עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01HL056046 ל PAL ו K99HL116769 כדי AJT), ואת המכון לחקר ב- Nationwide בית החולים לילדים (ל PAL ו AJT).

משפט ואתיקה: מחקר זה נערך בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות, והיא אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסד ועדת שימוש ב- Nationwide בית החולים לילדים. 1. הכנה / גדר הערה: טכניקת בידוד זה דורש שני סלילי חימום Langendorff ממוצבת Side-by-side על דוכן טבעת, ומחוברת במקביל באמבט מים במחזור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל במחזור אמבט מים ולהתאים טמפרטורה כדי להשיג טמפרטורה סופית של 33-34 מעלות צלזיוס ב קצה צינורית Langendorff (באמבט המים המשמש זה להגדיר מוגדר 40 ° C עקב אובדן C 6-7 ° ב הטמפרטורה על פני צינורות). הפעל המשאבות זלוף ולהגדיר שיעור זלוף 0.5 מ&quot;ל / דקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו שני סלילי חימום במקטורן מים, צינורות מחוברים ו -25 צינורית מד ידי שטיפה כל אחד עם 50 מ&quot;ל של אתנול 70%, ואחריו 100 מ&quot;ל מים ultrapure autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את סלילי החימוםעל ידי דחיפת אוויר עם מזרק ולשטוף עם 10 מ&quot;ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) ללא פנול אדום. השאר HBSS ב סליל חימום הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק luer נעילת סטרילי 10 מ&quot;ל מלא HBSS בטמפרטורת החדר ללא פנול אדום אל צינורות. ודא כי אין בועות אוויר לכודות בתוך סלילי צינורות וחימום בעת צירוף המזרק HBSS המלא שכן הדבר עלול לגרום תסחיפי אוויר במהלך העיכול להשפיע על בידוד VSMC שלילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורית 25 מד מן סלילי חימום ומניחים על עוד מזרק 10 מ&quot;ל סטרילי מלא HBSS קר כקרח ללא פנול אדום. שמור את זה על הקרח עד מוכן לשימוש. חזור על פעולה עבור הצינורית האחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון עיכול אנזימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול סוג collagenase 2 על פי מספר פריט ספציפי עבור 75 מ&quot;ל של פתרון העיכול כדי להשיג ריכוז סופי של 300 יחידות / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים collagenase ב 75 מ&quot;ל של HBSS עם פנול אדום. לאחר מכן, להוסיף 1.5 מ&quot;ל של 0.1 מ&quot;ג / מעכב טריפסין סויה מ&quot;ל ו -75 μl של 1 M CaCl 2 לתערובת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות פתרון העיכול מיד, לחמם אותו על 37 מעלות צלזיוס. אם לא, למקם אותו על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 שעות. פתרון זה חייב להיעשות טרי מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן התקשורת להפסיק פתרון / ציפוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 מ&quot;ל חום מומת FBS, 5 מ&quot;ל של L- גלוטמין, 5 מ&quot;ל של חומצות אמינו לא חיוניות, 5 מ&quot;ל של HEPES, ו 1 מ&quot;ל של primocin 500 מ&quot;ל של גלוקוז גבוהה (4.5 גר &#39;/ ל&#39;) DMEM. עיקור סנן מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 6 מ&quot;ל של פתרון להפסיק לתוך כל אחד עשר צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל, ממוספרים A1-A6 ו- B1-B6, ומקום ב 4 ° C.. Aliquot 50 מ&quot;ל של תמיסת להפסיק לתוך חרוטי ומקום 50 מ&quot;ל ב 37 ° C חממה. הערה: שלב זה יכול גם להיות מוכן היום לפני הבידוד במידת הצורך. להפסיק פתרון זה ישמש תקשורת הציפוי הבאה בידוד תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני 1 מ&quot;ל מזרקים מצויד במחט 30 Gעם 100 μl של הפרין (1,000 יחידות / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חתיכה 5 ס&quot;מ של 5-0 משי כירורגית. לקשור קשר בוהן רופף משי כירורגית עם קצה אחד פעמיים כל עוד אחרים. מניחים על צינורית 25-מד, אבל לא להדק. חזור על הפעולה עבור צינורית 25 G אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו ארבע 35 מ&quot;מ צלחות פטרי סטרילי (# 1-4) עם 2 מ&quot;ל של אדום סטרילי, קר כקרח, HBSS ללא פנול. שמור על הקרח. </li></ol> 2. המתת חסד, בידוד לב Cannulation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני בידוד לב, להבטיח כי פתרון העיכול 50 מיליליטר החרוטים של להפסיק פתרון חמימים. הסר את המזרק HBSS מלא עם 25 מחוברים צינורית G מן הקרח ומניחים מהדק ביורטה (או מהדק טבעת מעמד) על דוכן טבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים באמצעות 3% isofluorane. אשר את העכבר הוא מורדם על ידי מגע אצבע על כל גפיים אחוריים. אם עוויתות הרגל, העכבר עדיין לא הרדים אז תחכה 1 דקות וחזור על קשר הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את וריד הצוואר על ידי הסרת הפרווהעור nd על הקדמי של הצוואר במספריים. לאחר מכן, להשתמש במלקחיים כדי להסיר כל שומן סביב וריד הצוואר בזהירות. לאחר הסרת שומן, להזריק לאט 100 μl של הפרין (1,000 יחידות / מ&quot;ל). מניחים ספוג כירורגית על הווריד כדי למנוע דימום יתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 דקות, חזה פתוח לחשוף לב, לב טרמפ עם מלקחיים מעוקלים להעיף אותו באמצעות מספריים, והקפד לשמור האאורטה עולה שלם באמצעות סניף brachiocephalic הראשון. מיד למקום הלב לתוך צלחת 35 מ&quot;מ (# 1) עם HBSS קר כקרח ללא פנול אדום ולשטוף. הערה: בצע את 4 השלבים הבאים באמצעות היקף ניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את צינורית 25 G כי הוא רכוב על הטבעת לעמוד בזווית של 45 מעלות, כך הקצה ממוקם רק מתחת לפני השטח של HBSS קר כקרח בצלחת # 2 והוא נראה בבירור מבעד למיקרוסקופ לנתח. מעבירים את הלב בצלחת # 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים דומון, לחשוף את אבי העורקים