Name: surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes at JoVE.com

This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

NOT: Protokol bazı adımlar aşağıda temiz bir davlumbaz çalışma gerektirir. Buna ek olarak, yöntem spheroplasting izlemek için bir 10X uzun çalışma mesafesi hedefi ile donatılmış bir maya tetrad diseksiyon mikroskobu gerektirir. mikroskop vaktinden kaputu kurulmalıdır. Kapsamından mikromanipülatör kol ve plaka tutucu çıkarın ve çalışma alanından uzakta güvenli bir yerde bu öğeleri koyun. Spheroplastlar hazırlanması 1. <ol><li> İstenen şartlar altında mayayı büyütün. OD600 1.4 = 5 x 10 7 hücre / ml&#39;de her bir örnek için yaklaşık 2 x 10 8 hücreleri, örneğin, bir kültürün 4 ml kullanın. Numunelerin anında işlem, bazı durumlarda tercih edilebilir olsa da, bir çok uygulama için, hücre alikotları işlemden önce en fazla 8 saat süre ile buz üzerinde saklanabilir. </li><li> Pelet hücreleri 3 dakika boyunca 5 (2345 rpm / 857,5 xg) ayarlayarak bir klinik santrifüj cihazında bir 15 ml santrifüj tüpüne ve spin hücre süspansiyonu aktarın. </li&gt; <li> Pelet hücreleri kaybetmek değil orta alarak dikkat Durusu. Yavaşça 1 mi ZK tampon içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve daha sonra 40 ul 1 M ditiyotreitol (DTT) ilave edin. Yumuşak bir karıştırma ile 2 dakika kuluçkalayın. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (adım 1.2). </li><li> 1 mi ZK tamponu içinde yeniden süspanse peletler. İyice karıştırıldıktan zymolyase 100T taze hazırlanmış bir çözeltisine 5 ul ekle. Hücre duvarı çıkarın ve sferoplastlar üretilmesi için 30 ° C sıcaklıkta 20-30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Spheroplasting tam olup olmadığını belirlemek için bir mikroskop lamı üzerine hücre süspansiyonu, 10 ul damlacık testi. Bir lamel olmadan diseksiyon mikroskobu altında incelendi hücreler. Hücreler, şişirilmiş ve yuvarlak yerine hafif dikdörtgen görünür ve su 20 ul ilave edildikten sonra lize gerekir. Hücreler lize başarısız olursa, su kaynaklı lizis kolaylıkla gözlenene kadar her 10 dakikada bir, 30 ° C örnek dönmek ve yeniden deney. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (adım 1.2). </li><li> Yavaşça tekrar süspansiyon ve hücre pelet i yıkayınn, 2.5 ml soğuk MES / sorbit tamponu. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (adım 1.2). Yavaşça 300-400 ul soğuk MES / sorbitol tampon içinde hücre pelletini. Hücreler, bir kaç saat için bu aşamada buz üzerinde tutulmalıdır. </li></ol> Yayılma 2. Kromozom NOT: kromozomlar-yayılmış ya slayt veya edilecek bunun üzerine cam yüzeyler lamelleri-gerekir vaktinden önce hazırlanacak. Her slayt veya lamel suya edilmelidir ardından EtOH, sonra kurumaya bırakılır ve objektif kağıdı ile parlatılır. Kromozomlar lamelleri üzerine yayılır edilecek ise, lamel Scotch bant veya kauçuk çimento ile slayt yapıştırılmış olmalıdır. Aksi belirtilmedikçe, protokolün geri kalanı ya bir slayt veya lamel yayılmasını anlatacağız <ol><li> Temiz bir slayt yüzeyi üzerine bir P20 pipet, pipet hücre süspansiyonu 20 ul kullanılması. </li><li> P200 pipet kullanarak,% 3 PFA / sukroz çözeltisi 40 ul ve hafifçe Solutio karıştırınSchlieren hatları kayboluncaya kadar elle slayt &quot;dönen&quot; ile n. Mikroskop altında slayt yerleştirin ve hücreler odakta olduğunu onaylayın. PFA çözeltisi kullanım gününde davlumbaz taze hazırlanmış olmalıdır. NOT: İlgili protein önceden yöntemiyle incelenmiş değilse, bu