This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые шаги протокола ниже, требуют работы в чистом вытяжного шкафа. Кроме того, способ требует дрожжи тетрад рассечение микроскопа, снабженного расстояние объектива 10X длительным рабочим контролировать сферопластов. Микроскоп должен быть установлен в капот впереди времени. Снимите Микроманипулятор руку и держатель пластин от объема и поместить эти предметы в безопасном месте, вдали от рабочей зоны. 1. Подготовка сферопластов <ol><li> Растут дрожжи в желаемых условиях. Используйте около 2 х 10 8 клеток для каждого образца, например 4 мл культуры в OD 600 = 1,4 х 10 5 7 клеток / мл. Хотя непосредственная обработка образцов может быть предпочтительным в некоторых случаях, для большинства приложений, сотовые аликвоты можно хранить на льду в течение 8 часов перед обработкой. </li><li> Передача клеточной суспензии в 15 мл центрифужную пробирку и спина в клинической центрифуге при установке 5 (2345 оборотов в минуту / 857,5 XG) в течение 3 мин для осаждения клеток. </lя&gt; <li> Слейте заботясь среднего, чтобы не потерять клетки из осадка. Аккуратно ресуспендирования клеток в 1 мл буфера ZK, а затем добавить 40 мкл 1 М дитиотреитола (DTT). Выдержите 2 мин с нежным смешивания. Пелле клетки, как и раньше (см шаг 1,2). </li><li> Ресуспендируют гранулы в 1 мл буфера ZK. Добавьте 5 мкл свежеприготовленного раствора zymolyase 100T, который был тщательно перемешивают. Инкубируют в течение 20-30 мин при температуре 30 ° С для удаления клеточной стенки и производят сферопластов. </li><li> Анализе 10 мкл каплю суспензии клеток на предметном стекле микроскопа, чтобы определить, сферопластов завершена. Клетки смотрел под микроскопом рассечение без покровного стекла. Клетки должны появляться раздутой и круглая, а не слегка продолговатой и должны лизировать после добавления 20 мкл воды. Если клетки не лизируют, возвращают образец до 30 ° С и повторно анализа каждые 10 мин до тех пор, вода вызывает лизис не легко наблюдать. Пелле клетки, как и раньше (см шаг 1,2). </li><li> Аккуратно ресуспендирования и мыть осадок клеток Iп 2,5 мл холодной МЧС / буфер сорбит. Пелле клетки, как и раньше (см шаг 1,2). Аккуратно ресуспендирования осадок клеток в 300-400 мкл холодного буфера MES / сорбит. Клетки могут быть хранили на льду на этой стадии в течение нескольких часов. </li></ol> 2. Хромосома Распространение ПРИМЕЧАНИЕ: стеклянные поверхности, на которой хромосомы будет распространяться-либо слайды или покровные-должны быть готовы заранее. Каждый слайд или покровное должна быть погружена в воду, а затем этанола, а затем высушить, и полированный с объективом бумаги. Если хромосомы будет распространяться на покровных, покровное должны быть прикреплены к слайду с скотча или резиновым клеем. Если не указано иное, остальная часть будет описывать протокол распространяется на любом слайде или покровным <ol><li> Использование P20 пипетки, пипетки 20 мкл клеточной суспензии на поверхность чистой слайда. </li><li> Использование P200 пипетки, добавьте 40 мкл 3% PFA / раствора сахарозы и осторожно смешать SOLUTIOн от &quot;закрученной&quot; слайд с рукой, пока теневые линии не исчезнут. Поместите слайд под микроскопом и подтвердить, что клетки находятся в фокусе. Решение PFA должно быть свежеприготовленным в вытяжном шкафу в день использования. Примечание: Если интересующий белок не был рассмотрен ранее метода, желательно, чтобы подготовить дополнительные слайды с использованием растворов, содержащих 2 и 4% PFA, чтобы определить, удержание белка чувствителен к условий фиксации. 4% PFA / раствор сахарозы используется в тех случаях, когда желательно, чтобы визуализировать связанные тубулина микротрубочек. Недостатком более высокой концентрации закрепляющего, что хромосомы будет &quot;underspread,&quot; 2% PFA и имеет тенденцию давать &quot;underspread&quot; хромосомы. </li><li> Использование P200 пипетки, добавьте 80 мкл 1% Lipsol, водоворот, как и раньше, чтобы смешать решения как можно полнее, запустить таймер. Если Lipsol не доступен, 80 мкл 1% NP40, или 80 мкл дН 2 O может бытьзамещенных (см Представитель Результаты, рисунок 2). </li><li> Смотрите клетки тщательно и нежно вихревой слайде каждые 15 сек. Когда примерно 80% клеток были лизированы (исчезли) остановить таймер, немедленно удалить слайд из микроскопа, добавить 80 мкл PFA / раствора сахарозы, и водоворот перемешать. Лизис должно происходить от между 30 и 90 сек после запуска таймера. ПРИМЕЧАНИЕ: Если несколько слайдов показать лизис примерно в то же время, можно в конечном итоге опустить микроскопический контроль за оставшейся части слайдов и просто тщательно Время период между добавлением lipsol и того конечного аликвоты фиксатором. Тем не менее, этот короткий разрез единственным надежным при подготовке нескольких слайдов из того же образца. Лучше всего, чтобы контролировать лизис каждого образца под микроскопом при различных слайдов получают из образцов, взятых в разные моменты времени или из разных культур. </li><li> Поместите слайд на чистую ровную поверхность и распространять жидкость по всей unfrosted Surfacе слайд, используя сторону чистой одноразовой пипетки пастбищ, состоявшейся ниже мениска &quot;лужу&quot;, но над поверхностью самого слайда, то есть. не &quot;грабли&quot; поверхность слайда с пипеткой. Не