על ידי הסרת שומן עודף בעדינות באמצעות לנתיחה בוטה pניקוב או קריעה יימנע של אב העורקים. לאחר מכן, להשתמש במלקחיים כדי להחליק את אבי העורקים מעל 25 צינורית G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להנחות את הצינורית כלפי מטה דרך אבי העורקים, קרוב, אבל לא מעבר שסתום אבי העורקים, אשר תפגענה שלמות שסתום ולכן, זלוף מדרדר. לאחר הקנייה היא במקום, חלק את המשי מראש קשור על אב העורקים, והדק. לקשור קשר שני כדי ליצור קשר מרובע סביב האאורטה כדי לאבטח את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר האאורטה קשורה באופן מאובטח, בעדינות ולשטוף את הדם שנותר מהמחזור כלילית עם HBSS קר כקרח בתוך המזרק המצורף 25 צינורית G. תשמור על עצמך כדי לא לדחוף יותר מדי כדי למנוע לחץ כלילית מוגזם. רק סומק איטי ועדין מאוד נדרש כדי להשלים את הרצף. דליפה ללא cannulation אבי העורקים יכול להיות גם ציין במהלך סומק עדין זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה זלוף כדי להתחיל בתהליך של HBSS. הסר את צינורית 25 G (עם הלב המצורף) מן המזרק HBSS המלא, מקפידלשמור על רכזת הצינורית מלאה HBSS, ולחבר אותו סלילי חימום HBSS המלאים החמים. בגין זלוף של הלב עם המשאבה זלוף בשיעור של 0.5 מ&quot;ל / דקה במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הלב הראשון הוא cannulated והוא להיות perfused על המערכת, יש לחזור על שלבי 2.1-2.8 עבור הלב השני. בידודים אלה יהיו מפוצלים עבור כל לב ולכן תכנון ותזמון זהירים נדרשים. </li></ol> עיכול 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה עם HBSS, לשנות את מזרק 10 מ&quot;ל HBSS כרגע על המשאבה לאחת מלא 10 מ&quot;ל של פתרון העיכול מחומם מראש. Perfuse כל הלב עם פתרון העיכול במשך 12 דקות בקצב של 0.5 מ&quot;ל / דקה. אל תאסוף שברים הנובעים העיכול הראשון כאשר זה יכיל שום דם שריד ותאי האנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 12 דקות, לשנות את שיעור זלוף 0.4 מ&quot;ל / דקה, להציב חרוטי 15 מ&quot;ל (שפופרת A1 או B1, התואם את הלב הראשון או השני עבור כל מערכת העיכול) מלא solut להפסיק קריון לתוך דלי קרח מתחת ללב כדי להתחיל אוסף perfusate מועשר VSMC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15 דקות, לשנות את חרוטי אוסף A2 צינור או B2 ו- A1 צינור ספין חרוטים ו- B1 89 XG במשך 10 דקות מייד לאחר האיסוף של שני השברים. כאשר המזרק מלא עם פתרון העיכול על המשאבה יש פחות מ 1 מיליליטר של תמיסה, להחליף עם מזרק טרי מלא 10 מיליליטר של פתרון עיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant מהצינור כל אוסף, עוזב כ 0.5 מ&quot;ל. Resuspend גלולה מן A1 עם 2 מ&quot;ל של תמיסת להפסיק חם (או מדיה ציפוי). להוסיף resuspension מהצינור A1 צינור B1 ו- צינור מקום 37 ° C חממה עם כובע רופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.3 ו 3.4 עד שכל הצינורות (דרך A6 ו- B6) משמש במשך זמן סך גבייה של 90 דק &#39;. ב 80 דקות של עיכול, לחתוך את קודקוד הלב כדי לשטוף את כל תאים עלולים להילכד בתוך החדר ולאסוף תאים אלה בצינור A6 ו- B6, respectively. הערה: לפעמים בלב ייפול הצינורית טרם מועד הזמן 90 הדק &#39;. במקרה כזה, לאחזר את הלב והמקום לתוך צלחת סטרילי 35 מ&quot;מ פטרי מלא 2 מיליליטר של פתרון עיכול. חותכים את הקודקוד של הלב בעדינות ולשטוף את הלב עם פתרון העיכול. לאחר מכן, לסנן את 2 מ&quot;ל של פתרון העיכול דרך מסננת 100 מיקרומטר תא סטרילי לתוך חרוטי 50 מ&quot;ל ולהוסיף צינור A6 או B6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל סיבוב של צינורות עוקבים (A2 ו- B2), מוסיף את VSMCs מושעה אל צינור האיסוף הקודם (בשילוב A1 ו- B1). כמו כן, לדאוג לא לתת את פתרון העיכול במשאבה נגמר ולעבור 10 מ&quot;ל המזרקים לפי הצורך ברחבי העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל הצינורות משולבים, בצנטריפוגה השעית VSMC העשירי ב 89 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב כמה שיותר supernatant משפופרות אוספות ככל האפשר. Resuspend הגלולה שנותר 2 מיליליטר של ציפוי תקשורת צלחת על צלחת תרבות אחת 35 מ&quot;מ. אני צלחת תרבות מקוםn 37 ° C בחממה במשך 24 שעות. </li></ol> 4. תרבית תאים הערה: השלם את השלבים הנותרים בארון הבטיחות הביולוגי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לשאוב את תקשורת הציפוי בעדינות. התרבות תהיה בדרך כלל יש כמות גדולה של פסולת. כדי לשטוף את התאים, להוסיף 2 מ&quot;ל של חם, PBS סטרילי לטפוח בעדינות את המנה כנגד שתי אצבעות תוך כדי סיבוב בכיוון סיבוב השעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי סיבוב של 360 מעלות, לשאוב PBS ו חוזר בשנית. לשאוב PBS ולהוסיף 2 מ&quot;ל אחר של PBS סטרילי, חם. בדוק את מנת התרבות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שיש לא מעט על מנת פסולת על הצלחת. מפגש Cell ניתן לקבוע גם בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם פסולת נשארת בצלחת התרבות, חזור על שלב 4.2. אם מנת התרבות היא ברורה של פסולת, לשאוב PBS ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת ציפוי החמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים שוב עם חם, PBS סטרילי כדי להסיר כל פסולת סופית או תאים מתים מן התרבות. לשאוב PBS ו- pלשרוך עוד 2 מיליליטר של תקשורת ציפוי החמה על התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק על התאים בכל יום ולהאכיל כל 48 שעות עם תקשורת ציפוי חממה טריה. בשלב זה, תאים יכולים לשמש מבחני תרבית תאים סטנדרטיים. VSMCs צריך להיות כ -80% ומחוברות 4-5 ימים לאחר הציפוי, למרות עשוי להימשך עד 7 ימים עד ההליך מושלם. אם פיצול לפסוקים הבאים, להשתמש לכל היותר 1: 4 35 מנות מ&quot;מ (או לאזור מקביל תרבות מנות). </li></ol>

