كتلة النسيج الفعلي والشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة قطع الأنسجة بشكل طبيعي، والتأكد من أنها لا تزال حددت بشكل صحيح في جميع أنحاء إجمال وتجهيز الخطوات. لهذا البروتوكول، معالجة الأنسجة لمدة 1 ساعة في كل من: الايثانول 70٪، و 80٪ من الإيثانول و 95٪ من الإيثانول، و 100٪ من الإيثانول (التغييرات X3)، والهيدروكربونات الأليفاتية (الزايلينات بديل) (تغييرات X3)، والمنصهر تسلل الأنسجة البارافين في 60 ° C (التغييرات X3). ملاحظة:وينبغي معالجة الأنسجة ليرة لبنانية وفقا للإجراءات مختبر الأنسجة القياسية. قد يكون هذا المتغير بسبب إجراءات المختبر الفردية، وحجم الأنسجة ونوع، ولكن هذا لن يؤثر على القدرة على استخدام بقعة كأداة التوجه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب قطعة نسيج على محطة التضمين في المواقع المخصصة الصحيحة وفقا للمخطط التوجه الأنسجة. استخدام الرسم البياني التوجه الأنسجة كمرجع لتوجيه فني على كيفية ترتيب الفور والأنسجة قطعة في كل كتلة. ملاحظة: في هذا البروتوكول وضع فني تضمين مرسومة باليد خريطة التوجه بجوار محطة التضمين وترتيب القطع الأنسجة في المحطة التضمين في بالضبط نفس الترتيب كما رسمها على الرسم البياني. هذا يضمن أن كل قطعة نسيج تبقى تحديدها بشكل صحيح في المنتج النهائي. هذا هو في غاية الأهمية لنجاح استخدام كتل متعددة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان جوهر بقعة أطول من كل قطعة نسيج لتكون جزءا لا يتجزأ في كتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين قطعة نسيج ثم بقعة على نهاية (عرضية) في المواقع المناسبة وفقا للمخطط التوجه النسيج باستخدام منهجية التضمين القياسية. حسب الحاجة، مع الاستمرار على بقعة (ق) في وضع مستقيم مع ملقط حتى عزز البارافين يكفي أن بقعة (الصورة) لن تسقط فوق (1-2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسم وصمة عار البارافين أقسام مع البقعة باستخدام منهجية موحدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سماح المقاطع لتطفو على حمام مائي عند 40 ° C والالتزام بها شريحة زجاجية موجبة الشحنة (لم يتم اختبارها الشرائح بدون تهمة). تجفيف الشرائح في فرن التجفيف عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشرائح في الملطخ التلقائي ومعالجتها من خلال الكواشف التالية: الزايلينات (الزايلينات 1-5 دقيقة، الزايلينات 2 و3-2 دقيقة، لكل منهما)، و 100٪ من الإيثانول (2 دقيقة)، و 95٪ من الإيثانول (1 دقيقة)، 80 ٪ من الإيثانول (30 ثانية)، و 70٪ من الإيثانول (30 ثانية)، تشغيل ماء الصنبور (2 دقيقة)، الهيماتوكسيلين (1.5 دقيقة)، تشغيل ماء الصنبور (3 دقائق)، والكحول الحمضية (1 دقيقة)، تشغيل ماء الصنبور (2 دقيقة )، ازكاشف uing (1 دقيقة)، والمياه الجارية (2 دقيقة)، و 80٪ من الإيثانول (30 ثانية)، يوزين (1 دقيقة)، والمياه الجارية (10 ثانية)، و 80٪ من الإيثانول (1 دقيقة)، و 100٪ من الإيثانول (3 تغييرات، 2 دقيقة لكل منهما)، الزايلينات (3 تغييرات، 30 ثانية لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الشرائح مع coverslips الزجاج، التي شنت مع تصاعد المتوسط. ملاحظة: في هذا البروتوكول، مقطوع histotechnician كتل البارافين على مشراح في 5 ميكرون أقسام. لهذا البروتوكول استخدمنا الملطخ التلقائي، ولكن النتائج متساوية يمكن الحصول عليها عن طريق تلطيخ اليدوي. </li></ol></li></ol> 3. بقعة في الواجبات الشهرية (دليل TMA كيت) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء رسم تخطيطي التوجه الأنسجة، كما هو موضح في 2.1 وتعيين المكان الذي ترغب به (ق) من الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء القالب TMA مع البارافين ذاب في محطة التضمين. كما العفن والتبريد، تضمين بقعة (ق) في نهاية على هامش القالب TMA في الأماكن المطلوبة المشار إليها بواسطة الرسم البياني التوجه الأنسجة. حسب الحاجة، مع الاستمرار على بقعة (ق) في وضع مستقيم مع ملقط حتى البارافين هكتارالصورة عزز يكفي أن بقعة (الصورة) لن تسقط فوق (1-2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع النوى TMA وفقا لتوجيهات المصنع وفيما يتعلق بموقع البقعة (ق) على هامش مجموعة (الشكل 2D)، واتباع بروتوكولات باجتزاء وتلطيخ القياسية. ملاحظة: الرجاء راجع الخطوة 2.6 لرؤية باجتزاء وتلطيخ الأساليب المستخدمة في هذا البروتوكول. </li></ol>