использовать пипетки на разных слайдах, чтобы избежать загрязнения образцов. </li><li> Оставить слайды высохнуть в течение ночи в вытяжном шкафу. Нерастворимые компоненты ядерных осядет на поверхности слайдов и привязать к нему. Для больших экспериментов, планировании использования космического пространства в стадии сушки важно. </li><li> После высыхания, оптимальные результаты получаются прогрессирует до стадии иммуноокрашивания в тот же день. Тем не менее, сушат раствора сахарозы встраивает распространение хромосомы в &quot;мед&quot;, что позволяет замораживание образцов: горки могут быть переданы на пластиковой слайд коробки и хранили при -20 ° С в течение многих лет. </li></ol> 3. Иммуноокрашивание <ol><li> Dip слайдов в 0,2% Photo-Flo в течение 30 сек. удалить мед. Lean скользит покрая, с кромки отдыхает на бумажное полотенце, чтобы удалить остатки фото-Фло. </li><li> Dip слайдов в 1x TBS в течение 5 мин, чтобы вымыть. Удалить лишнюю жидкость, опираясь слайдов на краю, но не позволяйте им высохнуть. </li><li> Положите слайды матовое стороной вверх, пипетки 300 мкл TBS / БСА на слайде через unfrosted части слайда. </li><li> Инкубируют во влажной камере при комнатной температуре в течение 15 мин. (Большой пластиковый контейнер выложены водонасыщенных бумажных полотенец под перфорированной металлической пластины или пластика слайд коробки с насыщенными бумажных полотенец). </li><li> Слив слайды отдыха короткий край слайда на бумажное полотенце и опираясь слайд против соответствующей опоры (такие, как стойки пробирке). Не позволяйте поверхности высохнуть. </li><li> Сразу применить 80 мкл TBS / BSA буфера, содержащего соответствующий разбавление первичного антитела. Если антитело ограничения, использовать 40 мкл и покровное мм 22 х 22. Для сырой сыворотки кролика, это, как правило, между разведении 1/50 и 1/500. ПРИМЕЧАНИЕ:Выполните титрование для новых препаратов антител. Наиболее разбавленный препарат, который дает высокий сигнал над фоном выбран. Для контроля уровня фонового окрашивания, ядра должны быть получены из соответствующего штамма мутанта с делецией и / или дублировать слайды должны быть окрашены с предварительно иммунной сыворотки. </li><li> Поставьте полированный 22 х 50 мм покровное на слайде, избегая пузырьков. Для этого, удерживая покровное между большим и указательным пальцем вдоль длинного края в положениях вблизи одного короткого края. Проведение покровное на 30 ° углом, чтобы скользить, а короткий край дальний от пальцев опускают до тех пор, пока опирается на слайде только внутри края &quot;лужи&quot; ближе всего к матовым области слайда. Затем медленно опустите покровное в плавным движением до пальцев, имеющих прикосновение слайд скамейке, а затем отпустите. Не пытайтесь регулировать положение покровного стекла, когда он приземлится. ПРИМЕЧАНИЕ: Если спреды хромосомные были подготовлены наПРИКРЕПЛЕННОЙ покровные (а не непосредственно на поверхность слайдов), этот образец покровное будет оставаться прикрепленными к слайду всей окрашивания и стиральных шагов. Дополнительным покровное будет размещен на верхней части образца покровным чтобы равномерно распределить раствор антител во окрашивания и затем отбрасывают. </li><li> Место слайдов в запечатанном влажной камере и инкубируют в течение ночи при 4 ° С. </li><li> Проведение матовое насыпного края слайды на стекле окрашивания стойки и погрузиться в окрашивания банку, содержащую TBS. </li><li> Осторожно опустите слайд вверх и вниз, чтобы удалить покровное. Старайтесь не использовать слишком много сил, чтобы сделать это. Вымойте слайды 2x 10 мин, погружая в TBS. Удалить слайды из стойки и слейте лишнюю жидкость, касаясь край бумажным полотенцем. Не позволяйте поверхность сухой. </li><li> Работая под приглушенный свет, сразу добавить 80 мкл TBS / БСА, содержащий 1/1000-кратное разбавление флуорохромом сопряженного вторичного антитела (или 40 мкл 22 х 22 мм покровным). Объявлениед покровное, как и раньше, и инкубируют при 4 ° С в течение 2 ч во влажной камере в темноте. </li><li> Удалить покровные, как и прежде, процедить слайды, и позволяют поверхности высохнуть в течение от 1 до 2 часов в темноте. Lean горки на бумажных полотенцах, как раньше. Примечание: Если была выполнена распространяется на смонтированном покровное, отсоединить покровное из слайда перед сушкой. Покровные затем сушат, как описано для слайдов на предыдущем шаге. </li><li> Работая под приглушенный свет, добавить около 30 мкл монтажа среду, содержащую DAPI (три 10 капель мкл), а затем осторожно опустите покровное. Если спреды на покровных, место капельки монтажа среды на чистую слайда и опустите покровное, сторона хромосом вниз, на слайде. </li><li> Тем не менее в приглушенном свете, подождите 2 мин для покровного урегулировать и печать края покровного стекла с прозрачным лаком для ногтей. Поместите слайды в плоском поле слайда. ПРИМЕЧАНИЕ: Для STED микроскопии, крепление с продлить Gold. Используйте 30 мкл продлить Золотобез DAPI и позволяют вылечить ночь. Уплотнение с лаком для ногтей является необходимым. </li><li> Просмотр слайдов по широкопольными эпифлуоресцентной микроскопии с 40 или 100X цель с помощью фильтра установить подходит для DAPI сосредоточиться. При желании сохранить слайд в темноте при 4 ° С в течение нескольких недель. Не замораживать. </li></ol>

