Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Brent Harris per la fornitura di revisione critica del manoscritto. Questi studi sono stati condotti presso il Lombardi Comprehensive Cancer Center istopatologia e Tissue risorsa comune che è supportato in parte dal NIH / NCI sovvenzione P30-CA051008. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della National Cancer Institute e il National Institutes of Health.

1. Costruzione di The Spot <ol><li> Aggiungere 50 mg di albumina sierica bovina (BSA) per 1 ml di tessuto tintura marcatura in un tubo da 15 ml o 2 ml provetta per microcentrifuga e vortex per 1 minuto o fino a completa dissoluzione. Nota: per questo protocollo, utilizzare biochimico BSA Grade. Mentre gli altri gradi e purezza non sono stati testati, si prevede che grado e la purezza non avrebbe un impatto significativo sul successo della località. </li><li> Calore 9 ml idrossietil gel di agarosio trasformazione in un tubo da 15 ml in un forno a microonde a potenza 30% per 10 sec incrementi finché il gel è completamente sciolto. </li><li> Combina la soluzione colorante-BSA gel elaborazione fuso e in un unico tubo da 15 ml e mescolare accuratamente con una pipetta. Vortex la soluzione. </li><li> Posizionare il tubo conico in frigorifero per un paio di ore o fino a solido. </li><li> Utilizzare una lunga, sottile, spatola metallica o sonda per rilasciare delicatamente il tappo di gel colorato dal tubo conico. </li><li> Utilizzare una lama di bisturi o di rasoio per cut il gel spina trasversalmente in 5 millimetri sezioni spesse. Rimuovere le estremità arrotondate e smaltire come rifiuto (Figura 2A). </li><li> Posizionare le sezioni spina gel appartamento in cassette istologia e tenere in etanolo al 70% per 1 ora. Cambiare la soluzione di etanolo al 70% ogni 2-4 ore per almeno 3 cambiamenti nel corso di un periodo di 24 ore. </li><li> Elaborare manualmente sezioni gel attraverso una serie di etanolo (1 ora ciascuno: 70% etanolo, 80% di etanolo, etanolo al 95%, 100% di etanolo (cambiamenti 3x), poi chiaro in compensazione soluzione 3x per 1 ora ciascuno (ad esempio, idrocarburi alifatici ( xileni sostituto)) sono stati utilizzati in questo protocollo, xileni sono anche accettabili), e si infiltrano con paraffina fusa (3x per 1 ora ciascuno), manualmente o in un processer tessuti. Nota: Prima di completa disidratazione in etanolo al 100%, il colorante può fuoriuscire dal tappo di gel che potrebbero influenzare altri tessuti ed i reagenti liquidi in un processatore automatico. In quanto tale, la reidratazione manuale è altamente raccomandato, il trattamento comunque automatizzati è equalleato efficace. </li><li> Più sezioni gel trasformati Incorpora con paraffina standard di incorporare metodologia (Figura 2B). Lasciare raffreddare i blocchi e indurire e poi a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzare un ago dermico pugno di dimensioni desiderate per rimuovere nuclei punto dalle sezioni gel incorporate fino a quando il blocco è esaurito (Figura 2C). Un blocco singolo può fornire fino a 20 x 2 mm 2 core. Conservare i nuclei in un luogo fresco. Utilizzare dermica pugno in questo protocollo vedono figure, da 1,5 mm (figure 1D e 2D) o 2 mm (figure 1B, 1C e 2C). </li></ol> 2. Utilizzando luoghi da blocchi Orient non schierati <ol><li> Creare un diagramma di orientamento tessuto per indicare le posizioni desiderate e le identità di tutti i singoli pezzi di tessuto devono essere integrate insieme, e la posizione del posto. NOTA: Il diagramma orientamento tessuto è una mappa illustrata che include la pposizioni hysical di tutti i pezzi di tessuto etichettati con identificatori e la posizione del posto. Può essere creato elettronica o può essere disegnato a mano. Lo schema dovrebbe essere creato utilizzando qualsiasi metodo si adatta meglio il tecnico e ricercatore di utilizzare il prodotto finale. Questa mappa servirà come guida per il ricercatore così i campioni possono essere facilmente identificati durante l&#39;analisi microscopica. La mappa utilizzata in questo protocollo è stato disegnato. Raffigura un blocco di tessuto e vetro microscopio con ogni pezzo di tessuto e del punto disegnato ed etichettati nella stessa posizione del blocco tessuto