<ol>
	<li>Jawhar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+rapidly+evolving+diagnostic+and+research+tool.">Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool.</a> Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).</li><li>Dhir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays:+an+overview.">Tissue microarrays: an overview.</a> Methods Mol. Bio. 441, 91-103 (2008).</li><li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tissue+microarrays.">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopath. 15 (3), 142-150 (2009).</li><li>Saxena, R., Bade, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7+Tissue+Microarray+–+Construction+and+Quality+Assurance.">Ch. 7 Tissue Microarray – Construction and Quality Assurance.</a> Immunohistochemical Staining Methods 6th ed. , (2013).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O., Sauter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1-5 (2001).</li><li>Rangel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue+microarray:+helpful+hints.">The tissue microarray: helpful hints.</a> J.Histotech. 25 (2), 93-100 (2002).</li><li>Hammer, A., Williams, B., Dietz, H., Hamilton-Dutoit, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+immunophenotyping+of+43+ferret+lymphomas+using+tissue+microarray+technology.">High-throughput immunophenotyping of 43 ferret lymphomas using tissue microarray technology.</a> Vet. Path. 44, 196-203 (2007).</li><li>Eckel-Passow, J., Lohse, C., Sheinin, Y., Crispen, P., Krco, C., Kwon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays:+one+size+does+not+fit+all.">Tissue microarrays: one size does not fit all.</a> Diagn Pathol. 5, 48-57 (2010).</li><li>Lin, Y., Hatem, J., Wang, J., Quinn, A., Hicks, D., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray-based+immunohistochemical+study+can+significantly+underestimate+the+expression+of+HER2+and+progesterone+receptor+in+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.">Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast.</a> Biotech. Histochem. 86 (5), 345-350 (2011).</li><li>Wampfler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+optimal+numbers+of+cores+based+on+tissue+microarray+antibody+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer.">Determining the optimal numbers of cores based on tissue microarray antibody assessment in non-small cell lung cancer.</a> J Cancer Sci. Ther. 3, 120-124 (2011).</li><li>Quagliata, L., Schlageter, M., Quintavalle, C., Tornillo, L., Terracciano, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+players+in+hepatocarcinogenesis:+Limits+and+opportunities+of+using+tissue+microarray+(TMA).">Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA).</a> Microarray. 3, 91-102 (2014).</li><li>Miettinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+generating+multitissue+blocks+without+special+equipment.">A simple method for generating multitissue blocks without special equipment.</a> Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).</li><li>Jones, M., Calabresdi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-gelatin+for+embedding+tissues+prior+to+paraffin+processing.">Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing.</a> BioTechniques. 42, 569-570 (2007).</li><li>Carson, F., Hladik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histotechnology: A Self-Instructional Text. , (2009).</li><li>Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft&#8217;s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الإعداد الناجح والاستفادة من البقع يتطلب الالتزام الدقيق بضع خطوات التقنية. وينبغي أن يتم ذوبان الاغاروز هيدروكسي إيثيل ببطء وعلى درجة حرارة منخفضة. يمكن أن يذوب بسرعة في درجة حرارة عالية يؤدي في بعض انهيار الاغاروز لأقل من النتائج المثلى. عندما قطع المقابس صبغ لادن...

