Les auteurs tiennent à remercier le Dr Brent Harris pour fournir un examen critique du manuscrit. Ces études ont été menées à l&#39;Lombardi Comprehensive Cancer Centre histopathologie et de tissus ressource partagée qui est financé en partie par le NIH / NCI subvention P30-CA051008. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les positions officielles de l&#39;Institut national du cancer ou de la National Institutes of Health.

1. Construction de la tache <ol><li> Ajouter 50 mg de sérum-albumine bovine (BSA) à 1 ml tissu colorant de marquage dans un tube conique de 15 ml ou 2 ml tube de microcentrifugation et vortex pendant 1 minute ou jusqu&#39;à dissolution complète. Remarque: Pour ce protocole, utilisez biochimique année BSA. Alors que d&#39;autres grades et des puretés ont pas été testés, il est prévu que de qualité et de pureté ne seraient pas avoir un impact significatif sur le succès de la tache. </li><li> Heat 9 ml hydroxyéthyle gel de traitement agarose dans un tube de 15 ml conique dans un micro-ondes à puissance de 30% pour les incréments de 10 secondes jusqu&#39;à ce que le gel soit complètement fondu. </li><li> Combinez le gel de traitement fondu et la solution colorant de BSA dans un seul tube de 15 ml conique et bien mélanger avec une pipette. Vortex la solution. </li><li> Placez le tube conique dans un réfrigérateur pendant quelques heures ou jusqu&#39;à ce que solide. </li><li> Utilisez un long, mince, une spatule ou d&#39;une sonde métallique pour libérer doucement le bouchon de gel de couleur du tube conique. </li><li> Utiliser un scalpel ou une lame de rasoir à cut le gel brancher transversalement en 5 mm d&#39;épaisseur sections. Retirez les extrémités arrondies et éliminer en tant que déchets (figure 2A). </li><li> Placez les sections de bouchon de gel plats dans des cassettes d&#39;histologie et maintenir 70% d&#39;éthanol pendant 1 heure. Changer la solution d&#39;éthanol à 70% tous les 2-4 heures pendant au moins 3 changements sur une période de 24 heures. </li><li> Manuellement traiter les sections de gel à travers une série d&#39;éthanol (1 h chacun: 70% d&#39;éthanol, 80% d&#39;éthanol, 95% d&#39;éthanol, éthanol à 100% (variations 3x), puis clairement à dégager une solution 3x pendant 1 heure chacun (par exemple, des hydrocarbures aliphatiques ( xylènes substitut)) ont été utilisés dans ce protocole, les xylènes sont également acceptables), et infiltrent avec de la paraffine fondue (3x pendant 1 heure chacun), soit manuellement, soit dans un processer de tissu. Remarque: Avant de déshydratation complète éthanol à 100%, le colorant pourrait fuir de la prise de gel qui pourrait affecter d&#39;autres tissus et les réactifs liquides dans un processeur de tissus automatisé. En tant que tel, la réhydratation manuel est fortement recommandé, le traitement automatisé est toutefois équallié efficace. </li><li> Sections multiples Intégrer transformés de gel à l&#39;aide de paraffine norme intégrant la méthodologie (figure 2B). Autoriser les blocs refroidir et durcir, puis revenir à température ambiante. </li><li> Utiliser une aiguille de perforation cutanée de la taille souhaitée pour enlever les noyaux de repérer des sections de gel embarqués jusqu&#39;à ce que le bloc est épuisé (figure 2C). Un bloc unique peut fournir jusqu&#39;à 20 x 2 mm 2 noyaux. Stocker les noyaux dans un endroit frais. Utilisez poinçon cutané dans ce Protocole, voir les figures, de 1,5 mm (figures 1D et 2D) ou 2 mm (figures 1B, 1C et 2C). </li></ol> 2. Utilisation de taches aux blocs Orient non déployées <ol><li> Créer un schéma d&#39;orientation de tissu d&#39;indiquer les emplacements souhaités et les identités de tous les morceaux de tissu individuels à être incorporés en même temps, et l&#39;emplacement du spot. REMARQUE: Le schéma d&#39;orientation des tissus est une carte illustrée qui comprend le pendroits effective sur tous les morceaux de tissu étiquetés avec des identifiants et l&#39;emplacement de la place. Il peut être créé par voie électronique ou peut être dessiné à la main. Le schéma devrait être créé en utilisant la méthode que convient le mieux le technicien et chercheur en utilisant le produit final. Cette carte servira de guide pour le chercheur sorte que les échantillons peuvent être facilement identifiés lors de l&#39;analyse microscopique. La carte utilisée dans ce protocole a été tracé manuel. Il représente une lame de microscope bloc de tissu et le verre avec chaque morceau de tissu et la