reale e scivolo. </li><li> Trattare i pezzi di tessuto normalmente, in modo che essi rimangano adeguatamente identificati durante le fasi di estrapolazione e di trasformazione. Per questo protocollo, elaborare i tessuti per 1 ora ciascuno in: 70% etanolo, 80% di etanolo, etanolo al 95%, 100% di etanolo (cambiamenti x3), idrocarburi alifatici (xileni sostitutivi) (cambiamenti x3), e fuso infiltrazione tissutale paraffina alla 60 ° C (modifiche x3). NOTA: All tessuti devono essere trattati secondo le procedure di laboratorio di istologia standard. Ciò può essere variabile a causa procedura di laboratorio individuale, dimensioni del tessuto e tipo, ma ciò non pregiudica la possibilità di utilizzare il posto come strumento di orientamento. </li><li> Disporre pezzi di tessuto sulla stazione embedding nelle posizioni assegnate corrette secondo lo schema orientamento tessuti. Utilizzare lo schema orientamento tessuti come riferimento per guidare il tecnico su come organizzare i pezzi Spot e del tessuto in ogni blocco. NOTA: In questo protocollo il tecnico inserisce l&#39;incorporamento a mano mappa di orientamento vicino alla stazione di incorporamento e disposti i pezzi di tessuto sulla stazione embedding esattamente la stessa disposizione come disegnato nel diagramma. Ciò garantisce che tutti i pezzi di tessuto rimangono correttamente identificabile nel prodotto finale. Questo è assolutamente fondamentale per il successo nell&#39;uso di blocchi multi-tessuto. </li><li> Assicurarsi che il nucleo punto è più alto di tutti i pezzi di tessuto per essere incorporati nel blocco. </li><li> Incorpora i pezzi di tessuto e poi il punto sulla fine (trasversale) nelle posizioni corrette in base allo schema orientamento tessuto utilizzando la metodologia incorporamento standard. Se necessario, tenere il punto (s) in posizione verticale con una pinza fino a quando la paraffina si è solidificata sufficiente che il punto (s) non sarà cadere (1-2 min). </li><li> Sezione e macchia paraffina sezioni con lo spot con metodologia standard. <ol><li> Lasciare le sezioni di galleggiare su un bagno di acqua a 40 ° C e di applicare un vetrino carica positiva (slides non caricate non sono stati testati). Essiccare i vetrini in forno a 60 ° C per almeno 20 min. </li><li> Porre i vetrini in un coloratore automatico e trattati attraverso i seguenti reagenti: xileni (xileni 1-5 min, xileni 2 e 3-2 minuti, ciascuno), il 100% di etanolo (2 min), il 95% di etanolo (1 min), 80 % di etanolo (30 sec), il 70% di etanolo (30 sec), acqua corrente del rubinetto (2 min), ematossilina (1,5 min), acqua corrente del rubinetto (3 min), alcol acida (1 minuto), acqua corrente del rubinetto (2 min ), blReattivo uing (1 minuto), acqua corrente (2 min), l&#39;80% di etanolo (30 sec), eosina (1 minuto), acqua corrente (10 sec), l&#39;80% di etanolo (1 min), il 100% di etanolo (3 cambi, 2 min ciascuno), xileni (3 cambi, 30 sec ciascuno). </li><li> Coprire i vetrini con vetrini, montati con mezzo di montaggio. NOTA: In questo protocollo, la histotechnician sezionato i blocchi di paraffina su un microtomo in 5 sezioni micron. Per questo protocollo abbiamo utilizzato un coloratore automatico, tuttavia uguali risultati possono essere ottenuti mediante colorazione manuale. </li></ol></li></ol> 3. posto nella TMA (Manuale Kit TMA) <ol><li> Creare un diagramma di orientamento dei tessuti, come previsto al punto 2.1 e assegnare la posizione desiderata (s) del posto. </li><li> Riempire lo stampo TMA con paraffina fusa in una stazione di incorporamento. Poiché lo stampo si raffredda, incorporare loco (s) sull&#39;estremità a margine dello stampo TMA nelle posizioni desiderate indicate dal diagramma orientamento tessuti. Se necessario, tenere il punto (s) in posizione verticale con una pinza fino al ettari di paraffinas solidificato sufficiente che il punto (s) non sarà cadere (1-2 min). </li><li> Montare i nuclei TMA secondo le istruzioni del produttore e per quanto riguarda la posizione dello spot (s) a margine di matrice (Figura 2D), e seguire i protocolli di sezionamento e di colorazione standard. NOTA: Si prega di vedere il punto 2.6 per vedere i sezionamento e colorazione metodi utilizzati in questo protocollo. </li></ol>