proteinin tutma sabitleme koşullarına duyarlı olup olmadığını belirlemek için 2 ve% 4 PFA içeren solüsyonlar kullanarak ek slaytlar hazırlamak için tavsiye edilir. % 4 PFA / sukroz çözümü ilişkili tübülin mikrotübül görselleştirmek için arzulanır olduğu durumlarda kullanılmaktadır. yüksek sabitleyici konsantrasyon dezavantajı kromozom olacağıdır &quot;underspread,&quot;% 2 PFA aynı zamanda &quot;underspread&quot; kromozom elde etmek eğilimindedir. </li><li> P200 pipet kullanarak, tamamen mümkün olduğunca çözüm karıştırmak için önce girdap, bir zamanlayıcı başlatmak,% 1 Lipsol 80 ul ekleyin. Lipsol mevcut değilse, 80 ul% 1 NP40 ve 80 ul dH 2 O olabilir(Şekil 2 Temsilcisi Sonuçlar bakınız) ikame. </li><li> Kayıcı her 15 saniyede girdap dikkatlice ve yavaşça hücrelerin izleyin. Hücrelerin kabaca% 80&#39;i parçalanmış zaman, hemen mikroskop slaytı kaldırmak, Sayacı durdurmak PFA / sakaroz çözeltisi 80 ul ekleyin ve girdap karıştırmak için (kayboldu). Lizis zamanlayıcı başladıktan sonra 30 ila 90 sn gerçekleşmelidir. NOT: Birkaç slaytlar yaklaşık aynı zamanda lizizini göstermek ise, bir sonuçta slaytlar kalanı için mikroskobik izleme ihmal ve sadece dikkatle lipsol ve fiksatif son kısım ilave eklenmesi arasındaki süreyi zaman olabilir. Aynı örnekten birden slayt hazırlarken Ancak, bu kısa yol, sadece güvenilir. Farklı slaytlar farklı zamanlarda alınmış örneklerden veya farklı kültürlerden hazırlanır zaman mikroskobik her numunenin lizizine izlemek için en iyisidir. </li><li> Temiz, düz bir yüzey üzerine slayt yerleştirin ve tüm çözülmesi sağlandığında Surfac boyunca sıvı yaymak&quot;su birikintisi&quot; menisküs altında ama yani slayt kendisi yüzeyi üzerinde düzenlenen bir temiz, tek Mera pipet tarafı kullanarak slayt e. pipetle slayt yüzeyini &quot;komisyon&quot; yoktur. Numunelerin kirlenmesini önlemek için farklı slaytlar üzerinde pipetlemeyin tekrar kullanmayın. </li><li> Davlumbaz gece kurumaya bırakın slaytlar. Çözülmeyen nükleer bileşenler slayt yüzeyine yerleşmek ve ona bağlanacaktır. Büyük deneyler için, kurutma aşaması için alanı kullanımını planlama çok önemlidir. </li><li> Bir kez kurutulduktan sonra, en iyi sonuçlar aynı gün immün aşamasına ilerlemektedir ile elde edilir. Ancak, kurutulmuş sakaroz çözüm örneklerinin donmasını sağlayan bir &quot;bal&quot; in yayılması kromozomları gömer: slaytlar plastik slayt kutusuna aktarılır ve yıllarca -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 3. immün <ol><li> 30 sn% 0.2 Fotoğraf-Flo Dip slaytlar. bal kaldırmak için. Yalın slaytlarBir kenar, kenar bir kağıt havlu üzerine dayayarak, rezidüel Foto-Flo kaldırın. </li><li> 5 dakika boyunca 1x TBS Dip slaytlar yıkayın. Bir kenarda slaytlar yaslanarak fazla sıvıyı çıkarın, ama onları kurumaya izin vermeyin. </li><li> Yan yukarı, pipet 300 ul TBS / BSA slayt çözülmesi sağlandığında kısmı boyunca slayt üzerine buzlu slaytlar yatırın. </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bir nem odasında inkübe edilir. (Doymuş kağıt havlu ile bir delikli metal plaka veya plastik slayt kutusunun altında suya doygun kağıt havlu ile kaplı büyük plastik kap). </li><li> Bir kağıt havlu üzerine slayt bir kısa kenarı dinlenme ve (örneğin bir test tüpü raf gibi) uygun bir destek karşısında slayt eğilerek slaytlar boşaltın. Yüzey kurumasına izin vermeyin. </li><li> Hemen birincil antikor, uygun bir seyreltme içeren TBS / BSA tamponu 80 ul uygulanır. Antikor sınırlayıcı