tache dessiné et marqué dans la même position que le bloc de tissu réel et toboggan. </li><li> Traiter les morceaux de tissu normalement, veiller à ce qu&#39;ils restent correctement identifiés tout au long des étapes de traitement et extrapolation. Pour ce protocole, traiter les tissus pendant 1 heure chacun à: 70% d&#39;éthanol, 80% d&#39;éthanol, 95% d&#39;éthanol, éthanol à 100% (variations x3), hydrocarbures aliphatiques (xylènes de substitution) (variations x3), et fondu infiltration des tissus paraffine à 60 ° C (variations x3). NOTE: All tissus doivent être traitées suivant les procédures de laboratoire d&#39;histologie standard. Cela peut être variable due à la procédure de laboratoire individuel, la taille et le type de tissu, mais ce ne sera pas affecter la capacité à utiliser l&#39;endroit comme un outil d&#39;orientation. </li><li> Disposer les morceaux de tissu sur le poste d&#39;enrobage dans les emplacements corrects assignées conformément au schéma d&#39;orientation tissulaire. Utilisez le schéma d&#39;orientation de tissu comme une référence pour guider le technicien sur la façon d&#39;organiser les repérer et de tissus pièces dans chaque bloc. NOTE: Dans ce protocole, le technicien intégration mis la carte d&#39;orientation dessinée à la main à côté de la station d&#39;enrobage et arrangé les morceaux de tissu sur la station d&#39;enrobage exactement de la même disposition que dessiné sur le diagramme. Cela garantit que tous les morceaux de tissu restent correctement identifiable dans le produit final. Ceci est absolument essentiel à l&#39;utilisation réussie de blocs multi-tissus. </li><li> Vérifiez que le noyau de tache est plus grand que tous les morceaux de tissu pour être intégrés dans le bloc. </li><li> Incluez les morceaux de tissu et puis le spot sur la fin (transversale) dans les emplacements appropriés selon le schéma d&#39;orientation des tissus en utilisant la méthodologie d&#39;intégration standard. Au besoin, tenir la première place (s) debout avec des pinces jusqu&#39;à ce que la paraffine a solidifié assez que l&#39;endroit (s) ne tombe pas (1-2 min). </li><li> sections de la Section et aux taches paraffine avec la tache en utilisant une méthodologie standard. <ol><li> Laisser les sections de flotter sur un bain-marie à 40 ° C et respectées sur une lame de verre chargé positivement (diapositives non chargés ont pas été testées). Sécher les lames dans une étuve à 60 ° C pendant au moins 20 min. </li><li> Placer les lames dans une coloration automatique et traité par les réactifs suivants: (xylènes xylenes 05.01 min, les xylènes 2 et 3-2 min, chacun), 100% d&#39;éthanol (2 min), 95% d&#39;éthanol (1 min), 80 % d&#39;éthanol (30 sec), 70% d&#39;éthanol (30 sec), l&#39;eau du robinet (2 min), l&#39;hématoxyline (1,5 min), l&#39;eau du robinet (3 min), l&#39;alcool de l&#39;acide (1 min), l&#39;eau du robinet (2 min ), blréactif de uing (1 min), eau courante (2 min), 80% d&#39;éthanol (30 s), éosine (1 min), eau courante (10 sec), 80% d&#39;éthanol (1 min), 100% d&#39;éthanol (3 changements, 2 min chacun), les xylènes (3 changements, chaque 30 sec). </li><li> Couvrir les lames avec des lamelles de verre, montées avec un milieu de montage. NOTE: Dans ce protocole, l&#39;histotechnician sectionné les blocs de paraffine sur un microtome en 5 sections um. Pour ce protocole, nous avons utilisé une coloration automatique, mais l&#39;égalité des résultats peuvent être obtenus par la coloration manuelle. </li></ol></li></ol> 3. repérer dans les TMA (TMA Kit Manuel) <ol><li> Créer un schéma d&#39;orientation de tissu, comme décrit dans 2.1 et affecter l&#39;emplacement souhaité (s) de la tache. </li><li> Remplissez le moule avec de la paraffine fondue TMA à un poste d&#39;enrobage. Comme le moule est de refroidissement, intégrer l&#39;endroit (s) sur la fin dans les marges du moule TMA aux endroits souhaités indiquées par le schéma d&#39;orientation des tissus. Au besoin, tenir la première place (s) debout avec des pinces jusqu&#39;à ce que la paraffine has solidifié assez que l&#39;endroit (s) ne tombe pas (1-2 min). </li><li> Assemblez les noyaux TMA selon les directives du fabricant et à l&#39;égard de l&#39;emplacement de la tache (s) dans les marges d&#39;un tableau (figure 2D), et suivre les protocoles de sectionnement et de coloration standard. NOTE: S&#39;il vous plaît voir l&#39;étape 2.6 pour voir les méthodes de sectionnement et de coloration utilisés dans ce protocole. </li></ol>

