עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01HL056046 ל PAL ו K99HL116769 כדי AJT), ואת המכון לחקר ב- Nationwide בית החולים לילדים (ל PAL ו AJT).

משפט ואתיקה: מחקר זה נערך בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות, והיא אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסד ועדת שימוש ב- Nationwide בית החולים לילדים. 1. הכנה / גדר הערה: טכניקת בידוד זה דורש שני סלילי חימום Langendorff ממוצבת Side-by-side על דוכן טבעת, ומחוברת במקביל באמבט מים במחזור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל במחזור אמבט מים ולהתאים טמפרטורה כדי להשיג טמפרטורה סופית של 33-34 מעלות צלזיוס ב קצה צינורית Langendorff (באמבט המים המשמש זה להגדיר מוגדר 40 ° C עקב אובדן C 6-7 ° ב הטמפרטורה על פני צינורות). הפעל המשאבות זלוף ולהגדיר שיעור זלוף 0.5 מ&quot;ל / דקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו שני סלילי חימום במקטורן מים, צינורות מחוברים ו -25 צינורית מד ידי שטיפה כל אחד עם 50 מ&quot;ל של אתנול 70%, ואחריו 100 מ&quot;ל מים ultrapure autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את סלילי החימוםעל ידי דחיפת אוויר עם מזרק ולשטוף עם 10 מ&quot;ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) ללא פנול אדום. השאר HBSS ב סליל חימום הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק luer נעילת סטרילי 10 מ&quot;ל מלא HBSS בטמפרטורת החדר ללא פנול אדום אל צינורות. ודא כי אין בועות אוויר לכודות בתוך סלילי צינורות וחימום בעת צירוף המזרק HBSS המלא שכן הדבר עלול לגרום תסחיפי אוויר במהלך העיכול להשפיע על בידוד VSMC שלילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורית 25 מד מן סלילי חימום ומניחים על עוד מזרק 10 מ&quot;ל סטרילי מלא HBSS קר כקרח ללא פנול אדום. שמור את זה על הקרח עד מוכן לשימוש. חזור על פעולה עבור הצינורית האחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון עיכול אנזימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול סוג collagenase 2 על פי מספר פריט ספציפי עבור 75 מ&quot;ל של פתרון העיכול כדי להשיג ריכוז סופי של 300 יחידות / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים collagenase ב 75 מ&quot;ל של HBSS עם פנול אדום. לאחר מכן, להוסיף 1.5 מ&quot;ל של 0.1 מ&quot;ג / מעכב טריפסין סויה מ&quot;ל ו -75 μl של 1 M CaCl 2 לתערובת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות פתרון העיכול מיד, לחמם אותו על 37 מעלות צלזיוס. אם לא, למקם אותו על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 שעות. פתרון זה חייב להיעשות טרי מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן התקשורת להפסיק פתרון / ציפוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 מ&quot;ל חום מומת FBS, 5 מ&quot;ל של L- גלוטמין, 5 מ&quot;ל של חומצות אמינו לא חיוניות, 5 מ&quot;ל של HEPES, ו 1 מ&quot;ל של primocin 500 מ&quot;ל של גלוקוז גבוהה (4.5 גר &#39;/ ל&#39;) DMEM. עיקור סנן מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 6 מ&quot;ל של פתרון להפסיק לתוך כל אחד עשר צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל, ממוספרים A1-A6 ו- B1-B6, ומקום ב 4 ° C.. Aliquot 50 מ&quot;ל של תמיסת להפסיק לתוך חרוטי ומקום 50 מ&quot;ל ב 37 ° C חממה. הערה: שלב זה יכול גם להיות מוכן היום לפני הבידוד במידת הצורך. להפסיק פתרון זה ישמש תקשורת הציפוי הבאה בידוד תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני 1 מ&quot;ל מזרקים מצויד במחט 30 Gעם 100 μl של הפרין (1,000 יחידות / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים חתיכה 5 ס&quot;מ של 5-0 משי כירורגית. לקשור קשר בוהן רופף משי כירורגית עם קצה אחד פעמיים כל עוד אחרים. מניחים על צינורית 25-מד, אבל לא להדק. חזור על הפעולה עבור צינורית 25 G אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו ארבע 35 מ&quot;מ צלחות פטרי סטרילי (# 1-4) עם 2 מ&quot;ל של אדום סטרילי, קר כקרח, HBSS ללא פנול. שמור על הקרח. </li></ol> 2. המתת חסד, בידוד לב Cannulation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני בידוד לב, להבטיח כי פתרון העיכול 50 מיליליטר החרוטים של להפסיק פתרון חמימים. הסר את המזרק HBSS מלא עם 25 מחוברים צינורית G מן הקרח ומניחים מהדק ביורטה (או מהדק טבעת מעמד) על דוכן טבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים באמצעות 3% isofluorane. אשר את העכבר הוא מורדם על ידי מגע אצבע על כל גפיים אחוריים. אם עוויתות הרגל, העכבר עדיין לא הרדים אז תחכה 1 דקות וחזור על קשר הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את וריד הצוואר על ידי הסרת הפרווהעור nd על הקדמי של הצוואר במספריים. לאחר מכן, להשתמש במלקחיים כדי להסיר כל שומן סביב וריד הצוואר בזהירות. לאחר הסרת שומן, להזריק לאט 100 μl של הפרין (1,000 יחידות / מ&quot;ל). מניחים ספוג כירורגית על הווריד כדי למנוע דימום יתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 דקות, חזה פתוח לחשוף לב, לב טרמפ עם מלקחיים מעוקלים להעיף אותו באמצעות מספריים, והקפד לשמור האאורטה עולה שלם באמצעות סניף brachiocephalic הראשון. מיד למקום הלב לתוך צלחת 35 מ&quot;מ (# 1) עם HBSS קר כקרח ללא פנול אדום ולשטוף. הערה: בצע את 4 השלבים הבאים באמצעות היקף ניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את צינורית 25 G כי הוא רכוב על הטבעת לעמוד בזווית של 45 מעלות, כך הקצה ממוקם רק מתחת לפני השטח של HBSS קר כקרח בצלחת # 2 והוא נראה בבירור מבעד למיקרוסקופ לנתח. מעבירים את הלב בצלחת # 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים דומון, לחשוף את אבי העורקים