This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

NOT: Protokol bazı adımlar aşağıda temiz bir davlumbaz çalışma gerektirir. Buna ek olarak, yöntem spheroplasting izlemek için bir 10X uzun çalışma mesafesi hedefi ile donatılmış bir maya tetrad diseksiyon mikroskobu gerektirir. mikroskop vaktinden kaputu kurulmalıdır. Kapsamından mikromanipülatör kol ve plaka tutucu çıkarın ve çalışma alanından uzakta güvenli bir yerde bu öğeleri koyun. Spheroplastlar hazırlanması 1. <ol><li> İstenen şartlar altında mayayı büyütün. OD600 1.4 = 5 x 10 7 hücre / ml&#39;de her bir örnek için yaklaşık 2 x 10 8 hücreleri, örneğin, bir kültürün 4 ml kullanın. Numunelerin anında işlem, bazı durumlarda tercih edilebilir olsa da, bir çok uygulama için, hücre alikotları işlemden önce en fazla 8 saat süre ile buz üzerinde saklanabilir. </li><li> Pelet hücreleri 3 dakika boyunca 5 (2345 rpm / 857,5 xg) ayarlayarak bir klinik santrifüj cihazında bir 15 ml santrifüj tüpüne ve spin hücre süspansiyonu aktarın. </li&gt; <li> Pelet hücreleri kaybetmek değil orta alarak dikkat Durusu. Yavaşça 1 mi ZK tampon içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve daha sonra 40 ul 1 M ditiyotreitol (DTT) ilave edin. Yumuşak bir karıştırma ile 2 dakika kuluçkalayın. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (adım 1.2). </li><li> 1 mi ZK tamponu içinde yeniden süspanse peletler. İyice karıştırıldıktan zymolyase 100T taze hazırlanmış bir çözeltisine 5 ul ekle. Hücre duvarı çıkarın ve sferoplastlar üretilmesi için 30 ° C sıcaklıkta 20-30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Spheroplasting tam olup olmadığını belirlemek için bir mikroskop lamı üzerine hücre süspansiyonu, 10 ul damlacık testi. Bir lamel olmadan diseksiyon mikroskobu altında incelendi hücreler. Hücreler, şişirilmiş ve yuvarlak yerine hafif dikdörtgen görünür ve su 20 ul ilave edildikten sonra lize gerekir. Hücreler lize başarısız olursa, su kaynaklı lizis kolaylıkla gözlenene kadar her 10 dakikada bir, 30 ° C örnek dönmek ve yeniden deney. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (adım 1.2). </li><li> Yavaşça tekrar süspansiyon ve hücre pelet i yıkayınn, 2.5 ml soğuk MES / sorbit tamponu. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (adım 1.2). Yavaşça 300-400 ul soğuk MES / sorbitol tampon içinde hücre pelletini. Hücreler, bir kaç saat için bu aşamada buz üzerinde tutulmalıdır. </li></ol> Yayılma 2. Kromozom NOT: kromozomlar-yayılmış ya slayt veya edilecek bunun üzerine cam yüzeyler lamelleri-gerekir vaktinden önce hazırlanacak. Her slayt veya lamel suya edilmelidir ardından EtOH, sonra kurumaya bırakılır ve objektif kağıdı ile parlatılır. Kromozomlar lamelleri üzerine yayılır edilecek ise, lamel Scotch bant veya kauçuk çimento ile slayt yapıştırılmış olmalıdır. Aksi belirtilmedikçe, protokolün geri kalanı ya bir slayt veya lamel yayılmasını anlatacağız <ol><li> Temiz bir slayt yüzeyi üzerine bir P20 pipet, pipet hücre süspansiyonu 20 ul kullanılması. </li><li> P200 pipet kullanarak,% 3 PFA / sukroz çözeltisi 40 ul ve hafifçe Solutio karıştırınSchlieren hatları kayboluncaya kadar elle slayt &quot;dönen&quot; ile n. Mikroskop altında slayt yerleştirin ve hücreler odakta olduğunu onaylayın. PFA çözeltisi kullanım gününde davlumbaz taze hazırlanmış olmalıdır. NOT: İlgili protein önceden yöntemiyle incelenmiş değilse, bu proteinin tutma sabitleme koşullarına duyarlı olup