<ol>
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Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).</li><li>Jones, M., Calabresdi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-gelatin+for+embedding+tissues+prior+to+paraffin+processing.">Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing.</a> BioTechniques. 42, 569-570 (2007).</li><li>Carson, F., Hladik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histotechnology: A Self-Instructional Text. , (2009).</li><li>Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft&#8217;s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Preparazione di successo e l&#39;utilizzo dei luoghi richiede un&#39;attenta adesione ad alcuni passaggi tecnici. Fusione del agarosio idrossietil dovrebbe essere fatto lentamente ea fuoco basso. Melting rapidamente attraverso l&#39;alta temperatura può provocare un certo dettaglio della agarosio per risultati non ottimali. Quando si taglia le spine colorante carichi a pezzi per la lavorazione, assicurarsi che lo spessore di ciascun pezzo è superiore a 4,5 mm e non supera 7 mm. Le estremità arrotondate vengono rimoss...

La capacità di incorporare campioni di tessuto provenienti da più persone in un unico blocco di paraffina permette facile confronto side-by-side tra i trattamenti e gli individui, eliminando la variabilità tra le diapositive, e riduce i costi e il carico di lavoro di sezionamento e colorazione campioni. Questi blocchi multi-tessuti sono tipicamente prodotte sia come microarrays tissutali (TMA) o blocchi di paraffina contenenti tessuto da più individui in un layout non array. Manutenzione di identità del campione è fondamentale per il successo di qualsiasi analisi multi-tessuto. I ricercatori hanno utilizzato TMAs dal loro sviluppo per migliorare l&#39;efficienza di analisi, ridurre le variazioni tra le diapositive, conservare le risorse tessuti pregiati, e di ridurre i tempi ei costi di esperimenti 1. Il corretto orientamento della TMA può essere realizzato utilizzando una varietà di metodi, inclusi gli spazi, righe o colonne tra nuclei di tessuto 2-4, disposizione asimmetrica dei gruppi principali 3, 5 (per esempio, Control vs trattamento), &quot;beacon&quot; core 6, e core orientamento designati situati al di fuori della matrice TMA 3. Anche se questi metodi funzionano bene per TMA, più consumano spazio prezioso nucleo TMA e TMA con lacune e spazi come identificatori possono diventare fonte di confusione come nuclei di tessuto sono esauriti nel corso del tempo. Inoltre, questi metodi non sono appropriati per l&#39;uso in blocchi multi-tessuto senza un formato array perché si basano su anomalie del modello ben ordinato di core microarray uniformi come identificatori. La maggior parte dei blocchi non schierati multi-tessuto devono ospitare i tessuti non uniformi e, per definizione, non visualizzare la griglia matrice strutturata che rende queste aberrazioni spiccano come punti di riferimento. Anche se ci sono molti vantaggi di utilizzare un TMA, uno dei maggiori svantaggi è la piccola dimensione delle anime che non è sempre rappresentativa del tessuto ampiamente eterogenea 1. Blocchi multi-tessuto non schierati forniscono molte delle tegli beneficia di un TMA, ma contengono campioni di tessuto più grandi, o interi organi da studi su animali. Microarrays tessuto con singoli conduttori hanno diversi concordanza con intere sezioni di tessuto a base di proteina di interesse e molti richiedono core multipli per una maggiore concordanza 7-11. Data la complessità e la natura eterogenea di alcuni fenotipi di biomarker, TMA utilizza anche un gran numero di core (&gt; 10) può ancora essere insufficiente e può richiedere metodi diversi da microarray per l&#39;analisi 8. Inoltre, TMA costruzione è in termini di tempo, tecnicamente impegnativo, e richiede il costo iniziale e gli investimenti in o l&#39;accesso a un Arrayer tessuti. Blocchi multi-tessuto non in array possono essere fatte in qualsiasi laboratorio di base con molto meno tempo e fatica ed è una valida alternativa per gli studi che richiedono più il tessuto di array consentono o come mezzo per ridurre i costi e semplificare l&#39;analisi. Blocchi non in array multi-tessuto simile richiedono un affidabile oientation marcatore per monitorare l&#39;identificazione dei campioni, tuttavia, lo sviluppo di questi marcatori è stato limitato. Gran parte della documentazione che presenta orientamento tessuto concentra sul corretto orientamento fisiologico per l&#39;incorporamento pezzi di tessuto individuale, come il tatuaggio del tessuto con inchiostro 12, pre-embedding tessuti agar-gelatina prima della trasformazione 13, e la marcatura certi tessuti con tacche di 14 o 15 punti di sutura . Anche se funzionale, questi metodi non sono ideali come marcatori in blocchi multi-tessuto a causa delle loro limitazioni. Una sutura verrà sezionato attraverso rapidamente e può non essere visibile in ogni sezione. Tecniche che utilizzano agar-gelatina può mantenere il tessuto nel giusto orientamento durante la lavorazione e incorporamento pre-embedding, ma non fornisce un segnale visivo per distinguere tra più campioni nel blocco di paraffina e diapositive. Tacche o tintura sul tessuto possono complicare l&#39;analisi o occludere importanti dettagli morfologici. In alternativa, l&#39;identità del tessutoin un blocchetto di non schierati multi-tessuto può essere mantenuta attraverso l&#39;incasso di pezzi di tessuto in una disposizione asimmetrica, ma questo richiede 3 o più pezzi di tessuto e non può consentire disposizione ottimale dei tessuti per l&#39;analisi. L&#39;orientamento Tag Specimen (spot) è stato sviluppato come un metodo facile ed economico per identificare chiaramente i tessuti in blocchi multi-tessuto e offre molti vantaggi rispetto ai metodi di orientamento esistenti. Lo spot è un piccolo, colorato, nucleo composto da Idrossietil agarosio gel lavorazione e tessuti tintura marcatura, e infiltrati con paraffina (Figura 2C). Il nucleo punto è incorporato su fine accanto a un singolo tessuto in un blocco di paraffina multi-tessuto e appare come un punto colorato nel blocco e in ogni sezione (Figura 1A - D), indicando chiaramente il corretto orientamento del blocco e sezioni per l&#39;identificazione dei tessuti facile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HistogelTM Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marking Dye</td>
			<td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TMD-5</td>
			<td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td>
			<td>Arraymold</td>
			<td>20015A</td>
			<td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