על ידי הסרת שומן עודף בעדינות באמצעות לנתיחה בוטה pניקוב או קריעה יימנע של אב העורקים. לאחר מכן, להשתמש במלקחיים כדי להחליק את אבי העורקים מעל 25 צינורית G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להנחות את הצינורית כלפי מטה דרך אבי העורקים, קרוב, אבל לא מעבר שסתום אבי העורקים, אשר תפגענה שלמות שסתום ולכן, זלוף מדרדר. לאחר הקנייה היא במקום, חלק את המשי מראש קשור על אב העורקים, והדק. לקשור קשר שני כדי ליצור קשר מרובע סביב האאורטה כדי לאבטח את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר האאורטה קשורה באופן מאובטח, בעדינות ולשטוף את הדם שנותר מהמחזור כלילית עם HBSS קר כקרח בתוך המזרק המצורף 25 צינורית G. תשמור על עצמך כדי לא לדחוף יותר מדי כדי למנוע לחץ כלילית מוגזם. רק סומק איטי ועדין מאוד נדרש כדי להשלים את הרצף. דליפה ללא cannulation אבי העורקים יכול להיות גם ציין במהלך סומק עדין זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה זלוף כדי להתחיל בתהליך של HBSS. הסר את צינורית 25 G (עם הלב המצורף) מן המזרק HBSS המלא, מקפידלשמור על רכזת הצינורית מלאה HBSS, ולחבר אותו סלילי חימום HBSS המלאים החמים. בגין זלוף של הלב עם המשאבה זלוף בשיעור של 0.5 מ&quot;ל / דקה במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הלב הראשון הוא cannulated והוא להיות perfused על המערכת, יש לחזור על שלבי 2.1-2.8 עבור הלב השני. בידודים אלה יהיו מפוצלים עבור כל לב ולכן תכנון ותזמון זהירים נדרשים. </li></ol> עיכול 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה עם HBSS, לשנות את מזרק 10 מ&quot;ל HBSS כרגע על המשאבה לאחת מלא 10 מ&quot;ל של פתרון העיכול מחומם מראש. Perfuse כל הלב עם פתרון העיכול במשך 12 דקות בקצב של 0.5 מ&quot;ל / דקה. אל תאסוף שברים הנובעים העיכול הראשון כאשר זה יכיל שום דם שריד ותאי האנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 12 דקות, לשנות את שיעור זלוף 0.4 מ&quot;ל / דקה, להציב חרוטי 15 מ&quot;ל (שפופרת A1 או B1, התואם את הלב הראשון או השני עבור כל מערכת העיכול) מלא solut להפסיק קריון לתוך דלי קרח מתחת ללב כדי להתחיל אוסף perfusate מועשר VSMC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15 דקות, לשנות את חרוטי אוסף A2 צינור או B2 ו- A1 צינור ספין חרוטים ו- B1 89 XG במשך 10 דקות מייד לאחר האיסוף של שני השברים. כאשר המזרק מלא עם פתרון העיכול על המשאבה יש פחות מ 1 מיליליטר של תמיסה, להחליף עם מזרק טרי מלא 10 מיליליטר של פתרון עיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant מהצינור כל אוסף, עוזב כ 0.5 מ&quot;ל. Resuspend גלולה מן A1 עם 2 מ&quot;ל של תמיסת להפסיק חם (או מדיה ציפוי). להוסיף resuspension מהצינור A1 צינור B1 ו- צינור מקום 37 ° C חממה עם כובע רופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.3 ו 3.4 עד שכל הצינורות (דרך A6 ו- B6) משמש במשך זמן סך גבייה של 90 דק &#39;. ב 80 דקות של עיכול, לחתוך את קודקוד הלב כדי לשטוף את כל תאים עלולים להילכד בתוך החדר ולאסוף תאים אלה בצינור A6 ו- B6, respectively. הערה: לפעמים בלב ייפול הצינורית טרם מועד הזמן 90 הדק &#39;. במקרה כזה, לאחזר את הלב והמקום לתוך צלחת סטרילי 35 מ&quot;מ פטרי מלא 2 מיליליטר של פתרון עיכול. חותכים את הקודקוד של הלב בעדינות ולשטוף את הלב עם פתרון העיכול. לאחר מכן, לסנן את 2 מ&quot;ל של פתרון העיכול דרך מסננת 100 מיקרומטר תא סטרילי לתוך חרוטי 50 מ&quot;ל ולהוסיף צינור A6 או B6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל סיבוב של צינורות עוקבים (A2 ו- B2), מוסיף את VSMCs מושעה אל צינור האיסוף הקודם (בשילוב A1 ו- B1). כמו כן, לדאוג לא לתת את פתרון העיכול במשאבה נגמר ולעבור 10 מ&quot;ל המזרקים לפי הצורך ברחבי העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל הצינורות משולבים, בצנטריפוגה השעית VSMC העשירי ב 89 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב כמה שיותר supernatant משפופרות אוספות ככל האפשר. Resuspend הגלולה שנותר 2 מיליליטר של ציפוי תקשורת צלחת על צלחת תרבות אחת 35 מ&quot;מ. אני צלחת תרבות מקוםn 37 ° C בחממה במשך 24 שעות. </li></ol> 4. תרבית תאים הערה: השלם את השלבים הנותרים בארון הבטיחות הביולוגי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לשאוב את תקשורת הציפוי בעדינות. התרבות תהיה בדרך כלל יש כמות גדולה של פסולת. כדי לשטוף את התאים, להוסיף 2 מ&quot;ל של חם, PBS סטרילי לטפוח בעדינות את המנה כנגד שתי אצבעות תוך כדי סיבוב בכיוון סיבוב השעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי סיבוב של 360 מעלות, לשאוב PBS ו חוזר בשנית. לשאוב PBS ולהוסיף 2 מ&quot;ל אחר של PBS סטרילי, חם. בדוק את מנת התרבות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שיש לא מעט על מנת פסולת על הצלחת. מפגש Cell ניתן לקבוע גם בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם פסולת נשארת בצלחת התרבות, חזור על שלב 4.2. אם מנת התרבות היא ברורה של פסולת, לשאוב PBS ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת ציפוי החמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים שוב עם חם, PBS סטרילי כדי להסיר כל פסולת סופית או תאים מתים מן התרבות. לשאוב PBS ו- pלשרוך עוד 2 מיליליטר של תקשורת ציפוי החמה על התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק על התאים בכל יום ולהאכיל כל 48 שעות עם תקשורת ציפוי חממה טריה. בשלב זה, תאים יכולים לשמש מבחני תרבית תאים סטנדרטיים. VSMCs צריך להיות כ -80% ומחוברות 4-5 ימים לאחר הציפוי, למרות עשוי להימשך עד 7 ימים עד ההליך מושלם. אם פיצול לפסוקים הבאים, להשתמש לכל היותר 1: 4 35 מנות מ&quot;מ (או לאזור מקביל תרבות מנות). </li></ol>