olmadığını belirlemek için 2 ve% 4 PFA içeren solüsyonlar kullanarak ek slaytlar hazırlamak için tavsiye edilir. % 4 PFA / sukroz çözümü ilişkili tübülin mikrotübül görselleştirmek için arzulanır olduğu durumlarda kullanılmaktadır. yüksek sabitleyici konsantrasyon dezavantajı kromozom olacağıdır &quot;underspread,&quot;% 2 PFA aynı zamanda &quot;underspread&quot; kromozom elde etmek eğilimindedir. </li><li> P200 pipet kullanarak, tamamen mümkün olduğunca çözüm karıştırmak için önce girdap, bir zamanlayıcı başlatmak,% 1 Lipsol 80 ul ekleyin. Lipsol mevcut değilse, 80 ul% 1 NP40 ve 80 ul dH 2 O olabilir(Şekil 2 Temsilcisi Sonuçlar bakınız) ikame. </li><li> Kayıcı her 15 saniyede girdap dikkatlice ve yavaşça hücrelerin izleyin. Hücrelerin kabaca% 80&#39;i parçalanmış zaman, hemen mikroskop slaytı kaldırmak, Sayacı durdurmak PFA / sakaroz çözeltisi 80 ul ekleyin ve girdap karıştırmak için (kayboldu). Lizis zamanlayıcı başladıktan sonra 30 ila 90 sn gerçekleşmelidir. NOT: Birkaç slaytlar yaklaşık aynı zamanda lizizini göstermek ise, bir sonuçta slaytlar kalanı için mikroskobik izleme ihmal ve sadece dikkatle lipsol ve fiksatif son kısım ilave eklenmesi arasındaki süreyi zaman olabilir. Aynı örnekten birden slayt hazırlarken Ancak, bu kısa yol, sadece güvenilir. Farklı slaytlar farklı zamanlarda alınmış örneklerden veya farklı kültürlerden hazırlanır zaman mikroskobik her numunenin lizizine izlemek için en iyisidir. </li><li> Temiz, düz bir yüzey üzerine slayt yerleştirin ve tüm çözülmesi sağlandığında Surfac boyunca sıvı yaymak&quot;su birikintisi&quot; menisküs altında ama yani slayt kendisi yüzeyi üzerinde düzenlenen bir temiz, tek Mera pipet tarafı kullanarak slayt e. pipetle slayt yüzeyini &quot;komisyon&quot; yoktur. Numunelerin kirlenmesini önlemek için farklı slaytlar üzerinde pipetlemeyin tekrar kullanmayın. </li><li> Davlumbaz gece kurumaya bırakın slaytlar. Çözülmeyen nükleer bileşenler slayt yüzeyine yerleşmek ve ona bağlanacaktır. Büyük deneyler için, kurutma aşaması için alanı kullanımını planlama çok önemlidir. </li><li> Bir kez kurutulduktan sonra, en iyi sonuçlar aynı gün immün aşamasına ilerlemektedir ile elde edilir. Ancak, kurutulmuş sakaroz çözüm örneklerinin donmasını sağlayan bir &quot;bal&quot; in yayılması kromozomları gömer: slaytlar plastik slayt kutusuna aktarılır ve yıllarca -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> 3. immün <ol><li> 30 sn% 0.2 Fotoğraf-Flo Dip slaytlar. bal kaldırmak için. Yalın slaytlarBir kenar, kenar bir kağıt havlu üzerine dayayarak, rezidüel Foto-Flo kaldırın. </li><li> 5 dakika boyunca 1x TBS Dip slaytlar yıkayın. Bir kenarda slaytlar yaslanarak fazla sıvıyı çıkarın, ama onları kurumaya izin vermeyin. </li><li> Yan yukarı, pipet 300 ul TBS / BSA slayt çözülmesi sağlandığında kısmı boyunca slayt üzerine buzlu slaytlar yatırın. </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bir nem odasında inkübe edilir. (Doymuş kağıt havlu ile bir delikli metal plaka veya plastik slayt kutusunun altında suya doygun kağıt havlu ile kaplı büyük plastik kap). </li><li> Bir kağıt havlu üzerine slayt bir kısa kenarı dinlenme ve (örneğin bir test tüpü raf gibi) uygun bir destek karşısında slayt eğilerek slaytlar boşaltın. Yüzey kurumasına izin vermeyin. </li><li> Hemen birincil antikor, uygun bir seyreltme içeren TBS / BSA tamponu 80 ul uygulanır. Antikor sınırlayıcı ise, 40 ul ve 22 x 22 mm&#39;lik