<ol>
	<li>Katz, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arterioles+in+type+2+diabetic+(db/db)+mice+undergo+a+distinct+pattern+of+remodeling+associated+with+decreased+vessel+stiffness.">Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness.</a> Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).</li><li>Husarek, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiotensin+receptor+blocker+losartan+reduces+coronary+arteriole+remodeling+in+type+2+diabetic+mice.">The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice.</a> Vascul Pharmacol. , (2015).</li><li>Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coronary+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+A1+adenosine+receptor-knockout+mice.">Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).</li><li>Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+attenuates+contraction+of+primary+cultured+rat+airway+smooth+muscle+cells.">Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+two-phase+Ca2++release+and+apoptosis+controlled+by+TRP-ML1+channel+activity+in+coronary+arterial+myocytes.">Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).</li><li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+differentiation+in+development+and+disease.">Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease.</a> Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).</li><li>Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SM22+alpha,+a+marker+of+adult+smooth+muscle,+is+expressed+in+multiple+myogenic+lineages+during+embryogenesis.">SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis.</a> Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).</li><li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro:+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts.">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li><li>Fisher, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+phenotypic+diversity+and+function.">Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function.</a> Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+phenotype+and+function+of+vascular+smooth+muscle+cells.">Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells.</a> J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).</li><li>Souza-Smith, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenteric+resistance+arteries+in+type+2+diabetic+db/db+mice+undergo+outward+remodeling.">Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling.</a> PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).</li><li>Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+of+coronary+arteries+in+36+species+of+mammalian+from+mouse+to+giraffe.">Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe.</a> Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה להסתגל פרוטוקולי בידוד תא קיימים כדי להגדיל את התשואה של כלילית כלי דם החלקה מלבבות בעכברים. רוב העבודה החלוצית בביולוגיה השריר החלק בכלי הדם בוצע עם תאי שריר חלק אבי העורקים חולדה תרבותי. מחקרים אלה סיפקו את הידע הבסיסי של המנגנונים המולקולר...