<ol>
	<li>Katz, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+arterioles+in+type+2+diabetic+(db/db)+mice+undergo+a+distinct+pattern+of+remodeling+associated+with+decreased+vessel+stiffness.">Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness.</a> Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).</li><li>Husarek, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+angiotensin+receptor+blocker+losartan+reduces+coronary+arteriole+remodeling+in+type+2+diabetic+mice.">The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice.</a> Vascul Pharmacol. , (2015).</li><li>Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coronary+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+A1+adenosine+receptor-knockout+mice.">Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).</li><li>Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+attenuates+contraction+of+primary+cultured+rat+airway+smooth+muscle+cells.">Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+two-phase+Ca2++release+and+apoptosis+controlled+by+TRP-ML1+channel+activity+in+coronary+arterial+myocytes.">Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).</li><li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+differentiation+in+development+and+disease.">Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease.</a> Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).</li><li>Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SM22+alpha,+a+marker+of+adult+smooth+muscle,+is+expressed+in+multiple+myogenic+lineages+during+embryogenesis.">SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis.</a> Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).</li><li>Santiago, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblast+to+myofibroblast+differentiation+in+vivo+and+in+vitro:+expression+of+focal+adhesion+components+in+neonatal+and+adult+rat+ventricular+myofibroblasts.">Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts.</a> Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).</li><li>Fisher, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+phenotypic+diversity+and+function.">Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function.</a> Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+phenotype+and+function+of+vascular+smooth+muscle+cells.">Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells.</a> J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).</li><li>Souza-Smith, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenteric+resistance+arteries+in+type+2+diabetic+db/db+mice+undergo+outward+remodeling.">Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling.</a> PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).</li><li>Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+of+coronary+arteries+in+36+species+of+mammalian+from+mouse+to+giraffe.">Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe.</a> Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה להסתגל פרוטוקולי בידוד תא קיימים כדי להגדיל את התשואה של כלילית כלי דם החלקה מלבבות בעכברים. רוב העבודה החלוצית בביולוגיה השריר החלק בכלי הדם בוצע עם תאי שריר חלק אבי העורקים חולדה תרבותי. מחקרים אלה סיפקו את הידע הבסיסי של המנגנונים המולקולר...