bir örtücü cam kullanılır. Ham tavşan serumu için, bu tipik olarak, bir 1/50 ve 1/500 seyreltme arasındadır. NOT:Yeni antikor hazırlıkları için titrasyonları gerçekleştirin. arka plan üzerinde yüksek sinyal verir en inceltilmiş hazırlık seçilir. Bağışıklık-öncesi serumu ile boyanmış olmalıdır arka plan boyama düzeyi kontrol etmek için, çekirdekler, uygun silme mutant ve / veya çift slaytlar hazırlanmalıdır. </li><li> Kabarcıklar kaçınarak slayt üzerinde cilalı 22 x 50 mm lamel yerleştirin. Kısa bir kenarına yakın pozisyonlarda uzun kenarından başparmak ve işaret parmağı arasında lamel tutarak bunu yapın. 30 ° açıyla lamel Holding sadece &quot;su birikintisi&quot; slayt buzlu bölgeye yakın kenarına iç slayt üzerinde oturana kadar parmakları kısa kenar uzak düşer, slayt. Sonra yavaş yavaş slayt dokunmatik tezgah tutan parmakları kadar pürüzsüz bir hareket lamel düşürmek ve sonra bırakın. O topraklarda bir zamanlar lamel konumunu ayarlamak için çalışmayın. NOT: kromozom yayılır hazırlanmış olsaydıyapıştırılmış lamelleri (ziyade direkt olarak slaytlar yüzey), bu örnek lamel boyama ve yıkama aşamaları boyunca slayt yapıştırılmış kalır. Ek bir lamel boyama ve daha sonra atılır boyunca eşit bir şekilde antikor çözüm dağıtmak için örnek lamel üzerine yerleştirilecektir. </li><li> Sızdırmaz şekilde kapalı bir nemli oda içinde yer slaytlar ve 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Bir cam slayt boyama rafa buzlu kenar aktarım işlemlerinin slaytları Holding ve TBS içeren bir boyama kavanoz daldırın. </li><li> Yavaşça lamel kaldırmak için yukarı ve aşağı slayt batırın. Bunu yapmak için çok fazla kuvvet kullanmaya çalışıyorum. TBS daldırarak 10 dakika 2x slaytlar yıkayın. Raftan slaytları çıkarın ve kağıt havlu kenarı dokunarak fazla sıvıyı boşaltın. Yüzey kuru izin vermeyin. </li><li> Işık altında altında çalışan hemen 80 ul TBS / BSA florokrom konjuge sekonder antikor (ya da 22 x 22 mm&#39;lik bir örtücü cam, 40 ul) içindeki bir 1 / 1,000 kat seyreltme içeren ekleyin. Ilanve daha önce olduğu gibi D lamel karanlıkta nemli oda içinde 2 saat süre ile 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> , Daha önce olduğu gibi lamelleri çıkarın slaytlar drenaj ve karanlıkta 1 ila 2 saat boyunca havada kurumaya yüzey sağlar. Daha önce olduğu gibi kağıt havlu üzerinde Yalın kayar. NOT: yayılan monte lamel gerçekleştirildi ise, kurumadan slayt lamel ayırın. Önceki adımda slaytlar için tarif edildiği gibi lameller daha sonra kurutulur. </li><li> Bastırılmış ışık altında çalışan, DAPI (üç 10 ul damlacıkları) içeren orta montaj yaklaşık 30 ul ekleyin ve sonra dikkatli bir şekilde lamel indirin. Formalar lamelleri üzerinde ise, temiz bir slayt üzerinde montaj orta damlacıkları yerleştirin ve slayt üzerine aşağı lamel, kromozom tarafını indirin. </li><li> Hala bastırılmış ışık altında, yerleşmek ve net oje ile lamel kenarları mühür için lamel için 2 dakika bekleyin. Düz slayt kutusunda slaytlar yerleştirin. NOT: STED mikroskopi için, uzatmak Gold ile monte edilir. Uzatmak Altın 30 ul kullanınve DAPI olmadan gecede tedavi için izin verir. Oje ile sızdırmazlık gereksizdir. </li><li> 40 veya 100X amacı DAPI odaklanmak için uygun ayarlanmış bir filtre kullanarak widefield Epifloresans mikroskobu ile Görünüm slaytlar. İsteğe bağlı olarak, birkaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de karanlıkta slayt saklayın. Donma yok. </li></ol>