القدرة على تضمين عينات الأنسجة من الأفراد متعددة في كتلة البارافين واحد تمكن من السهل جنبا إلى جنب مقارنة بين العلاج والأفراد، ويزيل التباين بين الشرائح، ويقلل من التكاليف وحجم العمل من باجتزاء وتلطيخ العينات. وتنتج عادة هذه الكتل متعددة الأنسجة إما ميكروأرس الأنسجة (TMA) أو كتل البارافين تحتوي على الأنسجة من الأفراد متعددة في تخطيط غير صفيف. الحفاظ على الهوية عينة أمر بالغ الأهمية لنجاح أي تحليل الأنسجة المتعدد. وكان الباحثون باستخدام الواجبات الشهرية منذ تنميتها لتحسين كفاءة التحليل، والحد من التباين بين الشرائح والحفاظ على الموارد الأنسجة القيمة، وتقليل الوقت والتكلفة من التجارب 1. التوجه الصحيح من الواجبات الشهرية ويمكن تحقيق ذلك باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق، بما في ذلك المساحات الفارغة، الصفوف أو الأعمدة بين النوى الأنسجة 2-4، ترتيب غير متماثل المجموعات الأساسية 3 و 5 (على سبيل المثال، كنتروللتر مقابل العلاج)، النوى &quot;منارة&quot; 6، والنوى التوجه المخصصة الموجودة خارج المصفوفة TMA 3. على الرغم من أن هذه الأساليب تعمل بشكل جيد لالواجبات الشهرية، فإن معظم تستهلك قيمة مساحة TMA الأساسية والواجبات الشهرية مع وجود ثغرات ومساحات كما قد تصبح معرفات مربكا كما يتم استنفاد النوى الأنسجة مع مرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الأساليب ليست مناسبة للاستخدام في كتل متعددة الأنسجة من دون شكل مصفوفة لأنها تعتمد على الشذوذ في نمط أمر محكم من النوى ميكروأري موحدة كما معرفات. يجب أن معظم كتل غير المحتشدة متعددة الأنسجة استيعاب الأنسجة غير موحدة و، بالتعريف، لا تعرض الشبكة مجموعة منظمة التي تجعل من هذه الانحرافات تبرز بوصفها المعالم. على الرغم من أن هناك العديد من المزايا لاستخدام TMA، واحدة من أكبر عيوب هو صغر حجم النوى التي ليست دائما ممثل من الأنسجة غير متجانسة إلى حد كبير +1. توفر كتل متعددة الأنسجة غير المحتشدة على الكثيرين رانه يستفيد من TMA، ولكن احتواء عينات الأنسجة أكبر، أو الأجهزة كلها من الدراسات على الحيوانات. ميكروأرس الأنسجة باستخدام النوى واحدة وقد متفاوتة التوافق مع قطاعات النسيج كله يعتمد على البروتين من الفائدة وتتطلب العديد من النوى متعددة لزيادة التوافق 11/07. بسبب الطبيعة المعقدة وغير متجانسة من بعض الظواهر العلامات البيولوجية، الواجبات الشهرية باستخدام حتى أعداد كبيرة من النوى (&gt; 10) يمكن أن تكون لا تزال غير كافية وربما تتطلب أساليب أخرى غير المجهرية للتحليل 8. بالإضافة إلى ذلك، بناء TMA هو مضيعة للوقت، يتطلب تقنية عالية، ويتطلب التكلفة الأولية والاستثمار في أو الوصول إلى arrayer الأنسجة. غير العريض كتل متعددة الأنسجة ويمكن إجراء في أي مختبر الأساسي مع الوقت والجهد أقل بكثير وغير بديلا صالحا للدراسات التي تتطلب المزيد من الأنسجة من صفائف تسمح أو كوسيلة لخفض التكاليف وتبسيط التحليل. كتل المحتشدة غير متعدد الأنسجة تتطلب بالمثل يمكن الاعتماد عليها أوientation علامة لتعقب تحديد العينة، ومع ذلك، فإن تطوير هذه العلامات كانت محدودة. وتركز الكثير من الأدب يصف التوجه الأنسجة على التوجه الفسيولوجية الصحيح لترسيخ قطعة نسيج الفردية، مثل الوشم الأنسجة مع الحبر 12، الأنسجة في أجار الجيلاتين قبل التضمين قبل تجهيزها 13، ووضع العلامات أنسجة معينة مع الشقوق 14 أو الغرز 15 . على الرغم من وظيفية، وهذه الأساليب ليست مثالية كعلامات في كتل متعددة الأنسجة بسبب محدوديتها. سيتم مقطوع وخياطة من خلال بسرعة وقد لا تكون مرئية في كل قسم. باستخدام تقنيات أجار الجيلاتين قد حفاظ على الأنسجة في التوجه السليم أثناء معالجة وتضمينها ما قبل التضمين، ولكن لا يوفر جديلة البصرية للتمييز بين عينات متعددة في كتلة البارافين والشرائح. الشقوق أو الصبغة على النسيج قد تعقد تحليل أو تسد التفاصيل المورفولوجية الهامة. بدلا من ذلك، هوية الأنسجةفي كتلة غير المحتشدة متعددة الأنسجة لا يمكن الحفاظ عليه من خلال التضمين من قطعة نسيج في ترتيب غير متماثل، ولكن هذا يتطلب 3 أو أكثر من قطعة نسيج وقد لا تسمح لترتيب الأمثل من الأنسجة لتحليلها. تم تطوير التوجيه بطاقة العينة (البقعة) باعتبارها طريقة سهلة وغير مكلفة لتحديد واضح الأنسجة في كتل متعددة الأنسجة ويقدم العديد من الفوائد مقارنة مع الطرق التوجه القائمة. البقعة هو صغير، ملونة، الأساسية تتألف من هيدروكسي إيثيل الاغاروز هلام تجهيز والأنسجة بمناسبة صباغة، وتسللت مع البارافين (الشكل 2C). وجزءا لا يتجزأ من جوهر بقعة على نهاية بجوار الأنسجة واحدة في أنسجة متعددة كتلة البارافين ويظهر على شكل نقطة ذات الألوان الزاهية في كتلة وفي كل قسم (الشكل 1A - D)، مما يدل بوضوح على التوجه الصحيح للكتلة والأقسام لتحديد الأنسجة سهلا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HistogelTM Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marking Dye</td>
			<td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TMD-5</td>
			<td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td>
			<td>Arraymold</td>
			<td>20015A</td>
			<td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