ise, 40 ul ve 22 x 22 mm&#39;lik bir örtücü cam kullanılır. Ham tavşan serumu için, bu tipik olarak, bir 1/50 ve 1/500 seyreltme arasındadır. NOT:Yeni antikor hazırlıkları için titrasyonları gerçekleştirin. arka plan üzerinde yüksek sinyal verir en inceltilmiş hazırlık seçilir. Bağışıklık-öncesi serumu ile boyanmış olmalıdır arka plan boyama düzeyi kontrol etmek için, çekirdekler, uygun silme mutant ve / veya çift slaytlar hazırlanmalıdır. </li><li> Kabarcıklar kaçınarak slayt üzerinde cilalı 22 x 50 mm lamel yerleştirin. Kısa bir kenarına yakın pozisyonlarda uzun kenarından başparmak ve işaret parmağı arasında lamel tutarak bunu yapın. 30 ° açıyla lamel Holding sadece &quot;su birikintisi&quot; slayt buzlu bölgeye yakın kenarına iç slayt üzerinde oturana kadar parmakları kısa kenar uzak düşer, slayt. Sonra yavaş yavaş slayt dokunmatik tezgah tutan parmakları kadar pürüzsüz bir hareket lamel düşürmek ve sonra bırakın. O topraklarda bir zamanlar lamel konumunu ayarlamak için çalışmayın. NOT: kromozom yayılır hazırlanmış olsaydıyapıştırılmış lamelleri (ziyade direkt olarak slaytlar yüzey), bu örnek lamel boyama ve yıkama aşamaları boyunca slayt yapıştırılmış kalır. Ek bir lamel boyama ve daha sonra atılır boyunca eşit bir şekilde antikor çözüm dağıtmak için örnek lamel üzerine yerleştirilecektir. </li><li> Sızdırmaz şekilde kapalı bir nemli oda içinde yer slaytlar ve 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Bir cam slayt boyama rafa buzlu kenar aktarım işlemlerinin slaytları Holding ve TBS içeren bir boyama kavanoz daldırın. </li><li> Yavaşça lamel kaldırmak için yukarı ve aşağı slayt batırın. Bunu yapmak için çok fazla kuvvet kullanmaya çalışıyorum. TBS daldırarak 10 dakika 2x slaytlar yıkayın. Raftan slaytları çıkarın ve kağıt havlu kenarı dokunarak fazla sıvıyı boşaltın. Yüzey kuru izin vermeyin. </li><li> Işık altında altında çalışan hemen 80 ul TBS / BSA florokrom konjuge sekonder antikor (ya da 22 x 22 mm&#39;lik bir örtücü cam, 40 ul) içindeki bir 1 / 1,000 kat seyreltme içeren ekleyin. Ilanve daha önce olduğu gibi D lamel karanlıkta nemli oda içinde 2 saat süre ile 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> , Daha önce olduğu gibi lamelleri çıkarın slaytlar drenaj ve karanlıkta 1 ila 2 saat boyunca havada kurumaya yüzey sağlar. Daha önce olduğu gibi kağıt havlu üzerinde Yalın kayar. NOT: yayılan monte lamel gerçekleştirildi ise, kurumadan slayt lamel ayırın. Önceki adımda slaytlar için tarif edildiği gibi lameller daha sonra kurutulur. </li><li> Bastırılmış ışık altında çalışan, DAPI (üç 10 ul damlacıkları) içeren orta montaj yaklaşık 30 ul ekleyin ve sonra dikkatli bir şekilde lamel indirin. Formalar lamelleri üzerinde ise, temiz bir slayt üzerinde montaj orta damlacıkları yerleştirin ve slayt üzerine aşağı lamel, kromozom tarafını indirin. </li><li> Hala bastırılmış ışık altında, yerleşmek ve net oje ile lamel kenarları mühür için lamel için 2 dakika bekleyin. Düz slayt kutusunda slaytlar yerleştirin. NOT: STED mikroskopi için, uzatmak Gold ile monte edilir. Uzatmak Altın 30 ul kullanınve DAPI olmadan gecede tedavi için izin verir. Oje ile sızdırmazlık gereksizdir. </li><li> 40 veya 100X amacı DAPI odaklanmak için uygun ayarlanmış bir filtre kullanarak widefield Epifloresans mikroskobu ile Görünüm slaytlar. İsteğe bağlı olarak, birkaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de karanlıkta slayt saklayın. Donma yok. </li></ol>