Blocchetti di paraffina Multi-tessuti garantiscono elevata analisi produttività con una maggiore efficienza, l&#39;uniformità sperimentale, e riduzione dei tempi e dei costi. Microarrays tessuti costituiscono la maggior parte dei blocchi di paraffina multi-tessuto, ma sempre di più, i ricercatori stanno utilizzando blocchi non schierati contenenti grandi tessuti provenienti da più persone che possono fornire molti dei vantaggi di microarray di tessuti senza sostanziali investimenti nella progettazione e attrezzature. Un componente critico di qualsiasi analisi multi-tessuto è il metodo di orientamento utilizzato per identificare ciascun tessuto. Anche se i metodi esistono per mantenere il corretto orientamento e identificazione dei tessuti in blocchi più tessuti, la maggior parte non sono particolarmente adatti per i blocchi non schierati, può consumare spazio prezioso all&#39;interno di un array e / o sono difficili da produrre in laboratorio di istologia normale. L&#39;orientamento Tag Specimen (SPOT) è uno strumento semplice, a basso costo che l&#39;orientamento è chiaramente visibile in blocchi di paraffina e di tutte le sezioni di tessuto for identificazione del campione affidabile nei layout schierati e non schierati. Lo spot fornisce vantaggi rispetto ai metodi di orientamento esistenti per blocchi non disposte in quanto non richiede alcuna modifica diretta al tessuto e consente flessibilità nella disposizione dei pezzi di tessuto.

Lo spot appare come un giro, puntino dai colori vivaci nel blocco di paraffina (Figura 1A e 2D), in tutte le sezioni di paraffina, e rimane sul vetrino attraverso la procedura di H &amp; E o colorazione IHC (Figure 1B - 1D e 2D). Questo evidenti aiuti segnale visivo sia la histotechnician e ricercatore a identificare ogni pezzo di tessuto individuo e semplifica la comunicazione come il histotechnician possono utilizzare questo segnale v...

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SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Lo scopo della Orientamento Tag Specimen (spot) è la funzione di strumento di orientamento per aiutare nella identificazione dei tessuti dell&#39;individuo in blocchi di paraffina multi-tessuto. Questi protocolli dimostrano come è costruito facilmente da, a basso costo materiali comuni istologia e funge da indicatore visivo affidabile in blocchi di paraffina e sezioni.

SPOT Tissue corretto ogni volta in blocchi multi-tessuto

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

spot-the-correct-tissue-every-time-in-multi-tissue-blocks

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  Frederick National Laboratory for Cancer Research.  Lo scopo della Orientamento Tag Specimen (spot) è la funzione di strumento di orientamento per aiutare nella identificazione dei tessuti dell'individuo in blocchi di paraffina multi-tessuto. Questi protocolli dimostrano come è costruito facilmente da, a basso costo materiali comuni istologia e funge da indicatore visivo affidabile in blocchi di paraffina e sezioni. 

Video: SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Ricerca

Biologia

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

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Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analisi dell&#39;espressione genica in Borer Emerald Ash ( Agrilus planipennis) Utilizzando quantitativa Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

ΓH2AX quantificazione dei Foci, a campioni di tessuto

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

Manipolare il murino Ghiandola lacrimale

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Analisi Specificità di proteine ​​lisina metiltransferasi Utilizzando SPOT Peptide Array

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

La dissezione del Auditory Bulla nei topi postnatale: Isolamento delle ossa dell&#39;orecchio medio e l&#39;analisi istologica

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Methods Article

SPOT Tissue corretto ogni volta in blocchi multi-tessuto