המטרה של שיטה זו היא לבודד תאי שריר חלק בכלי דם (VSMCs) מהמחזור כלילית murine לשימוש תרבית תאי מבחני תרבית תאים סטנדרטיים. פתחנו בטכניקה זו כדי להעריך את המנגנונים המולקולריים של שיפוץ כלי דם בחולי סוכרת. דיווחנו בעבר פנימה שיפוץ היפרטרופית ב arterioles כלילית במחיצה במודל העכבר db / db של סוכרת 1. בשל הכמות של רקמה המוגבלת נמצאת התקפי הלב בעכברים במחיצה, ניסיוני בטכניקות תקן חוקר שינויי חלבון (כתם מערבי למשל) בעכברי db / db ובקרה קשות במקרה הטוב. בנוסף, אנו בעבר הראו כי וחסמי רצפטור לאנגיוטנסין (ARB) לוסרטן מפחית את שיפוץ נצפתה בעכברים db / db 2. לכן, בידוד של VSMCs העיקרי מהמחזור הכליליים מאפשר לנו לבדוק את העניין לעומק שינויים פנוטיפ VSMC או איתות מופעל מסלולים בעכברים סוכרתיים, אשר עשוי להיות contribuטינג שיפוץ עורקיק כלילי לוואי. מחקרים רבים הובהרו מסלולי איתות הקנונית באמצעות VSMCs מבודד האאורטה מכרסם, ולא כל מיטת כלי דם ספציפית. עם זאת, יש לנו הפגינו וסקולרית-מיטה שיפוץ ספציפיים כלילית, אבי העורקים, ו תפוצה mesenteric של עכברים db / db 1, דבר המצביע על VSMCs בכל מיטה כלי הדם עשויה להיות שונה. לכן, יש צורך לבודד VSMCs מכל מיטת כלי דם כדי להיטיב להבין את השינויים הפתולוגיים המתרחשים בכל סט של VSMCs. יש שפע של שיטות שונות עבור בידוד culturing VSMCs אבי העורקים. עם זאת, כיום, יש רק מחקר אחד שפורסם על הבידוד של VSMCs מהעכבר כלילית במחזור 3. טנג et al. היה הראשון לדווח על שיטה לבידוד VSMCs ממחזור העכבר כלילית; עם זאת, יש לנו תוקנו בפרוטוקול באופן משמעותי כפי שהם גם מבודדים cel אנדותלls. מעבדות אחרות גם השתמשו בפרוטוקול מ טנג et al. לבודד מיוציטים עורקים כלילית ותאי שריר חלק בדרכי הנשימה 4,5. השינויים שאנו נשלב יניבו אוכלוסיית התאים מועשרים עבור VSMCs מהמחזור כלילית. זלוף המדרדר של לב היונק המבודד, או טכניקת Langendorff, הוקם בשנת 1897 על ידי 6 אוסקר Langendorff ועדיין משמש היום נרחב עבור הבידוד של תאים וכלי דם. הטכניקה המוצגת כאן, יחד עם התקדמות שינויים גנטיים בעכברים מודרניים, מספקת כלי רב ערך לחקירה מדוקדקת יותר של ההתנהגות המולקולרית של VSMCs מהמחזור כלילית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">HEPES 1M solution</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">MT-25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primocin - 20mL</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM NEAA 10 mM 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glut 200 mM - Gibco</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-516-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type-2&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soybean Trypsin Inhibitor 25mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14170-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">11 plus pump</td>
			<td style="width:143px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">70-2208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Circulating heated water pump</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any brand will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