<ol>
	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize...

tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae kromozom fonksiyonunu kontrol eden proteinlerin çalışmaya dahil olmak üzere biyolojik süreçlerin moleküler mekanizmaları, çalışmaları için birçok avantaj sunuyor. , Moleküler genetik ve biyokimyasal çalışmalar için maya tomurcuklanan iyi bilinen avantajları olmasına rağmen, hücre çekirdeğinde bulunan protein dağılımının sitolojik çalışmalar küçük boyutu karmaşıktır. Tipik bir maya çekirdeği görünür ışığın sadece yaklaşık 5 katı çözünürlük sınırı olan en az bir mikron bir çapa sahiptir. Bu nedenle, geleneksel bir immün ya da, yeşil flüoresan protein (GFP) gibi floresan proteini etiketleri kullanılarak elde edilebilir, nükleer proteinlerin dağılımı hakkında bilgi miktarı sınırlıdır. Proteinlerin çekirdek içi dağılımı karakterize için yararlı bir yaklaşım, yayılma kromozom yüzeyidir. Bu yaklaşım, hücre duvarını kaldırarak hücre ve nükleer membranlar ve a kesintiye içerirllowing çekirdeğin çözünmeyen içeriğinin bir mikroskop lamı yüzeyi üzerine yerleştirmek. Çözünmeyen bileşenler, nükleer matris ve kromozom bulunmaktadır. Kromatin bağlı proteinleri tespit etmek için yeteneğini geliştirir çözülebilen çekirdek içindeki uzaklaştırılmasını sağlayan ek olarak, bu tür yayılmış çekirdek yaklaşık 3 um ila 5 arasında çaplara sahip (diploid mayoz çekirdekleri) kromozom önemli dekompresyonu yöntem sonucu yayılan kromozom ve 2 diploid mitotik çekirdekleri ila 3 um. Bu dekompresyon sağlam çekirdekleri gidermek için nispeten zor veya imkansız nükleer alt algılanmasını sağlar. Yayılma kromozoma bariz bir eksiklik yayma işlemi ilgi yapısını bozan kısmen veya tamamen ihtimalidir. Özellikle endişe, belirli bir kromozom bağlı protein yayılan prosedürünün bir sonucu olarak kaybedilebilir olmasıdır. Bu potansiyel komplikasyon shouveri yorumlanırken ld akılda tutulmalıdır. Yayılma prosedüre karşı duyarlı olan bir proteinin bir örneği, beta-tubulin olup. Bazı koşullar altında, esas olarak tübülin oluşan mili, 3 yayılması sırasında korunur. Milin Görselleştirme genellikle ilgi çekirdeklerini sahne yararlıdır. Bununla birlikte, tubulin görselleştirme yüksek bir konsantrasyon sabitleyici tedavi gerektiren; iğ, aşağıda tarif edilen standart koşullar altında kaybolur. Bu örnek, daha önce uncharacterized proteinin dağılımını analiz ederken, bu proteinin böyle varyasyon ne kadar duyarlı belirlemek için sabitleştirici konsantrasyonunu değişir önemli olduğunu göstermektedir. Kromozom yapısına yayılan koşulların etkilerine ilişkin endişe rağmen, yayılma yöntemi yarar ve güç pek çok bağlamda gösterdiler ve mitoz karakterizasyonu ve özellikle mayotik hücreleri 4-7 geniş yarar sahiptir. Two yayma yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Dresser ve Giroux&#39;nun 8 tarafından geliştirilen bu yöntem, ilk olarak, deterjan kullanımını önler ve DNA spesifik boya DAPI lekeli göreceli olarak iyi korunmuş morfolojisinin sahip gibi görünmektedir yayılmış preparatları elde edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem, mükemmel nispeten zordur ve bir sürgünün bir bölge, diğer bölgelere kıyasla zaman yayılmış çekirdeğin kalitesi, önemli ölçüde değişir. Bu sorun veri toplama önyargı önlemek için, bir slayt birçok