המטרה של שיטה זו היא לבודד תאי שריר חלק בכלי דם (VSMCs) מהמחזור כלילית murine לשימוש תרבית תאי מבחני תרבית תאים סטנדרטיים. פתחנו בטכניקה זו כדי להעריך את המנגנונים המולקולריים של שיפוץ כלי דם בחולי סוכרת. דיווחנו בעבר פנימה שיפוץ היפרטרופית ב arterioles כלילית במחיצה במודל העכבר db / db של סוכרת 1. בשל הכמות של רקמה המוגבלת נמצאת התקפי הלב בעכברים במחיצה, ניסיוני בטכניקות תקן חוקר שינויי חלבון (כתם מערבי למשל) בעכברי db / db ובקרה קשות במקרה הטוב. בנוסף, אנו בעבר הראו כי וחסמי רצפטור לאנגיוטנסין (ARB) לוסרטן מפחית את שיפוץ נצפתה בעכברים db / db 2. לכן, בידוד של VSMCs העיקרי מהמחזור הכליליים מאפשר לנו לבדוק את העניין לעומק שינויים פנוטיפ VSMC או איתות מופעל מסלולים בעכברים סוכרתיים, אשר עשוי להיות contribuטינג שיפוץ עורקיק כלילי לוואי. מחקרים רבים הובהרו מסלולי איתות הקנונית באמצעות VSMCs מבודד האאורטה מכרסם, ולא כל מיטת כלי דם ספציפית. עם זאת, יש לנו הפגינו וסקולרית-מיטה שיפוץ ספציפיים כלילית, אבי העורקים, ו תפוצה mesenteric של עכברים db / db 1, דבר המצביע על VSMCs בכל מיטה כלי הדם עשויה להיות שונה. לכן, יש צורך לבודד VSMCs מכל מיטת כלי דם כדי להיטיב להבין את השינויים הפתולוגיים המתרחשים בכל סט של VSMCs. יש שפע של שיטות שונות עבור בידוד culturing VSMCs אבי העורקים. עם זאת, כיום, יש רק מחקר אחד שפורסם על הבידוד של VSMCs מהעכבר כלילית במחזור 3. טנג et al. היה הראשון לדווח על שיטה לבידוד VSMCs ממחזור העכבר כלילית; עם זאת, יש לנו תוקנו בפרוטוקול באופן משמעותי כפי שהם גם מבודדים cel אנדותלls. מעבדות אחרות גם השתמשו בפרוטוקול מ טנג et al. לבודד מיוציטים עורקים כלילית ותאי שריר חלק בדרכי הנשימה 4,5. השינויים שאנו נשלב יניבו אוכלוסיית התאים מועשרים עבור VSMCs מהמחזור כלילית. זלוף המדרדר של לב היונק המבודד, או טכניקת Langendorff, הוקם בשנת 1897 על ידי 6 אוסקר Langendorff ועדיין משמש היום נרחב עבור הבידוד של תאים וכלי דם. הטכניקה המוצגת כאן, יחד עם התקדמות שינויים גנטיים בעכברים מודרניים, מספקת כלי רב ערך לחקירה מדוקדקת יותר של ההתנהגות המולקולרית של VSMCs מהמחזור כלילית.