<ol>
	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize...

Многообещающий дрожжей Saccharomyces Cerevisiae предлагает множество преимуществ для изучения молекулярных механизмов биологических процессов, в том числе исследования белков, которые контролируют функцию хромосом. Хотя есть известные преимущества бутонизации дрожжей для генетических, молекулярных и биохимических исследований, цитологические исследования распределения белков в ядре клетки осложняется его небольшого размера. Типичный дрожжевой ядро ​​имеет диаметр менее одного микрона, который находится всего приблизительно в 5 раз предел разрешения видимого света. Таким образом, объем информации о распределении ядерных белков, которые могут быть получены из обычных иммунным окрашиванием или с помощью флуоресцентного белка метки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), ограничено. Полезный подход для характеристики субъядерного распределение белков поверхности хромосома распространения. Этот подход включает в себя удаление клеточной стенки, нарушая клетки и ядерные мембраны, аllowing нерастворимые содержимое ядра, чтобы оседают на поверхности предметного стекла микроскопа. Эти нерастворимые компоненты включают в себя ядерный матрикс и хромосомы. В дополнение к возможности удаления растворимых ядерных содержание, которое повышает способность обнаруживать хроматина связанных белков, хромосома распространения результатов метода в значительной декомпрессии хромосом, так что распространение ядра имеют диаметры около 3 до 5 мкм (для диплоидных ядер мейотических) и от 2 до 3 мкм для диплоидных ядер митотических. Это декомпрессии позволяет обнаруживать ядерной подструктуры, что относительно трудно или невозможно решить в интактных ядер. Очевидным недостатком с хромосомой распространения вероятность того, что распространение процедура может частично или полностью нарушить структуру интерес. Особую озабоченность в том, что хромосома частности белком, могут быть потеряны в результате расширени процедуры. Этот потенциал осложнение ШоуLD иметь в виду, при интерпретации данных. Одним из примеров белка, который чувствителен к распространению процедуры бета-тубулина. При некоторых условиях, шпиндель, который состоит в основном из тубулина, сохраняется во время расширения 3. Визуализация шпинделя часто бывает полезно организовать ядра интерес. Тем не менее, визуализации тубулина требует лечения с высокой концентрацией фиксатором; шпиндели теряются в стандартных условиях, описанных ниже. Этот пример иллюстрирует, что при анализе распределения ранее неохарактеризованной белка, важно, чтобы изменять концентрацию фиксатора, чтобы определить, насколько чувствительный белок с таким изменением. Несмотря на озабоченность по поводу воздействия расширяющих условий на структуру хромосом, полезность и способность метода расширения была продемонстрирована во многих контекстах и имеет широкий полезность в характеристике митотической и, особенно мейоза клетки 4-7. Общий весО способы расширения спектра широко используются. Первый из этих методов, разработанных Dresser и Жиру 8, позволяет избежать использования моющего средства и может дать расширенные препараты, которые появляются, чтобы иметь относительно хорошо сохранившийся морфологии хромосом при окрашивании DAPI для красителя ДНК конкретного. Тем не менее, этот метод является довольно трудно усовершенствовать и качество распространенных ядер значительно изменяется, когда одна область слайда по сравнению с другими регионами. Эта проблема может осложнить количественные подходы, которые включают визуализации много невыделенных ядра от одного слайда, чтобы избежать предвзятости данных приобретения. Второй способ распространения хромосом, разработанная Loidl и Клейна 1, включает в себя балансирование фиксацию параформальдегидом, с лизисом и хроматина декомпрессии продвигаемой растворе моющего средства. При правильном исполнении, этот метод дает очень воспроизводимые результаты с меньшим область-в-области изменения по сравнению с методом Dresser и Жиру. Эта презентация фокусируется на modified версия метода Loidl и Клейна, из-за его надежности и простоте. Хромосома распространения не является сложным или времени; до 100 слайдов могут быть подготовлены для иммуноокрашивания в один день. Кроме того, распространение препараты могут быть сохранены в морозильнике в течение многих лет до иммунной, и, таким образом лаборатории могут разработать хранилище замороженных спредов хромосом, которые могут быть использованы, когда возникают новые биологические вопросы или новые окрашивания реагентов становятся доступными. Способ распространения хромосом наиболее часто используется в комбинации с использованием иммунной и флуоресцентной микроскопии Widefield, но это также возможно, чтобы подготовить слайды для супер-разрешения световой микроскопии методами, такими как стимулируется обедненной выбросов (STED) микроскопии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>US Biological&#160;</td>
			<td>Z1004</td>
			<td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&#176;C until ready for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipsol&#160;</td>
			<td>L.I.P. Ltd&#160;</td>
			<td>no longer commercially available</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard coverslip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-E or 12-540-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>P-7417</td>
			<td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&#176;C for up to a month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector 
			Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-1</td>
			<td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&#176;C. Also, use as a wet chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-816</td>
			<td>Use as a wash basin for slides.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