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Les auteurs ont rien à révéler.

Préparation réussie et l&#39;utilisation des taches nécessite le respect attentif à quelques étapes techniques. Fusion de l&#39;agarose d&#39;hydroxyéthyle doit se faire lentement et à basse température. Melting rapidement à haute température peut entraîner une certaine dégradation de la gélose pour moins de résultats optimaux. Lors de la coupe des bouchons de colorant chargées en morceaux destinés à la transformation, en sorte que l&#39;épaisseur de chaque pièce est supérieure à 4,5 mm et ne dépas...

La possibilité d&#39;intégrer des échantillons de tissus provenant de plusieurs individus dans un seul bloc de paraffine permet une comparaison facile side-by-side entre les traitements et les individus, élimine la variabilité entre les diapositives, et réduit le coût et la charge de travail de la coupe et coloration de spécimens. Ces blocs multi-tissus sont généralement produites soit comme matrices tissulaires (TMA) ou des blocs de paraffine contenant des tissus à partir de plusieurs individus dans une disposition non-tableau. Maintien de l&#39;identité de l&#39;échantillon est critique pour le succès de toute analyse multi-tissu. Les chercheurs ont été en utilisant TMA depuis leur développement pour améliorer l&#39;efficacité de l&#39;analyse, de réduire les variations entre les diapositives, de conserver les ressources de tissus précieux, et de réduire le temps et le coût des expériences 1. L&#39;orientation correcte des TMA peut être accompli en utilisant une variété de méthodes, y compris les espaces, lignes ou colonnes entre carottes de tissu 2-4, disposition asymétrique des groupes de base 3, 5 (par exemple, control vs traitement), &quot;balise&quot; noyaux 6, et de noyaux d&#39;orientation désignés situés à l&#39;extérieur de la matrice TMA 3. Bien que ces méthodes fonctionnent bien pour les TMA, la plupart consomment précieux espace noyau TMA et TMA avec les lacunes et les espaces comme des identificateurs peuvent devenir source de confusion comme noyaux de tissus sont épuisées au fil du temps. En outre, ces méthodes ne sont pas appropriées pour une utilisation dans des blocs multi-tissus sans un format de tableau car elles reposent sur des anomalies dans le modèle bien ordonnée de noyaux de microréseaux uniformes comme identifiants. La plupart des blocs multi-tissus non-revêtu doivent accueillir tissus non uniformes et, par définition, ne pas afficher la grille de tableau structuré qui rend ces aberrations jalonnent. Bien qu&#39;il existe de nombreux avantages à l&#39;aide d&#39;une TMA, un des plus grands inconvénients est la petite taille des noyaux qui ne sont pas toujours représentatives du tissu largement hétérogène 1. Blocs multi-tissus non RAID fournissent la plupart des til bénéficie d&#39;une TMA, mais contient des échantillons de tissus, grandes ou organes entiers provenant d&#39;études animales. microarrays de tissu en utilisant des conducteurs individuels ont différentes concordance avec des sections entières de tissus basés sur la protéine d&#39;intérêt et beaucoup nécessitera plusieurs cœurs pour accroître la concordance 7-11. En raison de la complexité et de la nature hétérogène de certains phénotypes