seçilmemiş çekirdekleri görüntüleme içeren kantitatif yaklaşımların karmaşık hale getirebilir. Loidl ve Klein 1 tarafından geliştirilen yöntem yayılan ikinci kromozom, lizis ve deterjan çözeltisi tarafından teşvik kromatin dekompresyon ile, paraformaldehid ile fiksasyon dengeleme içerir. Düzgün yapıldığında, bu yöntem Dresser ve Giroux yöntemine göre daha az bölge için bölge varyasyon ile çok tekrarlanabilir sonuçlar verir. Bu sunum, bir tadil odaklanırnedeniyle güvenilirliğe ve sadeliğe sahip Loidl ve Klein yöntemine d versiyonu. Kromozom yayma karmaşık ya da zaman alıcı değildir; 100&#39;e kadar slaytlar tek bir gün içinde immün için hazırlanmış olabilir. Ayrıca, yayılma hazırlıkları öncesinde immün yıllarda dondurucuda saklanabilir ve böylece laboratuarları yeni biyolojik sorular ortaya ya da yeni boyama reaktifleri kullanılabilir hale kullanılabilen donmuş kromozom yayılır bir depo gelişebilir. kromozom yayma yöntemi en sık immün ve widefield floresan mikroskobu ile birlikte kullanılır, ancak bu tür uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi olarak süper çözünürlüklü ışık mikroskobu yöntemleri için slaytlar hazırlamak da mümkündür olduğunu.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biological&amp;nbsp;</td><td>Z1004</td><td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&amp;deg;C until ready for use.</td></tr><tr><td>Lipsol&amp;nbsp;</td><td>L.I.P. Ltd&amp;nbsp;</td><td>no longer commercially available</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Standard coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-544-E or 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>High resolution coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solution</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&amp;deg;C for up to a month.</td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting media with DAPI</td><td>Vector&lt;br/&gt; Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Plastic slide box</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&amp;deg;C. Also, use as a wet chamber.</td></tr><tr><td>Cardboard slide box</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Use as a wash basin for slides.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

yayılmış çekirdeklerinin görünümü eleştirel kromozom tespit ve de-sıkıştırma arasındaki dengeye bağlıdır. Reaktifler düzgün dengeli bile, kromozom de-sıkıştırma derecesi değişim ve / veya farklı slaytlar arasında aynı slayt değişik bölgelerinde meydana gelebilir. Görüntüleri yorumlanır önce Böylece, bir slayt belirli bir bölgedeki formaların kalitesi değerlendirilmelidir. &quot;overspreading&quot; ve &quot;underspreading&quot; etkileri öz değişmesin...

Watch this Scientific Journal Video about Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes at JoVE.com

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Görüntüleme.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Video: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Genetik

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Biyoloji

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

Biyokimya

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Maya Colony Gömme Yöntemi

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...