<ol>
	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize...

tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae kromozom fonksiyonunu kontrol eden proteinlerin çalışmaya dahil olmak üzere biyolojik süreçlerin moleküler mekanizmaları, çalışmaları için birçok avantaj sunuyor. , Moleküler genetik ve biyokimyasal çalışmalar için maya tomurcuklanan iyi bilinen avantajları olmasına rağmen, hücre çekirdeğinde bulunan protein dağılımının sitolojik çalışmalar küçük boyutu karmaşıktır. Tipik bir maya çekirdeği görünür ışığın sadece yaklaşık 5 katı çözünürlük sınırı olan en az bir mikron bir çapa sahiptir. Bu nedenle, geleneksel bir immün ya da, yeşil flüoresan protein (GFP) gibi floresan proteini etiketleri kullanılarak elde edilebilir, nükleer proteinlerin dağılımı hakkında bilgi miktarı sınırlıdır. Proteinlerin çekirdek içi dağılımı karakterize için yararlı bir yaklaşım, yayılma kromozom yüzeyidir. Bu yaklaşım, hücre duvarını kaldırarak hücre ve nükleer membranlar ve a kesintiye içerirllowing çekirdeğin çözünmeyen içeriğinin bir mikroskop lamı yüzeyi üzerine yerleştirmek. Çözünmeyen bileşenler, nükleer matris ve kromozom bulunmaktadır. Kromatin bağlı proteinleri tespit etmek için yeteneğini geliştirir çözülebilen çekirdek içindeki uzaklaştırılmasını sağlayan ek olarak, bu tür yayılmış çekirdek yaklaşık 3 um ila 5 arasında çaplara sahip (diploid mayoz çekirdekleri) kromozom önemli dekompresyonu yöntem sonucu yayılan kromozom ve 2 diploid mitotik çekirdekleri ila 3 um. Bu dekompresyon sağlam çekirdekleri gidermek için nispeten zor veya imkansız nükleer alt algılanmasını sağlar. Yayılma kromozoma bariz bir eksiklik yayma işlemi ilgi yapısını bozan kısmen veya tamamen ihtimalidir. Özellikle endişe, belirli bir kromozom bağlı protein yayılan prosedürünün bir sonucu olarak kaybedilebilir olmasıdır. Bu potansiyel komplikasyon shouveri yorumlanırken ld akılda tutulmalıdır. Yayılma prosedüre karşı duyarlı olan bir proteinin bir örneği, beta-tubulin olup. Bazı koşullar altında, esas olarak tübülin oluşan mili, 3 yayılması sırasında korunur. Milin Görselleştirme genellikle ilgi çekirdeklerini sahne yararlıdır. Bununla birlikte, tubulin görselleştirme yüksek bir konsantrasyon sabitleyici tedavi gerektiren; iğ, aşağıda tarif edilen standart koşullar altında kaybolur. Bu örnek, daha önce uncharacterized proteinin dağılımını analiz ederken, bu proteinin böyle varyasyon ne kadar duyarlı belirlemek için sabitleştirici konsantrasyonunu değişir önemli olduğunu göstermektedir. Kromozom yapısına yayılan koşulların etkilerine ilişkin endişe rağmen, yayılma yöntemi yarar ve güç pek çok bağlamda gösterdiler ve mitoz karakterizasyonu ve özellikle mayotik hücreleri 4-7 geniş yarar sahiptir. Two yayma yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Dresser ve Giroux&#39;nun 8 tarafından geliştirilen bu yöntem, ilk olarak, deterjan kullanımını önler ve DNA spesifik boya DAPI lekeli göreceli olarak iyi korunmuş morfolojisinin sahip gibi görünmektedir yayılmış preparatları elde edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem, mükemmel nispeten zordur ve bir sürgünün bir bölge, diğer