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solution</td><td>Fisher</td><td>MT-25-060</td><td></td></tr><tr><td>Primocin - 20 ml</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 10 mM 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut 200 mM - Gibco</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Cell Strainer 100 &amp;micro;m nylon mesh</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td><td>Fisher</td><td>12-565-91</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td><td>Fisher</td><td>14-516-124</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type-2&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red)</td><td>Life Technologies</td><td>14170-161</td><td></td></tr><tr><td>5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td><td>Radnoti</td><td>158830</td><td></td></tr><tr><td>11 plus pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>Circulating heated water pump</td><td></td><td></td><td>any brand will work</td></tr></tbody></table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

בעוד הבידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם (VSMCs) מכלי גדול היא מבוססת היטב, חפשנו לבודד ותרבות VSMCs מהמחזור כלילית. לבבות עם קשתות אבי העורקים ללא פגע הוסרו perfused דרך Langendorff מדרדר עם פתרון העיכול המכיל 300 יחידות / מ&quot;ל של סוג collagenase II, 0.1 מ&quot;ג / מעכב טריפסין סויה מ&quot;ל ו 1 M CaCl 2. Perfusates נאספו 15 מרווחי דקה במשך 90 דקות, pelleted ידי צנטריפוגה, resuspended בתקשורת ציפוי, מצופה על מנות בתרבית רקמה. VSMCs התאפיינו בנוכחות SM22α, α-SMA, ו vimentin. אחד היתרונות העיקריים של שימוש בטכניקה זו היא היכולת לבודד VSMCs מהמחזור כלילית של עכברים. למרות שמספר הקטנים של תאים המתקבלים יכול להגביל כמה בקשות אשר התאים יכולים להיות מנוצלים, VSMCs כלילית המבודדת ניתן להשתמש במגוון של טכניקות תרבית תא ומבוססות אסאys. מחקרים החוקרים VSMCs מעכברים מהונדסים גנטי יכולים לספק מידע נוסף אודות פונקציה-מבנה ותהליכי איתות הקשורים פתולוגיות וסקולרית.