de biomarqueurs, TMA utilise même un grand nombre de noyaux (&gt; 10) peut encore être insuffisante et peut nécessiter des méthodes autres que les puces à ADN pour l&#39;analyse 8. En outre, la construction TMA est consommatrice de temps, techniquement exigeante et nécessite le coût initial et l&#39;investissement ou l&#39;accès à un arrayer tissus. Blocs multi-tissus non RAID peuvent être effectués dans un laboratoire de base avec beaucoup moins de temps et d&#39;effort et est une alternative valable pour les études qui nécessitent plus de tissu que les tableaux permettent ou comme un moyen de réduire les coûts et de simplifier l&#39;analyse. blocs de non RAID multi-tissus exigent de même une ou fiableientation marqueur pour suivre l&#39;identification de l&#39;échantillon, cependant, le développement de ces marqueurs a été limitée. Une grande partie de la littérature décrivant l&#39;orientation de tissu met l&#39;accent sur ​​l&#39;orientation physiologique approprié pour l&#39;incorporation des morceaux de tissu, comme un tatouage le tissu avec de l&#39;encre 12, de pré-enrobage des tissus dans de la gélose-gélatine avant le traitement 13, et le marquage de certains tissus avec des encoches 14 ou des sutures 15 . Bien que fonctionnel, ces méthodes ne sont pas idéales comme marqueurs dans des blocs multi-tissus en raison de leurs limitations. Une suture sera sectionné par rapidement et peut ne pas être visible dans chaque section. Techniques utilisant l&#39;agar-gélatine peut maintenir le tissu dans une orientation correcte pendant le traitement et l&#39;incorporation de pré-enrobage, mais ne fournit pas une indication visuelle de la différence entre plusieurs échantillons dans le bloc de paraffine et diapositives. Encoches ou colorant sur le tissu peuvent compliquer l&#39;analyse ou obstruer détails morphologiques importantes. Alternativement, l&#39;identité de tissusdans un bloc non-revêtu multi-tissus peut être maintenue grâce à l&#39;enrobage des morceaux de tissu dans un arrangement asymétrique, mais cela nécessite 3 ou plusieurs morceaux de tissu et peut ne pas permettre une disposition optimale des tissus pour l&#39;analyse. Le spécimen Orientation Tag (spot) a été développé comme une méthode facile et peu coûteux d&#39;identifier clairement les tissus dans des blocs multi-tissus et offre de nombreux avantages par rapport aux méthodes d&#39;orientation existants. L&#39;endroit est un petit, coloré, noyau composé de Hydroxyéthyl gel de traitement agarose et le tissu teinture de marquage, et infiltré avec de la paraffine (figure 2C). Le noyau de Spot est intégré sur la fin prochaine d&#39;un tissu unique dans un bloc de paraffine multi-tissus et apparaît comme un point de couleur vive dans le bloc et dans chaque section (figure 1A - D), en indiquant clairement la bonne orientation du bloc et sections pour l&#39;identification de tissus facile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HistogelTM Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marking Dye</td>
			<td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TMD-5</td>
			<td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td>
			<td>Arraymold</td>
			<td>20015A</td>
			<td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