Появление распространенных ядер критически зависит от баланса между фиксации хромосом и де-уплотнения. Даже тогда, когда реагенты образом сбалансированы, изменение степени хромосомной де-уплотнения может происходить в различных регионах же слайде и / или между различными слайдами. Т?...

Watch this Scientific Journal Video about Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes at JoVE.com

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Поверхность Распространение и Иммуноокрашивание дрожжей хромосом

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Research

JoVE Journal

Biology

9.8K Views.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Video: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Высокая пропускная способность дрожжей плазмиды экрана Сверхэкспрессия

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Конкурентные Геномная Экраны Barcoded Библиотеки дрожжей

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Хроматографической очистки высокоактивной рибосомы дрожжей

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Иммуноокрашивание расчлененного данио рерио Эмбриональные сердца

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Алчность на основе взаимодействия внеклеточной скрининга (AVEXIS) для масштабируемых обнаружения низкого сродства внеклеточного рецептор-лиганд

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Высокая пропускная способность физического картирования хромосом использованием автоматизированных<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Вскрытие и Иммуноокрашивание имагинальные диски из<em&gt; Дрозофилы</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Простой метод ДНК флуоресценции<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация, чтобы раздавил хромосом

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Микроскопия делящихся дрожжей Жизненный цикл сексуальной

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Пространственно-временная Анализ Cytokinetic События в делящихся дрожжей

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...