בשל ההיבט החדשני טכניקת בידוד VSMC כלילית שלנו, אנחנו בקשנו לקבוע את הטוהר של בידוד התא. עכבר הכליליים VSMCs זוהו מבוסס על מכתים המורפולוגיה immunofluorescence שלהם עד חלוף 2. בהתבסס על המורפולוגיה של התאים בתרבית לאחר הכביסה הראשונה, הליך הבידוד מסיר מיוציטים מה...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells at JoVE.com

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את טכניקות בידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם בעכברים עיקריים (VSMCs) מהמחזור כלילית. לאחר VSMCs בודד, הם יכולים לשמש עבור טכניקות תרבות סטנדרטיות רבות.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

isolation-of-murine-coronary-vascular-smooth-muscle-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  The Ohio State University College of Medicine.  מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את טכניקות בידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם בעכברים עיקריים (VSMCs) מהמחזור כלילית. לאחר VSMCs בודד, הם יכולים לשמש עבור טכניקות תרבות סטנדרטיות רבות. 

Video: Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

בידוד של האדם עורקי טבורי תאים שרירים חלקים (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Neuroscience

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Immunology and Infection

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Medicine

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of vasoconstriction and vasorelaxation. After isolating the IPA and VSMCs, the characteristics of vascular responses in physiological and pathological conditions can be assessed in the absence of extrinsic factors such as nerve signals, hormones, cytokines, etc. Thus, the IPA and VSMCs serve as excellent models for studying vascular physiology/pathophysiology, along with various experimental investigations, such as modulation by pharmacological agents, patch-clamp electrophysiological analysis, calcium imaging, etc. Here, we have used a technique for isolating the IPA to investigate vascular responses in an organ bath setup. IPA segments were mounted on the organ bath chamber via intraluminal wires and stimulated by various pharmacological agents. The changes in IPA vascular tone (i.e., vasoconstriction and vasorelaxation), were recorded using an isometric force transducer and physiological data analysis software program. We implemented several experimental protocols, which can be adapted to investigate the mechanisms of vasorelaxation/vasoconstriction for studying the pharmacological activities of phytochemical or synthetic drugs. The protocols can also be used to evaluate drugs&#39; roles in modulating various diseases, including pulmonary arterial hypertension. The IPA model allows us to investigate the concentration-response curve, which is crucial in assessing drugs&#39; pharmacodynamic parameters.

Vascular responses of arterial pulmonary circulation can be explored using intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs). The present study describes the isolation of IPA in detail and the protocols used for investigating vasorelaxation in response to physiological stimuli.

בידוד של עורקים תוך-ריאתיים ותאי שריר חלק כדי לחקור תגובות כלי דם

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

בידוד והפרדה מגנטית של תאי גזע מסוג +Murine CD34 מדופן כלי הדם

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury and repair. Establishing a stable and efficient method to culture functional murine CD34+ VW-SCs is essential for further investigating the mechanisms involved in the proliferation, migration, and differentiation of these cells under various physiological and pathological conditions. The described method combines magnetic bead screening and flow cytometry to purify primary cultured resident CD34+ VW-SCs. The purified cells are then functionally identified through immunofluorescence staining and Ca2+ imaging. Briefly, vascular cells from the adventitia of the murine aorta and mesenteric artery are obtained through tissue block attachment, followed by subculturing until reaching a cell count of at least 1 &#215; 107. Subsequently, CD34+ VW-SCs are purified using magnetic bead sorting and flow cytometry. Identification of CD34+ VW-SCs involves cellular immunofluorescence staining, while functional multipotency is determined by exposing cells to a specific culture medium for oriented differentiation. Moreover, functional internal Ca2+ release and external Ca2+ entry is assessed using a commercially available imaging workstation in Fura-2/AM-loaded cells exposed to ATP, caffeine, or thapsigargin (TG). This method offers a stable and efficient technique for isolating, culturing, and identifying vascular wall-resident CD34+ stem cells, providing an opportunity for in vitro studies on the regulatory mechanisms of VW-SCs and the screening of targeted drugs.

מחבר זרקור: בידוד ואפיון משופרים של תאי גזע מסוג Murine CD34+ תושב דופן כלי הדם באמצעות ציטומטריית זרימה מצומדת להקרנת חרוזים מגנטיים

This study has established a stable and efficient method for the isolation, culture, and functional determination of vascular wall-resident CD34+ stem cells (CD34+ VW-SCs). This easy-to-follow and time-effective isolation method can be utilized by other investigators to study the potential mechanisms involved in cardiovascular diseases.

בידוד אימונומגנטי של תאי גזע CD34+ תושבי דופן כלי הדם מעכברים

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...