Blocs de paraffine multi-tissus fournissent une analyse à haut débit avec une efficacité accrue, l&#39;uniformité expérimental, et réduit le temps et le coût. microarrays de tissu forment la majorité des blocs de paraffine multi-tissus, mais de plus en plus, les chercheurs utilisent des blocs non-revêtu contenant de grandes tissus provenant de plusieurs individus qui peuvent fournir de nombreux avantages de matrices tissulaires sans investissement important dans la planification et de l&#39;équipement. Un élément essentiel d&#39;une analyse multi-tissulaire est la méthode d&#39;orientation permettant d&#39;identifier chaque individu tissu. Bien que les méthodes existent pour maintenir l&#39;orientation et l&#39;identification des tissus dans des blocs multi-tissus appropriée, la plupart ne sont pas bien adaptés à des blocs non-revêtu, peuvent consommer de l&#39;espace précieux dans un tableau et / ou sont difficiles à produire en laboratoire d&#39;histologie standard. Le spécimen Orientation Tag (spot) est un outil d&#39;orientation simple et peu coûteuse qui est clairement visible dans des blocs de paraffine et toutes les sections de tissus for l&#39;identification de l&#39;échantillon fiable dans les présentations disposés et non disposés. La tache présente des avantages par rapport aux méthodes existantes d&#39;orientation pour les blocs non-revêtu car il ne nécessite pas de modification directe au tissu et permet une certaine souplesse dans l&#39;arrangement des morceaux de tissu.

Le spot apparaît comme un tour, point de couleur vive dans le bloc de paraffine (Figure 1A et 2D), dans toutes les sections de paraffine, et reste sur la lame de verre à travers la procédure H &amp; E ou la coloration IHC (figures 1B - 1D et 2D). Cette évidentes aides de repère visuels deux l&#39;histotechnician et chercheur à identifier chaque pièce de tissu individuelle et simplifie la communication comme l&#39;histotechnician ...

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SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Le but de l&#39;échantillon Orientation Tag (spot) est de fonctionner comme un outil d&#39;orientation pour aider à l&#39;identification de tissus individu dans des blocs de paraffine multi-tissus. Ces protocoles démontrent comment il est construit à partir de matériaux facilement communes d&#39;histologie à faible coût et sert de repère visuel fiable dans des blocs de paraffine et des sections.

Repérer les tissus correcte à chaque fois dans les blocs multi-tissus

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

spot-the-correct-tissue-every-time-in-multi-tissue-blocks

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K vues.  Frederick National Laboratory for Cancer Research.  Le but de l'échantillon Orientation Tag (spot) est de fonctionner comme un outil d'orientation pour aider à l'identification de tissus individu dans des blocs de paraffine multi-tissus. Ces protocoles démontrent comment il est construit à partir de matériaux facilement communes d'histologie à faible coût et sert de repère visuel fiable dans des blocs de paraffine et des sections. 

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Co-actine sédimentation Assay; pour l&#39;analyse des Binding Protein à F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Recherche

Biologie

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Implantation de l&#39;ingénierie tissulaire dans le coeur de rat

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importance de la concentration de protéines correct pour Cinétique et Détermination d&#39;affinité en analyse structure-fonction

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analyse de l&#39;expression génique dans l&#39;agrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

La quantification de γH2AX Foci dans les échantillons de tissus

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse de microscopie du début de l&#39;embryogenèse dans les Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

Manipuler le murin Glande lacrymale

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Haute résolution Time-lapse d&#39;imagerie et d&#39;analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissection de l&#39;Auditory Bulla chez les souris postnatale: Isolation des os de l&#39;oreille moyenne et l&#39;analyse histologique

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear : Un tissu méthode de compensation pour l’imagerie en trois dimensions du tissu adipeux

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...