bölgelere kıyasla zaman yayılmış çekirdeğin kalitesi, önemli ölçüde değişir. Bu sorun veri toplama önyargı önlemek için, bir slayt birçok seçilmemiş çekirdekleri görüntüleme içeren kantitatif yaklaşımların karmaşık hale getirebilir. Loidl ve Klein 1 tarafından geliştirilen yöntem yayılan ikinci kromozom, lizis ve deterjan çözeltisi tarafından teşvik kromatin dekompresyon ile, paraformaldehid ile fiksasyon dengeleme içerir. Düzgün yapıldığında, bu yöntem Dresser ve Giroux yöntemine göre daha az bölge için bölge varyasyon ile çok tekrarlanabilir sonuçlar verir. Bu sunum, bir tadil odaklanırnedeniyle güvenilirliğe ve sadeliğe sahip Loidl ve Klein yöntemine d versiyonu. Kromozom yayma karmaşık ya da zaman alıcı değildir; 100&#39;e kadar slaytlar tek bir gün içinde immün için hazırlanmış olabilir. Ayrıca, yayılma hazırlıkları öncesinde immün yıllarda dondurucuda saklanabilir ve böylece laboratuarları yeni biyolojik sorular ortaya ya da yeni boyama reaktifleri kullanılabilir hale kullanılabilen donmuş kromozom yayılır bir depo gelişebilir. kromozom yayma yöntemi en sık immün ve widefield floresan mikroskobu ile birlikte kullanılır, ancak bu tür uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi olarak süper çözünürlüklü ışık mikroskobu yöntemleri için slaytlar hazırlamak da mümkündür olduğunu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>US Biological&#160;</td>
			<td>Z1004</td>
			<td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&#176;C until ready for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipsol&#160;</td>
			<td>L.I.P. Ltd&#160;</td>
			<td>no longer commercially available</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard coverslip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-E or 12-540-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>P-7417</td>
			<td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&#176;C for up to a month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector 
			Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-1</td>
			<td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&#176;C. Also, use as a wet chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-816</td>
			<td>Use as a wash basin for slides.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

yayılmış çekirdeklerinin görünümü eleştirel kromozom tespit ve de-sıkıştırma arasındaki dengeye bağlıdır. Reaktifler düzgün dengeli bile, kromozom de-sıkıştırma derecesi değişim ve / veya farklı slaytlar arasında aynı slayt değişik bölgelerinde meydana gelebilir. Görüntüleri yorumlanır önce Böylece, bir slayt belirli bir bölgedeki formaların kalitesi değerlendirilmelidir. &quot;overspreading&quot; ve &quot;underspreading&quot; etkileri öz değişmesin...

Watch this Scientific Journal Video about Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes at JoVE.com

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Research

JoVE Journal

Biology

9.8K Görüntüleme.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Video: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Biyoloji

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...