בעוד הבידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם (VSMCs) מכלי גדול היא מבוססת היטב, חפשנו לבודד ותרבות VSMCs מהמחזור כלילית. לבבות עם קשתות אבי העורקים ללא פגע הוסרו perfused דרך Langendorff מדרדר עם פתרון העיכול המכיל 300 יחידות / מ&quot;ל של סוג collagenase II, 0.1 מ&quot;ג / מעכב טריפסין סויה מ&quot;ל ו 1 M CaCl 2. Perfusates נאספו 15 מרווחי דקה במשך 90 דקות, pelleted ידי צנטריפוגה, resuspended בתקשורת ציפוי, מצופה על מנות בתרבית רקמה. VSMCs התאפיינו בנוכחות SM22α, α-SMA, ו vimentin. אחד היתרונות העיקריים של שימוש בטכניקה זו היא היכולת לבודד VSMCs מהמחזור כלילית של עכברים. למרות שמספר הקטנים של תאים המתקבלים יכול להגביל כמה בקשות אשר התאים יכולים להיות מנוצלים, VSMCs כלילית המבודדת ניתן להשתמש במגוון של טכניקות תרבית תא ומבוססות אסאys. מחקרים החוקרים VSMCs מעכברים מהונדסים גנטי יכולים לספק מידע נוסף אודות פונקציה-מבנה ותהליכי איתות הקשורים פתולוגיות וסקולרית.

בשל ההיבט החדשני טכניקת בידוד VSMC כלילית שלנו, אנחנו בקשנו לקבוע את הטוהר של בידוד התא. עכבר הכליליים VSMCs זוהו מבוסס על מכתים המורפולוגיה immunofluorescence שלהם עד חלוף 2. בהתבסס על המורפולוגיה של התאים בתרבית לאחר הכביסה הראשונה, הליך הבידוד מסיר מיוציטים מה...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells at JoVE.com

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את טכניקות בידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם בעכברים עיקריים (VSMCs) מהמחזור כלילית. לאחר VSMCs בודד, הם יכולים לשמש עבור טכניקות תרבות סטנדרטיות רבות.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

isolation-of-murine-coronary-vascular-smooth-muscle-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  The Ohio State University College of Medicine.  מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את טכניקות בידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם בעכברים עיקריים (VSMCs) מהמחזור כלילית. לאחר VSMCs בודד, הם יכולים לשמש עבור טכניקות תרבות סטנדרטיות רבות. 

Video: Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

בידוד של האדם עורקי טבורי תאים שרירים חלקים (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

בידוד והתמיינות של תאי כלי דם לתאי סטרומה בז&#39;ים / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Murine אבי העורקים למחוץ פגיעה: יעיל<em&gt; בויבו</em&gt; מודל של תאים שרירים חלקה תפוצת ו אנדותל פונקציה

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מיקוד Ca^{2 +} איתור חלוף של שריר חלק