توفر كتل البارافين متعدد الأنسجة تحليل إنتاجية عالية مع زيادة الكفاءة والاتساق التجريبية، وخفض الوقت والتكلفة. ميكروأرس الأنسجة يشكلون غالبية كتل البارافين متعددة الأنسجة، ولكن على نحو متزايد، يستخدم الباحثون كتل غير المحتشدة التي تحتوي على الأنسجة أكبر من الأفراد متعددة والتي يمكن أن توفر العديد من المزايا من ميكروأرس الأنسجة دون استثمارات كبيرة في التخطيط والمعدات. ثمة عنصر حاسم في أي تحليل متعدد الأنسجة هو الأسلوب التوجه المستخدمة لتعريف كل الأنسجة الفردية. على الرغم من وجود طرق للحفاظ على التوجه السليم وتحديد الأنسجة في كتل متعددة الأنسجة، معظمهم ليسوا مناسبة تماما لكتل ​​غير المحتشدة، قد تستهلك حيزا هاما ضمن مجموعة و / أو من الصعب أن تنتج في مختبر الأنسجة القياسية. التوجه بطاقة العينة (البقعة) هي بسيطة، وانخفاض أداة التوجه التكلفة التي هي واضحة للعيان في كتل البارافين وجميع أقسام الأنسجة FOص تحديد العينة موثوق بها في تخطيطات المحتشدة وغير المحتشدة. يوفر بقعة المزايا على أساليب التوجيه الحالية لكتل ​​غير المحتشدة كما أنها لا تتطلب أي تعديل المباشرة للأنسجة ويسمح للمرونة في ترتيب قطع الأنسجة.

يبدو أن بقعة بمثابة الجولة، النقطة ذات الألوان الزاهية في كتلة البارافين (1A الشكل و 2D)، في جميع أقسام البارافين، ويبقى على شريحة زجاجية من خلال إجراء H &amp; E أو IHC تلطيخ (أرقام 1B - 1D، و2D). وهذا يمكن واضحة المساعدات جديلة البصرية على حد ?...

Watch this Scientific Journal Video about SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks at JoVE.com

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

الغرض من توجيه بطاقة العينة (البقعة) أن يعمل كأداة توجيه للمساعدة في تحديد الأنسجة الفردية في كتل البارافين متعددة الأنسجة. تظهر هذه البروتوكولات كيف يتم بناؤها بسهولة من المشتركة، والمواد الأنسجة ذات التكلفة المنخفضة وبمثابة علامة بصرية موثوقة في كتل البارافين والأقسام.

بقعة الأنسجة الصحيحة في كل مرة في كتل متعددة النسيج

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

spot-the-correct-tissue-every-time-in-multi-tissue-blocks

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  Frederick National Laboratory for Cancer Research.  الغرض من توجيه بطاقة العينة (البقعة) أن يعمل كأداة توجيه للمساعدة في تحديد الأنسجة الفردية في كتل البارافين متعددة الأنسجة. تظهر هذه البروتوكولات كيف يتم بناؤها بسهولة من المشتركة، والمواد الأنسجة ذات التكلفة المنخفضة وبمثابة علامة بصرية...

Video: SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

زرع الأنسجة المهندسة في قلب فأر

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

تحليل التعبير الجيني في الحفار الرماد الزمرد ( Agrilus planipennis) عن طريق ريال الكمية من الزمن - PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

الكميات بؤر γH2AX في عينات الأنسجة

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

التلاعب في الغدة الدمعية الفئران

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

تشريح السمعية بولا بعد الولادة في الفئران: عزل العظام الأذن الوسطى وتحليل النسيجي

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

أديبو--واضحة: منديل مسح طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الدهنية

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...